丁海華，邱原野，王盈盈，倪偉建，2，唐麗琴，2，魏 偉

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽合肥 230032；2．安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，安徽合肥 230001）

小檗堿對糖尿病腎病大鼠nephrin、podocin和α3β1整合素表達(dá)的影響

丁海華1，邱原野1，王盈盈1，倪偉建1，2，唐麗琴1，2，魏 偉1

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽合肥 230032；2．安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，安徽合肥 230001）

中國圖書分類號：R-332；R282.71；R322.61；R329.24；R341；R587.1；R692.39

摘要：目的 觀察小檗堿對糖尿病腎病大鼠腎臟足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin和α3β1整合素蛋白表達(dá)的影響，探討小檗堿對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及部分機(jī)制。方法 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周，聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠模型。隨機(jī)分為正常對照組、模型組、3個不同劑量（50、100和200 mg·kg－1）小檗堿給藥組和依那普利陽性藥對照組（1 mg·kg－1）。分別采用免疫組織化學(xué)法，油鏡（×1 000倍）和高倍鏡（×400倍）和Western blot法，觀察和檢測腎臟足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素的分布和表達(dá)水平。結(jié)果 足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素蛋白主要分布于足細(xì)胞，但分布位置略有差異；與正常對照組相比，模型組大鼠的足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素的表達(dá)水平明顯降低；與模型組相比，小檗堿（100和200 mg·kg－1）給藥組明顯改善糖尿病腎病大鼠腎臟形態(tài)學(xué)異常，上調(diào)足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素的表達(dá)水平。結(jié)論

小檗堿可以緩解糖尿病腎病大鼠腎臟病理異常改變及蛋白尿的產(chǎn)生，這可能與其上調(diào)足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin及整合素α3β1的表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：小檗堿；糖尿病腎??；足細(xì)胞；nephrin；podocin；α3β1整合素；腎臟保護(hù)作用

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．036．html

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病引起的嚴(yán)重和危害性最大的微血管并發(fā)癥之一，也是造成終末期腎衰的主要原因之一。DN的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其確切的機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，到2015年，世界范圍內(nèi)的糖尿病的人數(shù)可能會達(dá)到30億，據(jù)估計大約20%的糖尿病患者會發(fā)展成為DN［1］。DN的主要特點是糖代謝異常引起的腎小球過度肥大、系膜增生、基底膜增厚，其主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿排泄增加和尿蛋白含量超標(biāo)，從微量蛋白尿漸進(jìn)增至大量蛋白尿，蛋白尿也是加重腎臟損傷的重要危險因素之一。足細(xì)胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，主要通過足突黏附于腎小球基底膜，與內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜共同維持正常的腎小球濾過功能。足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能的完整性遭到破壞都會導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生，此外，大量研究表明，足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的裂孔隔膜蛋白分子如nephrin、podocin等及黏附分子α3β1整合素表達(dá)水平改變是足細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，與DN的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

小檗堿（berberine，BBR），別稱為黃連素，是一種常見的異喹啉生物堿，現(xiàn)用于治療腸道感染，可以從毛茛科植物黃連干燥根狀莖和黃柏皮中提取而得到。研究表明，BBR除了作為植物抗菌素用于抗菌使用外，還具有降低升高的血糖水平，調(diào)節(jié)血脂水平，減輕炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗和提高胰島素活性等作用［3］，這表明BBR對預(yù)防和治療糖尿病及其他并發(fā)癥方面具有重要的臨床價值和潛在的應(yīng)用前景。課題組前期研究表明，BBR給藥能明顯降低DN大鼠血糖、血肌酐、尿素氮、尿肌酐和尿蛋白總量的水平；模型組大鼠腎臟組織出現(xiàn)腎小球過度肥大、系膜增生、腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和腎小球硬化等征象，同時，不同劑量BBR給藥后觀察發(fā)現(xiàn)，BBR給藥組能明顯改善腎臟病理異常變化，明顯改善腎臟過度肥大和腎臟纖維化狀態(tài)［5］，此外，也有實驗證明，BBR可通過抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖能力，降低IV型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)水平來發(fā)揮對DN的保護(hù)作用［4］，但是BBR對足細(xì)胞相關(guān)蛋

白nephrin、podocin和α3β1整合素的表達(dá)的影響研究較少。本文旨在通過觀察腎臟組織中nephrin和podocin和α3β1整合素在DN大鼠足細(xì)胞表達(dá)的變化情況，探討B(tài)BR對DN腎臟足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動物 清潔級♂SD大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量為（180±20）g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號是：皖醫(yī)動第028號。

1．1．2藥物和試劑 普通飼料及高糖高脂飼料（配制單位：安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，高糖高脂飼料配方為：基礎(chǔ)飼料64%，豬油8%，蛋黃粉10%，蔗糖18%，膽酸鈉1%）；STZ（美國Sigma公司S0130）；BBR（配制單位：安徽省立醫(yī)院藥學(xué)實驗室，含量大于96.5%）；依那普利（批號：014100701，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司）；兔抗nephrin多克隆抗體（批號：140629，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔抗podocin多克隆抗體（批號：L0913，美國Santa Cruz Biotechnology）；兔抗整合素α3β1多克隆抗體（批號：YSLE27W，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；免疫組化SP-9000通用型SP檢測試劑盒（批號：WP142407，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；免疫組化DAB顯色試劑盒（批號：K145213B，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；免疫組化Harris蘇木精染液（批號：140521，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒（批號：PI207497，Thermo scientific）；RIPA裂解液（P00138）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（批號：P0015，碧云天公司）

1．2方法

1．2．1DN大鼠模型的制備 清潔級♂SD大鼠，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，換用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)6周，誘發(fā)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗。禁食不禁水12 h后，按體重35 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射STZ誘導(dǎo)建立模型大鼠，72h后尾靜脈取血測定空腹血糖。

1．2．2動物分組及處理 腹腔注射STZ 72 h后，測定的空腹血糖值≥11.1 mmol·L－1的SD大鼠視為造模成功，然后隨機(jī)分為5組，分別為：模型組、BBR（50、100和200 mg·kg－1）給藥組和依那普利組陽性藥對照組（1 mg·kg－1），每組10只，繼續(xù)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周。另外設(shè)正常對照組（NC），用普通飼料喂養(yǎng)。造模成功后1周，各給藥組灌胃分別給以不同劑量小檗堿和依那普利陽性藥，正常組和模型組給以等量溶媒（0．5%CMC-Na）灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

2　指標(biāo)收集及檢測

2．1免疫組織化學(xué)法觀察腎臟足細(xì)胞特征蛋白nephrin、podocin和α3β1整合素分布和表達(dá)情況灌胃給藥8周結(jié)束后，取出大鼠腎臟，置于4%中性甲醛緩沖溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟、水化、組織抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性氧化物酶20 min，再滴加5%山羊血清封閉，室溫孵育20 min；滴加一抗（兔抗nephrin、podocin 和α3β1整合素多克隆抗體），4℃過夜；37℃復(fù)溫20 min；PBS沖洗；滴加生物素化通用型二抗工作液室溫孵育30 min；PBS沖洗后，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃烘箱內(nèi)孵育30 min；用PBS沖洗3次，然后用DAB染液顯色15 s，蘇木精染液復(fù)染50 s，再進(jìn)行常規(guī)脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，先用油鏡觀察各組大鼠腎臟組織nephrin、podocin和α3β1整合素的表達(dá)分布情況（×1 000倍）。陽染呈棕色或褐色顆粒狀，用PBS代替一抗作為陰性對照組。然后用高倍鏡觀察各組大鼠腎臟組織nephrin、podocin和α3β1整合素的表達(dá)情況，陽染呈棕色或褐色顆粒狀。每組取10例切片，采集高倍視野（×400倍）圖像，每例計數(shù)1張切片，4個視野，采用Imagine-Pro-Plus軟件分別對各組大鼠腎臟組織切片的免疫組化染色的陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，測定組織中蛋白染色平均光密度值并分析。染色越深，平均積分光密度越大，反映蛋白的表達(dá)越高。

2．2Western blot法檢測腎臟足細(xì)胞特征蛋白nephrin、podocin和α3β1整合素表達(dá)情況 每組樣本稱取腎皮質(zhì)約50 mg，用強(qiáng)裂解液按RIPA∶PMSF ＝99∶1的比例混勻后，提取裂解蛋白30 min，反復(fù)凍融3次。4℃，12 000 r·min－1離心15 min后提取上清，再與4×蛋白電泳上樣緩沖液混合，100℃煮沸10 min，－20℃保存。制備SDS／PAGE凝膠，吸取適量樣本上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，后用吐溫PBS／牛奶37℃搖床上封閉2 h。放入適宜稀釋度的一抗中4℃過夜，次日用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育2 h，TPBS洗膜3×10 min，PBS 1×10 min，采用Imagine Quant Las 4000mini化學(xué)自發(fā)光顯影儀器，ECL試劑盒顯影，結(jié)果采用Imagine J軟件分析蛋白的相對光密度值，以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值的比值表示。

部數(shù)據(jù)采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。腎臟組織免疫組化分析采用Imagine-Pro plus軟件進(jìn)行分析，Western blot數(shù)據(jù)結(jié)果采用Imagine J軟件分析，分別測定平均光密度值。

3　結(jié)果

3．1大鼠腎臟足細(xì)胞特征性蛋白nephrin，podocin 和α3β1整合素分布位置

3．1．1腎臟組織足細(xì)胞蛋白nephrin分布位置 采集油鏡視野（×1 000倍）圖像，觀察nephrin蛋白的表達(dá)分布情況。我們發(fā)現(xiàn)：neprhin蛋白主要表達(dá)在腎小球足細(xì)胞上，存在于腎小球基底膜外側(cè)的足細(xì)胞裂孔隔膜和足突之間，結(jié)果顯示，nephrin蛋白也跨膜分布于足細(xì)胞胞質(zhì)中，其陽性產(chǎn)物呈棕褐色，見Fig 1-1。

Fig 1-1 Expression of nephrin in kidney glomerulus by oil mirror observation（×1 000）

3．1．2腎臟組織足細(xì)胞蛋白podocin分布位置 采集油鏡視野（×1 000倍）圖像，觀察podocin蛋白的表達(dá)分布情況。我們發(fā)現(xiàn)：podocin蛋白主要表達(dá)在腎小球足細(xì)胞上，分布于足細(xì)胞的胞膜上，其陽性產(chǎn)物呈棕褐色，見Fig 2-1。

3．1．3腎臟組織足細(xì)胞蛋白α3β1整合素分布位置 采集油鏡視野（×1 000倍）圖像，觀察α3β1整合素蛋白的表達(dá)分布情況。我們發(fā)現(xiàn)：α3β1整合素蛋白主要表達(dá)在腎小球基底膜和足細(xì)胞上，部分也跨膜分布于足細(xì)胞胞質(zhì)中，其陽性產(chǎn)物呈棕褐色，見Fig 3-1。

3．2BBR對DN大鼠腎臟足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3．2．1BBR對腎臟組織足細(xì)胞蛋白nephrin表達(dá)的影響

3．2．1．1免疫組化結(jié)果分析 采集高倍視野（× 400倍）圖像，測定腎臟組織中nephrin蛋白染色平均光密度值，進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示：正常組大鼠腎臟組織nephrin均勻分布于腎小球內(nèi)，沿腎小球毛細(xì)血管袢分布，著色較深；模型組大鼠nephrin蛋白陽性表達(dá)明顯減少且分散不均一。與正常對照組相比，模型組大鼠腎臟組織nephrin蛋白表達(dá)明顯降低，BBR（50 mg·kg－1）給藥組對大鼠腎臟組織的nephrin表達(dá)作用不明顯，BBR（100和200 mg· kg－1）給藥組和依那普利陽性藥對照組（1 mg· kg－1）作用對增強(qiáng)nephrin蛋白表達(dá)效果明顯，與模型組大鼠腎臟nephrin蛋白表達(dá)比較差異均有顯著性（P＜0.01）。蛋白染色及分析結(jié)果見Fig 1-2。

3．2．1．2Western blot結(jié)果分析 與正常組相比，模型組大鼠腎臟組織nephrin蛋白表達(dá)明顯降低（P ＜0.01）；與模型組相比，BBR（100和200 mg· kg－1）給藥組和依那普利陽性藥對照組（1 mg· kg－1）對上調(diào)nephrin蛋白表達(dá)效果明顯，且差異均有顯著性（P＜0.01）。見Fig 1-3。

3．2．2BBR對腎臟組織足細(xì)胞蛋白podocin表達(dá)的影響

Fig 1-2 Effect of different dosages of BBR on the expression of nephrin in kidney tissue（IHC×400）

Fig 1-3 Effect of different dosages of BBR on the expression of nephrin in kidney tissue（±s，n＝3）

Fig 2-1 Expression of podocin in kidney glomerulus by oil mirror observation（×1 000）

3．2．2．1免疫組化結(jié)果分析 采集高倍視野（× 400倍）圖像，測定腎臟組織中podocin蛋白染色平均光密度值，進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示：與正常對照組相比，模型組大鼠腎臟組織podocin蛋白表達(dá)明顯降低，組織中蛋白染色平均光密度值明顯減少，BBR（50、100、200 mg·kg－1）給藥組對模型組大鼠腎臟組織的podocin蛋白表達(dá)有不同程度的上調(diào)作用，其中BBR（100、200 mg·kg－1）給藥組上調(diào)作用效果較明顯，與依那普利給藥組（1 mg·kg－1）作用相似，與模型組大鼠比較差異有顯著性（P＜0.01）。見Fig 2-2。

3．2．2．2Western blot結(jié)果分析 與正常組相比，模型組大鼠腎臟組織podocin蛋白表達(dá)明顯降低（P ＜0.01）；與模型組相比，BBR（100、200 mg·kg－1）給藥組和依那普利陽性藥對照組（1 mg·kg－1）對上調(diào)podocin蛋白表達(dá)作用明顯，差異均有顯著性（P＜0.01）。見Fig 2-3。

Fig 2-3 Effect of different dosages of BBR on the expression of podocin in kidney tissue（±s，n＝3）

Fig 2-2 Effect of different dosages of BBR on the expression of podocin in kidney tissue（IHC×400）

Fig 3-1 Expression of intergrin α3β1 in kidney glomerulus by oil mirror observation（×1 000）

3．2．3BBR對腎臟組織足細(xì)胞α3β1整合素表達(dá)的影響

3．2．3．1免疫組化結(jié)果分析 采集高倍視野（× 400倍）圖像，測定腎臟組織中α3β1整合素染色平均光密度值，對切片免疫組化染色的陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示：與正常對照組相比，模型組大鼠α3β1整合素蛋白表達(dá)明顯降低，腎小球α3β1蛋白染色平均光密度值明顯減少，BBR（50、100、200 mg·kg－1）給藥組對模型組大鼠腎臟組織的α3β1表達(dá)有不同程度的上調(diào)作用，其中BBR（100、200 mg·kg－1）治療組升高作用效果明顯，與依那普利給藥組（1 mg·kg－1）作用相似，與模型組大鼠比較差異有顯著性（P＜0.01）。蛋白染色及分析結(jié)果見Fig 3-2。

3．2．3．2Western blot結(jié)果分析 與正常組相比，模型組大鼠腎臟組織α3β1整合素蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，BBR（100、200 mg· kg－1）給藥組和依那普利陽性藥對照組（1 mg· kg－1）對上調(diào)α3β1整合素表達(dá)作用明顯，差異均有顯著性（P＜0.01），而BBR（50 mg·kg－1）給藥組對上調(diào)大鼠腎臟組織的nephrin表達(dá)作用不明顯，見Fig 3-3。

Fig 3-3 Effect of different dosages of BBR on the expression of intergrin α3β1 in kidney tissue（±s，n＝3）

4　討論

Fig 3-2 Effect of different dosages of BBR on the expression of intergrin α3β1 in kidney tissue（IHC×400）

糖尿病是一種常見的糖代謝障礙性疾病，DN作為糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也歸屬于糖尿病微血管病變的范疇，其最終可能導(dǎo)致終末期腎衰，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。DN在組織學(xué)上表現(xiàn)為腎小球過度肥大、系膜增生和腎小球硬化等；在臨床上主要表現(xiàn)為血糖、血脂代謝紊亂和進(jìn)行性腎功能損傷。此外，DN還常常伴有尿蛋白的代謝紊亂［6］。研究表明，BBR在防治DN上有著廣泛的應(yīng)用前景［7］，但是目前就BBR在DN中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，涉及到

足細(xì)胞的作用研究較少，因此機(jī)制尚不明確。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BBR可以明顯降低DN大鼠腎組織VEGF的異常表達(dá)，改善VEGF異常增多引起的腎小球功能紊亂和尿蛋白堆積，減輕腎臟損傷［8］。此外，我們課題組還發(fā)現(xiàn)，BBR能明顯降低DN誘發(fā)的高糖血癥，降低糖尿病動物血清的BUN、UTP／C、Scr、TC、TG和LDL-C水平，從而發(fā)揮對DN大鼠腎臟的保護(hù)作用，進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，BBR的腎臟保護(hù)作用與其調(diào)控G蛋白-AC-cAMP信號通路相關(guān)［9］。BBR預(yù)防給藥能夠延緩DN的發(fā)生發(fā)展，研究證實，BBR能夠明顯抑制腎臟炎性因子如IL-6、TGF-β1和PGE2的表達(dá)水平，減輕DN時腎臟的炎癥發(fā)應(yīng)，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，其部分機(jī)制可能與抑制EP受體相關(guān)信號通路密切相關(guān)［10］。以上提示，BBR在DN時保護(hù)腎臟作用，與抑制腎臟炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，這可能依賴于對PGE2-EPs-G蛋白-cAMP信號通路的調(diào)控作用。

足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，與GBM和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成腎小球濾過屏障，足細(xì)胞是避免尿蛋白形成的最后一道屏障，足細(xì)胞損傷或脫落會導(dǎo)致大量蛋白尿及腎小球硬化。足細(xì)胞損傷參與DN的發(fā)生發(fā)展，足細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白如neph-rin、podocin和α3β1整合素和形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常表達(dá)會破壞腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而加速DN的進(jìn)程。nephrin作為單次跨膜的1型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的一種含1241個殘基的細(xì)胞黏附分子，維持足細(xì)胞的正常形態(tài)和黏附能力，保持腎小球濾過屏障的通透性，對足細(xì)胞黏附于腎小球基底膜起著關(guān)鍵作用。有研究報道了血管緊張素II可通過抑制Notch通路降低足細(xì)胞內(nèi)nephrin的表達(dá)，提示Notch通路在調(diào)控nephrin表達(dá)方面具有重要作用［11］。podocin通過C-末端與nephrin和CD2AP相互作用，podocin加強(qiáng)nephrin蛋白的信號傳遞，其表達(dá)下降可通過nephrin誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)異常，使腎小球濾過屏障完整性遭到破壞，蛋白濾過增加。研究發(fā)現(xiàn)，DN患者足細(xì)胞nephrin和podocin蛋白表達(dá)降低，且與DN蛋白尿的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步研究表明，BBR干預(yù)治療后，nephrin和podocin表達(dá)有所提高，可能與抑制糖基化終產(chǎn)物的形成和氧化應(yīng)激作用有關(guān)［12］。α3β1整合素是足細(xì)胞表達(dá)的主要整合素，也是基底膜組成成分層黏連蛋白-521的主要受體，故作為基底膜－足細(xì)胞連接膜蛋白的α3β1整合素和層黏連蛋白復(fù)合物的損傷，將導(dǎo)致足細(xì)胞和基底膜之間的作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞脫落，促進(jìn)蛋白尿的產(chǎn)生。研究顯示，α3β1整合素水平的變化會導(dǎo)致足細(xì)胞與腎小球基底膜之間的黏附功能改變，這是足細(xì)胞脫落進(jìn)而產(chǎn)生蛋白尿的重要原因［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎臟組織中，α3β1整合素的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均明顯下降，這可能促進(jìn)DN時足細(xì)胞減少和蛋白尿發(fā)生［14］。但是，BBR對α3β1整合素的表達(dá)是否有影響，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

本實驗在前期課題組研究基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)建立大鼠模型，探討小檗堿對DN模型大鼠腎臟足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin和α3β1整合素蛋白表達(dá)的影響，實驗結(jié)果表明：足細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白如nephrin、podocin和α3β1整合素均表達(dá)在腎小球內(nèi)，其在足細(xì)胞的表達(dá)分布各有差異；適宜劑量BBR給藥能有效上調(diào)模型組大鼠腎臟組織足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin和α3β1整合素在腎小球內(nèi)的表達(dá)水平，nephrin、podocin等及黏附分子α3β1整合素表達(dá)下調(diào)是足細(xì)胞損傷的標(biāo)志，提示BBR可能通過影響DN大鼠腎臟足細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)，來減緩足細(xì)胞的損傷而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，為BBR應(yīng)用于DN早期防治提供可能。BBR可通過影響DN模型組大鼠足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)，減輕足細(xì)胞損傷而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，使其成為未來防治DN的重要藥物。但這一作用是通過何種途徑調(diào)控nephrin、podocin等及黏附分子α3β1整合素及這幾種蛋白之間是否存在內(nèi)部聯(lián)系尚需進(jìn)一步研究，擬在今后的體內(nèi)、體外實驗中進(jìn)一步闡明，為BBR早日應(yīng)用于臨床防治DN提供重要的參考價值。

（致謝：本實驗在安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所實驗室完成，實驗中涉及到的病理切片技術(shù)獲得安徽省立醫(yī)院病理科胡聞主任的技術(shù)指導(dǎo)，在開展實驗過程中也獲得了臨床藥理研究所各位老師和同學(xué)的支持，在此表示感謝?。?/p>

參考文獻(xiàn)：

［1］ Tang S C．Diabetic nephropathy：a global and growing threat［J］．Hong Kong Med J，2010，16（4）：244－5．

［2］ Ziyadeh F N，Wolf G．Pathogenesis of the podocytopathy and pro-teinuria in diabetic glomerulopathy［J］．Curr Diabetes Rev，2008，4（1）：39－45．

［3］ Zhang Y，Li X，Zou D，et al．Treatment of type 2 diabetes and dyslipidemia with the natural plant alkaloid berberine［J］．J Clin Endocrinol Metab，2008，93（7）：2559－65．

［4］ Tang L Q，Wang F L，Zhu L N et al．Berberine ameliorates renal injury by regulating G proteins-AC-cAMP signaling in diabetic rats with nephropathy［J］．Mol Biol Rep，2013，40（6）：3913－23．

［5］ Yang Y，Ni W J，Cai M，et al．The renoprotective effects of ber-berine via the EP4-Galphas-cAMP signaling pathway in different stages of diabetes in rats［J］．J Recept Signal Transduct Res，2014，34（6）：445－55．

［6］ Ni W J，Tang L Q，Wei W．Research progress in signalling path-way in diabetic nephropathy［J］．Diabetes Metab Res Rev，2015，31（3）：221－33．

［7］ Ni W J，Ding H H，Tang L Q．Berberine as a promising anti-dia-betic nephropathy drug：An analysis of its effects and mechanisms ［J］．Eur J Pharmacol，2015，760：103－12．

［8］ 倪偉建，丁海華，唐麗琴，等．小檗堿對糖尿病腎病大鼠腎組織VEGF表達(dá)的影響［J］．中國藥理學(xué)通報，2015，31（6）：795－800．

［8］ Ni W J，Ding H H，Tang L Q，et al．Effect of berberine on ex-pression of vascular endothelial growth factor in diabetic nephropa-thy rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2015，31（6）：795－800．

［9］ Wang F L，Tang L Q，Yang F，et al．Renoprotective effects of berberine and its possible molecular mechanisms in combination of high-fat diet and low-dose streptozotocin-induced diabetic rats ［J］．Mol Biol Rep，2013，40（3）：2405－18．

［10］Tang L Q，Liu S，Zhang S T，et al．Berberine regulates the ex-pression of E-prostanoid receptors in diabetic rats with nephropathy［J］．Mol Biol Rep，2014，41（5）：3339－47．

［11］高 峰，張 濤，王曉梅，等．血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞Notch通路及Nephrin表達(dá)的影響［J］．中國藥理學(xué)通報，2015，31 （2）：247－50．

［11］Gao F，Zhang T，Wang X M，et al．Effect of angiotensin on ex-pression of Notch pathway and Nephrin in podocyte［J］．Chin Pharmacol Bull，2015，31（2）：247－50．

［12］Wu D，Wen W，Qi C L，et al．Ameliorative effect of berberine on renal damage in rats with diabetes induced by high-fat diet and streptozotocin［J］．Phytomedicine，2012，19（8－9）：712－8．

［13］Chen J，Gui D，Chen Y，et al．Astragaloside IV improves high glucose-induced podocyte adhesion dysfunction via alpha3beta1 in-tegrin upregulation and integrin-linked kinase inhibition［J］．Bio-chem Pharmacol，2008，76（6）：796－804．

［14］Chen J，Chen Y，Luo Y，et al．Astragaloside IV ameliorates dia-betic nephropathy involving protection of podocytes in streptozoto-cin induced diabetic rats［J］．Eur J Pharmacol，2014，736：86 －94．

Effect of berberine on the expression of nephrin，podocin and intergrin α3β1 in diabetic nephropathy rats

DING Hai-hua1，QIU Yuan-ye1，WANG Ying-ying1，NI Wei-jian1，2，TANG Li-qin1，2，WEI Wei1
（1．Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Anti-inflammation and Immunopharmacology of Education Ministry，Anhui Anti-inflammation and Immunodrugs Collaborative Innovation Center，Hefei 230032，China；2．Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of berberine on the expression of nephrin，podocin and intergrin α3β1 in diabetic nephropathy（DN）rat model，and further probe in to the renoprotective effects of berber-ine and its potential mechanisms．Methods The rat model of DN was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）after fed with high-sugar and high-fat diet for six weeks．The rats were assigned into 6 groups randomly：normal control group，DN model group，BBR（50，100 and 200 mg·kg－1）treatment group and enalaprilat positive control group（1 mg· kg－1）．The distribution and expression of kidney podocyte related proteins nephrin，podocin and interg-rin α3β1 were detected by immunohistochemical meth-od following electron microscopy observation（×1000）and high magnification observation（×400）and West-ern blot．Results The podocyte related protein neph-rin，podocin and intergrin α3β1 were mainly distribu- ted in podocyte，but slightly different．Compared with normal control group，the expresion of podocyte related protein nephrin，podocin and intergrin α3β1 was de-creased obviously；compared with model group，BBR （100 and 200 mg·kg－1）treatment group could sig-nificantly suppress the abnormalities of pathological changes of the kidney and upregulate the expression levels of podocyte specific protein nephrin，podocin and intergrin α3β1 in the kidney of diabetic rats with nephropathy．Conclusions Berberine could alleviate the abnormalities of kidney pathological changes and proteinuria production in the DN model rats，which may be related to the upregulation of the expression of the podocyte proteins nephrin，podocin and intergrin α3β1．

Key words：berberine；diabetic nephropathy；podo-cyte；nephrin；podocin；intergrin α3β1；renoprotec-tive effect

作者簡介：丁海華（1991－），女，碩士生，研究方向：內(nèi)分泌及代謝藥理學(xué)，E-mail：dhh728＠163．com；唐麗琴（1972－），女，博士，教授，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌及代謝藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：tulcyl ＠vip．sina．com；魏 偉（1960－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：wwei＠ahmu．edu．cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81102864）；安徽省自然科學(xué)基金資助項目（No 1508085MH179）

收稿日期：2015－06－12，修回日期：2015－07－27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1414－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．018