申 勇，孫偉莉，袁 超，徐慧琴，劉 斌

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，安徽合肥 230022；2．蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，安徽蚌埠 233004；3．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，安徽合肥 230022）

99mTc-MIBI評價(jià)2-脫氧-D-葡萄糖對鼻咽癌耐藥株
多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制

申 勇1，2，孫偉莉2，袁 超2，徐慧琴3，劉 斌1

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，安徽合肥 230022；2．蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，安徽蚌埠 233004；3．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，安徽合肥 230022）

中國圖書分類號：R329．25；R739．630．22；R979.1；R977.6

摘要：目的 探討2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）對鼻咽癌順鉑耐藥株細(xì)胞（HNE-1／DDP）多藥耐藥（MDR）的逆轉(zhuǎn)機(jī)制，觀察99m锝-甲氧基異丁基異腈（99mtechnetium-methoxyisobutyli-sonitrile，99mTc-MIBI）細(xì)胞內(nèi)的攝取變化，評價(jià)2-DG逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的效果。方法 γ計(jì)數(shù)器檢測不同濃度2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI的攝取清除情況以及2-DG濃度為10 mmol·L－1時(shí)HNE-1及HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI的攝取清除情況。測定2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)ATP值。Western blot檢測2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)P糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）表達(dá)。溴化丙啶（PI）單染檢測順鉑（DDP）單獨(dú)及聯(lián)合2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI的清除率為54.8%，高于HNE-1細(xì)胞的清除率－41.3%（P＜0.01），2-DG（10 mmol·L－1）作用后HNE-1／DDP細(xì)胞的清除率為－203.7%，較前明顯降低（P＜0.01）。HNE-1／DDP細(xì)胞在2-DG作用下ATP值為對照組的55.69%，且P-gp、MRP蛋白表達(dá)較對照組減少。DDP聯(lián)合2-DG（10 mmol·L－1）作用24 h后HNE-1／DDP細(xì)胞凋亡率為49.4%，高于單獨(dú)使用DDP時(shí)HNE-1／DDP細(xì)胞的凋亡率（22.5%）。結(jié)論99mTc-MIBI可有效檢測HNE-1／DDP細(xì)胞多藥耐藥現(xiàn)象及評價(jià)2-DG的逆轉(zhuǎn)效果，2-DG逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)ATP生成抑制及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)減少有關(guān)。

關(guān)鍵詞：多藥耐藥；99mTc-MIBI；2-脫氧-D-葡萄糖；鼻咽癌；逆轉(zhuǎn)；P糖蛋白；多藥耐藥相關(guān)蛋白

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．042．html

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，如何逆轉(zhuǎn)MDR現(xiàn)象以及尋找合適的逆轉(zhuǎn)劑是目前研究的熱點(diǎn)。MDR現(xiàn)象具有廣譜耐藥特性，能夠?qū)υS多結(jié)構(gòu)、功能各異的細(xì)胞毒性藥物產(chǎn)生交叉抵抗。MDR的機(jī)制較為復(fù)雜，涉及DNA修復(fù)缺陷、相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增強(qiáng)、凋亡逃避、藥物靶點(diǎn)改變、細(xì)胞黏附等多種因素［1］。目前認(rèn)為，ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的最主要機(jī)制［2］。相關(guān)蛋白包括P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associ-ated proteins，MRP）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等。

99m锝-甲氧基異丁基異腈（99mtechnetium-me-thoxyisobutylisonitrile，99mTc-MIBI）常用在核心臟病學(xué)中，以及乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、淋巴瘤等惡性腫瘤的探測。99mTc-MIBI是一種脂溶性陽離子放射性藥物，能夠通過被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜，并以膜電位差為動力濃聚于線粒體內(nèi)膜。惡性腫瘤細(xì)胞因代謝旺盛、線粒體豐富、具有較高的負(fù)跨膜電勢能夠大量攝取。此外，99mTc-MIBI的攝取及清除與腫瘤細(xì)胞的MDR現(xiàn)象有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道99mTc-MIBI能夠用來檢測腫瘤細(xì)胞的耐藥情況，99mTc-MIBI在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的動力學(xué)變化可以評價(jià)MDR現(xiàn)象［3］。

2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）因具有抗腫瘤作用而被廣泛關(guān)注。2-DG不僅能夠抑制腫瘤糖酵解、影響蛋白質(zhì)糖基化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，并且具有放、化療增敏作用［4］。但2-DG作為MDR現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)劑卻鮮見報(bào)道，本研究通過觀察99mTc-MIBI在腫瘤細(xì)胞內(nèi)攝取清除變化檢測腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象以及評價(jià)2-DG對于HNE-1／DDP細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)效果，探討其逆轉(zhuǎn)機(jī)制為臨床提高輔助化療療效提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料 HNE-1細(xì)胞（鼻咽低分化鱗癌）及HNE-1／DDP耐藥株由湖南湘雅醫(yī)院提供。RPMI

1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Gibco公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），2-DG、DDP、P-gp 及MRP檢測試劑盒（美國Sigma公司），ATP檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），鼠抗人MRP及β-actin單抗（美國Santa Cruz公司），鼠抗人P-gp單抗（美國Millipore公司）。流式細(xì)胞儀Accuri C6（美國BD公司）、GC-300 γ計(jì)數(shù)器（科大創(chuàng)新中佳分公司）、Mini-Prote電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。MIBI配體（北京師宏藥業(yè)提供）用新淋洗的99mTcO4洗脫液標(biāo)記，放射化學(xué)純度≥95%。

1．2細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇HNE-1細(xì)胞及HNE-1／DDP耐藥株細(xì)胞，HNE-1細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，HNE-1／DDP耐藥株細(xì)胞使用RPMI 1640培養(yǎng)液＋DDP（50 μg·L－1），置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代。

1．3不同濃度2-DG條件下HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI攝取清除實(shí)驗(yàn) 含10%胎牛血清＋DDP（50 μg·L－1）的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整HNE-1／DDP細(xì)胞濃度為每孔7×103個(gè)細(xì)胞，以每孔100 μL接種于2組96孔板中，培育24 h，細(xì)胞貼壁后棄去上清液，加入終濃度分別為1、2、5、10、20 mmol· L－1的2-DG的培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培育2 h。然后加入含有99mTc-MIBI（放射性濃度370 MBq·L－1）的培養(yǎng)液100 μL，培育20 min（早期）及120 min（延遲）后分別取出一組96孔板，棄去含有99mTc-MIBI的培養(yǎng)液，用4℃冰生理鹽水快速清洗3次，加入含0.25%的胰酶消化收集細(xì)胞，以1 100 r·min－1離心5 min，棄去上清液，用冰PBS液洗滌后重復(fù)離心，共計(jì)2遍，最后得到沉淀細(xì)胞使用γ計(jì)數(shù)器檢測其放射性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)及各濃度組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，設(shè)3個(gè)對照孔（接種等量細(xì)胞及培養(yǎng)液，不加2-DG），并設(shè)3個(gè)空白孔（不接種細(xì)胞，只加入等量培養(yǎng)液）作為本底，結(jié)果取平均值。按下述公式計(jì)算99mTc-MIBI攝取清除率：清除率／%＝（早期99mTc-MIBI放射性計(jì)數(shù)－延遲99mTc-MIBI放射性計(jì)數(shù)）／早期99mTc-MIBI放射性計(jì)數(shù)×100%。

1．4HNE-1及HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI攝取清除實(shí)驗(yàn) 上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)加入終濃度為10 mmol ·L－1的2-DG作用后HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MI-BI的清除率最低，因此本組以10 mmol·L－1為實(shí)驗(yàn)條件以驗(yàn)證2-DG對HNE-1及HNE-1／DDP細(xì)胞的作用。用RPMI 1640培養(yǎng)液和RPMI 1640＋DDP培養(yǎng)液分別調(diào)整HNE-1和HNE-1／DDP細(xì)胞濃度為每孔104個(gè)細(xì)胞，以每孔100 μL接種于2組96孔板中培育24h，細(xì)胞貼壁后棄去上清液，將HNE-1和HNE-1／DDP細(xì)胞分為2組，一組為對照組加入培養(yǎng)液100 μL（不含2-DG），另一組為實(shí)驗(yàn)組加入含終濃度為10 mmol·L－12-DG的培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，再按前實(shí)驗(yàn)方法檢測加入99mTc-MIBI后HNE-1及HNE-1／DDP細(xì)胞在20 min（早期）及120 min（延遲）的攝取清除情況。每實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均設(shè)重復(fù)孔3組，并設(shè)對照孔及空白孔各3組。

1．5細(xì)胞內(nèi)ATP檢測 將HNE-1／DDP細(xì)胞接種于6孔板中（每孔4×105個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)24 h，加入含2-DG（10 mmol·L－1）培養(yǎng)液并設(shè)陰性對照組，每組3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培育5 h后收集細(xì)胞，離心后棄上清液，每孔細(xì)胞加入200 μL裂解液。裂解后4℃12 000 r·min－1離心5 min，取上清用于后續(xù)測定（冰上操作）。在檢測孔中加入ATP檢測工作液（1 ∶100），每孔100 μL，室溫放置5 min，使本底性ATP全部消耗（避光操作）。每孔加100 μL樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，2 s后立即用酶標(biāo)儀檢測Rlu值。

1．6Western blot檢測P-gp、MRP蛋白表達(dá)HNE-1／DDP細(xì)胞接種于6孔板中（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)24 h，加入2-DG（10 mmol·L－1）后繼續(xù)培養(yǎng)16 h，消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗2次，加入預(yù)冷的蛋白裂解液（20 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.5，150 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA，1 mmol· L－1EGTA，1 mmol·L－1原礬酸鈉，1 mmol·L－1PMSF，體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100，2.5 mmol· L－1焦磷酸鈉，40 mmol·L－1β-甘油磷酸，10 mg· L－1的亮肽素、抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，95℃煮沸5 min蛋白變性，每組取50 μg蛋白，SDS-PAGE電泳（70 V，400 mA，50 W，30 min；90 V，400 mA，50 W，90 min）；轉(zhuǎn)膜（50 V，250 mA，50 W，150 min）至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉4 h；一抗室溫孵育4℃過夜；TPBS洗膜3次／5 min；二抗室溫孵育2 h；TPBS洗膜3次／5 min；ECL發(fā)光試劑盒顯影；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1．7溴化丙啶（PI）染色檢測HNE-1／DDP細(xì)胞的凋亡情況 將HNE-1／DDP細(xì)胞接種于12孔板中（每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)24 h，分別加入DDP （1.5 mg·L－1）、2-DG（10 mmol·L－1）以及DDP＋2-DG，并設(shè)陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化收集細(xì)胞，1 000 r·min－1離心5 min，棄去培養(yǎng)液，1 mL

PBS洗滌1次，離心去PBS，加入冰預(yù)冷的75%的乙醇固定，4℃過夜，離心棄去固定液，1 mL PBS重懸5 min，1 000 r·min－1離心5 min后棄去PBS，用600 μL PI染液染色，4℃避光2～4 h后上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2．1不同濃度2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI的清除率 通過γ計(jì)數(shù)器檢測后結(jié)果顯示（Tab 1），20 min時(shí)（早期）不同濃度的2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI攝取的cpm值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），120 min時(shí)（延遲）1、2、5、10、20 mmol·L－1濃度組的HNE-1／DDP細(xì)胞攝取的cpm值與對照組（0濃度組）cpm值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。計(jì)算清除率后結(jié)果表明，隨著2-DG濃度的升高，99mTc-MIBI的清除率呈降低趨勢，且2-DG濃度為10 mmol·L－1時(shí)，清除率達(dá)到最低。此外2-DG濃度為20 mmol·L－1時(shí)，并沒有繼續(xù)降低其清除率。因此，選擇10 mmol·L－1為條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2．210mmol·L－1的2-DG作用下HNE-1及HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI的清除率 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（Tab 2），對照組及實(shí)驗(yàn)組HNE-1、HNE-1／DDP細(xì)胞在20 min時(shí)（早期）對99mTc-MIBI攝取的cpm值均無明顯差異（P＝0.87，P＝0.95）。120 min時(shí)（延遲）對照組中HNE-1／DDP細(xì)胞的cpm值明顯低于HNE-1細(xì)胞（P＝0.001），說明該細(xì)胞對99mTc-MIBI具有較強(qiáng)的“泵出”作用。2-DG（10 mmol·L-1）作用120 min后（延遲）實(shí)驗(yàn)組HNE-1／ DDP細(xì)胞的cpm值高于HNE-1細(xì)胞（P＝0．03）及對照組HNE-1／DDP細(xì)胞（P＝0.003），顯示出2-DG作用后該細(xì)胞增強(qiáng)了對99mTc-MIBI的滯留作用。清除率結(jié)果也表明，對照組HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI的清除率為54.8%，高于HNE-1細(xì)胞的清除率－41．3%（P＜0.01），2-DG作用后實(shí)驗(yàn)組HNE-1／DDP細(xì)胞的清除率為－203.7%，較前明顯降低（P ＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2-DG可以提高HNE-1／DDP細(xì)胞對99mTc-MIBI的攝取，使其清除率處于低值，表現(xiàn)出較明顯的增強(qiáng)99mTc-MIBI在細(xì)胞內(nèi)滯留的作用；此現(xiàn)象在HNE-1敏感株細(xì)胞中表現(xiàn)不明顯，其攝取值在2-DG作用前后無明顯差異（P＝0.23）。

2．32-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)ATP生成量減少 視對照組細(xì)胞ATP生成量為100%，實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)除以對照組后結(jié)果為55．69%，結(jié)果見Fig 1。經(jīng)2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞中ATP生成量明顯少于對照組，表明2-DG能夠抑制HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)ATP的生成。

Fig 1 ATP levels in HNE-1／DDP cell after treated with 2-DG（10 mmol·L－1）

Tab 1 Radioactive counts and clearance rates of99mTc-MIBI in HNE-1／DDP cells after treated with 2-DG of different concentrations（±s，n＝3）

Tab 1 Radioactive counts and clearance rates of99mTc-MIBI in HNE-1／DDP cells after treated with 2-DG of different concentrations（±s，n＝3）

P＜0.01 vs control

Radioactive count／cpm Dose／mmol·L－1Control　1　2　5　10　20 20 min　961．3±111．5　822±71．6　789．3±76．8　820．7±73．8　841．3±104．6　865．3±93．0 120 min　721．3±121．5　1627．3±39．0　1494±32．9　1647．3±24．6　2020．6±65．1　2021．3±76．1Clearance rate／%　16．3?。?8?。?9．3　－100．7?。?40．1－133．6

Tab 2 Radioactive counts and clearance rates of99mTc-MIBI in HNE-1 and HNE-1／DDP cells after treated with 2-DG（10 mmol·L－1）（±s，n＝3）

Tab 2 Radioactive counts and clearance rates of99mTc-MIBI in HNE-1 and HNE-1／DDP cells after treated with 2-DG（10 mmol·L－1）（±s，n＝3）

P＜0.01 vs control；ΔP＜0.05 vs HNE-1＋2-DG

Radioactive count／cpm Group HNE-1　HNE-1＋2-DG　HNE-1／DDP　HNE-1／DDP＋2-DG 20 min　978．7±112．6　679．3±70．4　958．0±173．5　682．7±55．1 120 min　1383．0±191．3　1154．0±201．9　432．7±74．0　2073．3±438．9ΔClearance rate／%?。?1．3　－69．9　54．8?。?03．7

2．42-DG對HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)P-gp、MRP蛋白表達(dá)的影響 HNE-1／DDP細(xì)胞在2-DG作用16 h后收集蛋白，Western blot檢測P-gp、MRP蛋白表達(dá)，結(jié)果見Fig 2。2-DG作用后HNE-1／DDP細(xì)胞P-gp、MRP蛋白表達(dá)與對照組相比有所降低。

Fig 2 Effect of 2-DG on protein expression of P-gp，MRP in HNE-1／DDP cell

2．5DDP聯(lián)合2-DG增強(qiáng)HNE-1／DDP細(xì)胞的凋亡 不同因素處理后的細(xì)胞進(jìn)行PI染色并流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果提示，對照組及2-DG組24 h細(xì)胞凋亡率分別為5.9%、6.4%。DDP聯(lián)合2-DG作用24 h后HNE-1／DDP細(xì)胞凋亡率為49.4%，高于單獨(dú)使用DDP時(shí)誘導(dǎo)HNE-1／DDP細(xì)胞的凋亡率22.5%，見Fig 3。

3　討論

2-DG的抗腫瘤作用在國內(nèi)外研究較多，主要涉及靶向糖酵解途徑以“餓死”腫瘤細(xì)胞、影響細(xì)胞內(nèi)信號通路、抑制蛋白糖基化等方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)化療藥物或聯(lián)合腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、下調(diào)抑制細(xì)胞凋亡蛋白、抑制腫瘤生長因子等途徑達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［5－6］。但上述方案可能會引起腫瘤細(xì)胞代謝途徑變化、誘導(dǎo)時(shí)間過長、大劑量限值造成不良反應(yīng)等問題，以至于2-DG臨床使用受限［7］。本研究通過檢測99mTc-MIBI在細(xì)胞內(nèi)的動力學(xué)變化，驗(yàn)證2-DG作為逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)用后能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR現(xiàn)象及增強(qiáng)化療療效的作用。

99mTc-MIBI被證實(shí)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)能夠作為P-gp及MRP的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，可以像化療藥物一樣被泵出細(xì)胞外［8－9］。本研究發(fā)現(xiàn)，99mTc-MIBI在耐藥株HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)的清除率明顯高于敏感株HNE-1細(xì)胞，且HNE-1／DDP細(xì)胞延遲期對99mTc-MIBI攝取的cpm值明顯低于早期攝取值，表明腫瘤細(xì)胞對99mTc-MIBI具有“泵出”作用，使其不能滯留于細(xì)胞內(nèi)，上述現(xiàn)象的發(fā)生可能與耐藥株細(xì)胞P-gp及MRP等相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能有關(guān)。因此，99mTc-MIBI在腫瘤耐藥細(xì)胞內(nèi)的動力學(xué)變化可以評價(jià)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。應(yīng)用2-DG處理后，發(fā)現(xiàn)99mTc-MIBI在HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)的攝取值明顯高于未用2-DG處理的對照組，證實(shí)2-DG能夠增強(qiáng)99mTc-MIBI在耐藥株細(xì)胞內(nèi)的滯留，使其對99mTc-MIBI的“泵出”作用明顯減弱。此現(xiàn)象在相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)較少的敏感株細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)不明顯，其攝取值在2-DG處理后差異無顯著性（P＞0.05）。因此，2-DG對P-gp及MRP等相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的影響可能是造成99mTc-MIBI在細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)改變的原因。

Fig 3 Relative cell number of HNE-1／DDP apoptosis after treated with 2-DG，DDP and 2-DG combination with DDP

依賴ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員介導(dǎo)的藥物外排是腫瘤MDR現(xiàn)象發(fā)生的主要機(jī)制。此類蛋白共同特點(diǎn)是具有ATP結(jié)合域，通過水解ATP獲得能量將藥物泵出細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞具有高葡萄糖消耗及糖酵解增強(qiáng)的特點(diǎn)，2-DG作為天然葡萄糖的類似物可以被腫瘤細(xì)胞高度攝取，通過己糖激酶代謝為6-磷酸-2-脫氧葡萄糖后不能進(jìn)一步代謝氧化，滯留于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的同時(shí)消耗大量己糖激酶，造成細(xì)胞內(nèi)“ATP”生成減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量缺失［10］。本研究中，ATP檢測結(jié)果顯示，2-DG作用下HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)ATP值明顯低于對照組，Western blot檢測證實(shí)2-DG作用下P-gp、MRP蛋白表達(dá)量較對照組有所減少，結(jié)合99mTc-MIBI細(xì)胞內(nèi)攝取清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測2-DG可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)ATP生成、減少相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制P-gp及MRP蛋白的“泵出”功能，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)運(yùn)底物99mTc-MIBI在細(xì)胞內(nèi)滯留。有文獻(xiàn)報(bào)道，99mTc-MIBI能夠用于檢測腫瘤細(xì)胞多藥耐藥及評價(jià)逆轉(zhuǎn)劑的逆轉(zhuǎn)效果，同時(shí)99mTc-MIBI顯像也可用于檢測體內(nèi)腫瘤MDR現(xiàn)

象及評價(jià)腫瘤化療療效［3，11－12］。本研究通過99mTc-MIBI在細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)變化，證實(shí)2-DG作用后HNE-1／DDP細(xì)胞內(nèi)對99mTc-MIBI的滯留作用明顯增強(qiáng)，說明2-DG對該細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的逆轉(zhuǎn)效果，并以此推論，同是P-gp及MRP轉(zhuǎn)運(yùn)底物的一些化療藥物在2-DG的作用下，可以提高細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，增強(qiáng)化療療效。此外，前實(shí)驗(yàn)也證實(shí)隨著2-DG濃度逐漸升高，99mTc-MIBI在細(xì)胞內(nèi)的清除率呈降低趨勢，但濃度為20 mmol·L-1時(shí)，并沒有繼續(xù)降低其清除率，說明2-DG濃度進(jìn)一步升高不能持續(xù)增強(qiáng)99mTc-MIBI在細(xì)胞內(nèi)的滯留作用，原因可能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量或2-DG對腫瘤細(xì)胞ATP生成抑制達(dá)到限值相關(guān)，提示2-DG在較低劑量即可達(dá)到理想的逆轉(zhuǎn)效果。

鼻咽癌因發(fā)病隱蔽多數(shù)患者就診時(shí)處于晚期，采用單純放療其5年生存率約10～40%［13］，因此對晚期鼻咽癌患者多采取同期放療加輔助化療［14］。臨床應(yīng)用順鉑聯(lián)合紫衫醇類、氟尿嘧啶、吉西他濱等藥物證實(shí)對晚期鼻咽癌患者有效［15］。然而因MDR現(xiàn)象的存在，使病情不能持續(xù)緩解，往往會導(dǎo)致治療失敗。本研究進(jìn)一步借助溴化丙啶（PI）染色實(shí)驗(yàn)檢測不同因素處理后HNE-1／DDP細(xì)胞的凋亡情況，驗(yàn)證2-DG作為逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)合化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DDP聯(lián)合2-DG處理后HNE-1／DDP細(xì)胞凋亡率高于其他對照組。目前為止，尋找合適的逆轉(zhuǎn)劑一直是研究熱點(diǎn)。2-DG作為腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑具有以下優(yōu)勢：（1）大多數(shù)惡性腫瘤對2-DG大量攝取。18氟-脫氧葡萄糖（18F-DG）PET顯像證實(shí)大多數(shù)惡性腫瘤能夠大量攝取并滯留18F-DG［16］。（2）2-DG逆轉(zhuǎn)效果明確、作用迅速，實(shí)驗(yàn)證實(shí)2-DG作用240 min后即可明顯提高99mTc-MIBI細(xì)胞內(nèi)的攝取值，降低清除率。（3）2-DG為葡萄糖的無毒類似物，體內(nèi)代謝較快，不會造成體內(nèi)蓄積［7］。（4）逆轉(zhuǎn)作用廣泛，有可能對大多數(shù)依賴ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物藥物均可產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用（需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）。（5）2-DG本身具有抗腫瘤的協(xié)同作用。

綜上所述，利用99mTc-MIBI細(xì)胞內(nèi)攝取清除實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞MDR現(xiàn)象以及逆轉(zhuǎn)劑介入后效果評價(jià)，發(fā)現(xiàn)2-DG對HNE-1／DDP細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的逆轉(zhuǎn)效果，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)ATP生成抑制及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)減少有關(guān)。2-DG作為逆轉(zhuǎn)劑，具有腫瘤細(xì)胞高攝取、無毒等優(yōu)勢，聯(lián)合化療藥物可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。此外，99mTc-MIBI顯像已用于體內(nèi)腫瘤多藥耐藥的檢測及療效評價(jià)，可通過小鼠或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證2-DG的逆轉(zhuǎn)效果。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)通過蚌埠醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室、蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心及生化藥理實(shí)驗(yàn)室共同完成，在此表示由衷的感謝。）

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Evaluation of reversal effect of 2-DG on multidrug resistance by detecting uptake of99mTc-MIBI in HNE-1／DDP cells

SHEN Yong1，2，SUN Wei-li2，YUAN Chao2，XU Hui-qin3，LIU Bin1
（1．Dept of Radiology，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China；2．Dept of Nuclear Medicine，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233004，China；3．Dept of Nuclear Medicine，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China）

Abstract：Aim To evaluate the reversal effect of 2-deoxy-D-glucose（2-DG）on multidrug resistance （MDR）by observing the uptake change of99mTc-MIBI in HNE-1／DDP cells，and to explore its mechanism．Methods The uptake of99mTc-MIBI in HNE-1／DDP cells under different concentrations of 2-DG was detec-ted by γ-counter，and the clearance rates of99mTc-MI-BI in HNE-1 cells and HNE-1／DDP cells after treated with 2-DG（10 mmol·L－1）were compared．The con-tent of ATP in HNE-1／DDP cells was detected after treated with 2-DG．P-glycoprotein（P-gp）and multi-drug resistance-associated proteins（MRP）expression were measured by Western blot．Apoptotic HNE-1／DDP cells treated with DDP alone or combined with 2-DG（10 mmol·L－1）were detected by propidium io-dide（PI）staining．Results The clearance rate of99mTc-MIBI in HNE-1／DDP cells was 54.8%，which was significantly higher than that（－41.3%）in HNE-1 cells（P＜0.01）．The clearance rate of99mTc- MIBI in HNE-1／DDP cells was－203.7%after treat-ment with 2-DG（10 mmol·L－1），which could be significantly reduced compared with the control group （P＜0.01）．The level of ATP was 55．69%compared with the negative control group and the expression of P-gp and MRP protein decreased dramatically in HNE-1／DDP．With the combination of 2-DG and DDP，the ap-optotic rate of HNE-1／DDP cells reached 49．4% which was significantly higher than DDP treated group （22.5%）．Conclusion Multidrug resistance and the reversal effect of 2-DG on multidrug resistance could be evaluated effectively by detecting the uptake change of99mTc-MIBI in HNE-1／DDP cells．The mechanism may be related with the inhibition of ATP level and the re-duced expression of P-gp and MRP protein in cancer cells．

Key words：multidrug resistance；99mTc-MIBI；2-de-oxy-D-glucose；nasopharyngeal carcinoma；reversal；P-gp；MRP

作者簡介：申 勇（1978－），男，碩士生，主治醫(yī)師，研究方向：分子核醫(yī)學(xué)及放射性藥物，E-mail：shenyong111＠sina．com；劉 斌（1962－），男，碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：影像診斷，通訊作者，E-mail：lbhyz321＠126．com；徐慧琴（1965－），女，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：核醫(yī)學(xué)分子影像，通訊作者，E-mial：hfxuhuiqin ＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81371587）；安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（No KJ2015B071by）

收稿日期：2015－05－07，修回日期：2015－08－23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1433－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．021