潘志強，梁龍龍，方肇勤

（上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203）

佛司可林促進小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細胞皮質(zhì)酮分泌的作用研究

潘志強，梁龍龍，方肇勤

（上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R322．56；R347．7；R977.11；R977.3

摘要：目的 研究佛司可林（FSK）對小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細胞皮質(zhì)激素的促分泌作用。方法 以Y1小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細胞為實驗對象，采用1、10 μmol·L－1FSK處理Y1細胞15 min～24 h等不同時程，觀察Y1細胞生長形態(tài)變化，運用ELISA方法檢測細胞分泌液皮質(zhì)酮含量，RT-qPCR方法檢測相關基因mRNA表達，Western blot方法檢測相關蛋白表達。結果 1 μmol·L－1FSK干預Y1細胞3 h后細胞形態(tài)開始皺縮并逐漸形成圓球狀生長。與對照組比較，1μmol·L－1FSK治療24 h后明顯升高Y1細胞皮質(zhì)酮水平（P＜0.01）；并增加類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白酶（Star）基因和蛋白表達（P＜0.01）、也明顯升高皮質(zhì)酮合成第一步驟限速酶Cyp11a1和皮質(zhì)酮合成最后一步關鍵酶Cyp11b1基因表達（P＜0.01）。此外，10μmol·L－1FSK干預Y1細胞15 min～12 h不同時程后，發(fā)現(xiàn)1 h后即可明顯增加Star基因表達，并呈現(xiàn)典型的時效關系（P＜0.01）；孤兒核受體（Nr4a1和Nr4a2）基因表達在FSK處理15 min后明顯升高、1 h后上調(diào)最明顯（P＜0.01），之后升高幅度逐漸減弱。然而，F(xiàn)SK對孤兒核受體（Nr5a1）和促腎上腺皮質(zhì)激素受體（Mc2r）基因表達無明顯影響。結論 Y1小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細胞對腺苷酸環(huán)化酶激活劑佛司可林具有強烈的應答反應，佛司可林是皮質(zhì)激素分泌的強有效誘導劑。

關鍵詞：佛司可林；腎上腺皮質(zhì)；Y1細胞；皮質(zhì)酮；類固醇激素合成酶；Star；Cyp11b1

網(wǎng)絡出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．034．html

佛司可林（forskolin，F(xiàn)SK）是從唇形科植物毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii Briq．）中提取的二萜類化合物，化學名為7β-乙酰氧基-1α，6β，9α-三羥基-8，13-環(huán)氧-labd-14-烯-11-酮。藥理學研究提示FSK是腺苷酸環(huán)化酶激活劑，能升高多種組織細胞中的環(huán)腺苷酸（cAMP）濃度，從而參與細胞功能的調(diào)節(jié)，包括降血壓、降低眼壓、強心、平喘、抗腫瘤、抗血栓、抗炎癥、抗過敏和抗抑郁等作用［1－4］。

基于FSK是強效的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，cAMP作為細胞內(nèi)的重要第二信使參與激素的分泌，那么FSK對腎上腺皮質(zhì)細胞激素分泌作用及其機制如何，值得關注。在體外研究中，人與小鼠腎上腺皮質(zhì)細胞系或細胞株經(jīng)常被采用［5］，其中，Y1細

胞是最常用的小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細胞株。本文主要報道FSK對Y1細胞皮質(zhì)酮的促分泌作用及對類固醇激素合成酶與相關轉錄因子表達的影響。

1　材料與方法

1．1細胞株 小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細胞（Y1 mouse adrenocortical tumor cell），購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所（細胞資源中心）。

1．2藥品與試劑 FSK和RIPA裂解液購自上海碧云天生物試劑有限公司，二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma-Aldrich公司。新生牛血清、100 U·L－1青、鏈霉素、DMEM-F12培養(yǎng)液均購自Hyclone公司。TRIzol購自Invitrogen公司；PrimeScriptRT re-agent Kit、SYBRPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）II購自TaKaRa公司；采用Primer3（v．0．4．0）在線軟件設計引物，并委托Life Technologies公司合成。小鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒購自Cayman公司。抗體anti-mice β-actin購自Sigma-Aldrich，anti-rabbit StAR 和anti-mice NR4A1購自Abcam公司；免疫印跡化學發(fā)光試劑ECL試劑盒購自Pierce公司。

1．3主要儀器 7500 Fast Real-Time PCR System實時熒光定量PCR儀（ABI公司），Elx800型酶標儀（Biotek公司），Alpha化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Pro-tein-Simple公司），等。

1．4細胞培養(yǎng)及分組 Y1細胞用含10%新生牛血清、100 U·L－1青鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃濕飽和的條件下培養(yǎng)。細胞生長至80%～85%融合時，用0.25%胰酶（含EDTA）消化后，鋪板后培養(yǎng)，取其對數(shù)生長期細胞進行實驗。藥物干預細胞時，采用1%新生牛血清培養(yǎng)液，依據(jù)實驗目的分別采用1 μmol·L－1或10 μmol·L－1FSK分別處理Y1細胞15 min、30 min、1、2、4、6、12和24 h等相應時間，對照組（Con）采用0．1%DMSO做對照，并收集細胞上清培養(yǎng)液用于檢測皮質(zhì)酮含量、收集細胞進行mRNA與蛋白表達檢測。

1．5酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測皮質(zhì)酮含量Y1細胞經(jīng)1 μmol·L－1FSK治療24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)小鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測培養(yǎng)液中皮質(zhì)酮含量。

1．6實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測基因mRNA表達 上下游引物序列采用Primer3（v．0．4．0）在線軟件合成（Tab 1），委托Life Technologies公司上海合成部完成。按照TRIzol試劑盒說明書抽提腎上腺總RNA；逆轉錄反應體系20 μL，反應條件為37℃×15 min，85℃×5 s，4℃；PCR擴增反應體系為20 μL，反應程序為95℃×3 min，95℃×30 s，60℃×30 s，40循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量分析方法：采用2－ΔΔCT法分析，以正常組作為對照組，以ppia基因Ct均值作為內(nèi)參組，ΔCt＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因（其中，Ct值為擴增n個循環(huán)基因的熒光數(shù)值），ΔΔCt＝ΔCT實驗組－ΔCT對照組，目的基因相對表達量＝2－ΔΔCT。

1．7Western blot技術檢測蛋白表達 采用RIPA裂解液處理Y1細胞，收集蛋白質(zhì)樣品并予以定量，通過變性處理，分別執(zhí)行聚丙烯凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再洗滌、顯影等實驗流程，其中，一抗?jié)舛葍?nèi)參β-actin以1∶20 000稀釋、StAR抗體1∶1 000稀釋、NR4A1抗體1∶500稀釋。以β-actin為內(nèi)參對照，分析蛋白相對表達量。

Tab 1 Primer sequences of RT-qPCR

Fig 1 Y1 cells morphology at different time points by 1μmol·L－1FSK treatment

1．8統(tǒng)計學分析 采用GraphPad．Prism5．0專業(yè)軟件進行作圖、及統(tǒng)計分析，采用Newman-Keuls post-hoc方差分析。

2　結果

2．1FSK對Y1細胞生長形態(tài)的影響 Y1細胞在基礎培養(yǎng)狀態(tài)下，生長較快，約3～4 d傳代培養(yǎng)，細胞呈貼壁樣扁平狀生長，經(jīng)1 μmol·L－1FSK干預3、6、12和24 h后（Fig 1），可見細胞逐漸皺縮成圓球狀，可能與細胞骨架彈性纖維應力變化有關。

2．2FSK促進Y1細胞皮質(zhì)酮分泌 基礎狀態(tài)下Y1細胞皮質(zhì)酮分泌量較低，經(jīng)1μmol·L－1FSK治療24 h后，皮質(zhì)酮分泌明顯升高（Fig 2）。

Fig 2 Forskolin stimulates corticosterone production in Y1 cells

2．3FSK促進Y1細胞皮質(zhì)酮合成酶的基因表達

我們采用1μmol·L－1FSK干預Y1細胞24 h，檢測了皮質(zhì)酮合成過程相關酶的基因表達，與對照組比較，F(xiàn)SK明顯增加類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白酶（Star）基因表達（Fig 3A）；同樣，F(xiàn)SK明顯增加皮質(zhì)酮合成第一步驟限速酶Cyp11a1基因表達（Fig 3B）；也明顯增加皮質(zhì)酮合成最后一步關鍵酶Cyp11b1基因表達（Fig 3C）；但是，基礎培養(yǎng)狀態(tài)下，Y1細胞促腎上腺皮質(zhì)激素受體（Mc2r）轉錄水平很低，經(jīng)FSK處理后，Mc2r基因上調(diào)趨勢差異無顯著性（Fig 3D）。

2．4FSK促進Y1細胞皮質(zhì)酮合成酶相關轉錄因子的表達 此外，我們采用10 μmol·L－1FSK不同時程干預Y1細胞15 min～12 h，并檢測了調(diào)節(jié)皮質(zhì)酮合成的即刻早期基因表達，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SK治療Y1細胞1 h即可明顯增加Star基因表達，并呈現(xiàn)典型的時效關系（Fig 4A）；FSK治療Y1細胞15 min即明顯增加孤兒核受體（Nr4a1）基因表達、且治療1 h后Nr4a1上調(diào)最明顯，達40倍，之后升高幅度逐漸減弱（Fig 4B）；同樣，F(xiàn)SK治療Y1細胞15 min即明顯增加孤兒核受體（Nr4a2）基因表達、且治療1 h 后Nr4a2上調(diào)非常明顯，達120倍，4 h后Nr4a2表達逐漸趨向正常（Fig 4C）；然而，F(xiàn)SK對孤兒核受體（Nr5a1）基因表達無明顯影響（Fig 4D）。

2．5FSK激活StAR與NR4A1蛋白表達作用 此外，我們檢測了1 μmol·L－1FSK干預Y1細胞不同時間后StAR與NR4A1蛋白表達，結果顯示，對照組Y1細胞StAR蛋白表達非常弱，經(jīng)FSK干預6 h后StAR蛋白表達量升高，24 h后升高更明顯（Fig 5A）；同樣，NR4A1蛋白在對照組不能檢測其表達，經(jīng)FSK干預1 h后仍未見表達，6 h后可見NR4A1蛋白表達明顯升高（Fig 5B）。

3　討論

腎上腺皮質(zhì)是機體合成與分泌鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素和少量性激素的重要組織，其生理功能還受上游的高級中樞垂體和下丘腦所調(diào)控。在體外研究中，Y1細胞是經(jīng)常被使用的小鼠腎上腺皮質(zhì)細胞株，然而，Y1細胞是否保留體內(nèi)腎上腺皮質(zhì)的全部功能尚存在爭議，有實驗室報道，Y1細胞對ACTH有應答作用，且主要通過cAMP和蛋白激酶A信號通路起作用［6－7］，也有報道Y1細胞對ACTH無應答作用［8－9］，我們前期的研究提示，Y1細胞對ACTH應答反應很弱，推測可能是Y1細胞反復保種傳代失去此功能。由于類固醇激素分泌細胞與第二信使cAMP有關，因此，Y1細胞是否對腺苷酸環(huán)化酶激活劑FSK具有應答作用，本文進行了深入探討，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)不同濃度FSK對Y1細胞增殖實驗差異較小，因而，本研究分別采用較低濃度1 μmol·L－1FSK處理Y1細胞24 h、較高濃度10 μmol·L－1FSK干預Y1細胞15 min～12 h，并進行了相關指標的檢測。

Fig 3 Forskolin increases steroid hormone synthesis enzymes mRNA expression after treatment for 24h in Y1 cells

由結果可知，Y1細胞對FSK應答出現(xiàn)較早且作用強烈，經(jīng)1 μmol·L－1FSK干預后細胞形態(tài)變化明顯，推測可能與細胞骨架彈性纖維應力變化有關，從而導致細胞皺縮成圓球狀，并促進激素的合成、分泌與釋放，通過檢測細胞培養(yǎng)液激素含量，發(fā)現(xiàn)1μmol·L－1FSK作用24 h后，皮質(zhì)酮水平明顯增加約4倍。經(jīng)過對皮質(zhì)酮合成過程的幾個關鍵酶的基因表達檢測，發(fā)現(xiàn)FSK明顯增加類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白酶（Star）基因表達上調(diào)30倍，并在FSK干預1 h開始逐漸升高，皮質(zhì)酮合成第一步驟限速酶Cyp11a1和最后一步關鍵酶Cyp11b1基因表達也分別上調(diào)4倍和10倍，結果提示FSK通過激活腺苷酸環(huán)化酶，快速增加StAR蛋白表達以促進細胞內(nèi)膽固醇轉運至線粒體內(nèi)膜，并通過限速酶Cyp11a1促進膽固醇裂解為孕烯醇酮，最后在Cyp11b1酶作用下促進皮質(zhì)酮的合成與分泌。然而，基礎培養(yǎng)狀態(tài)下，Y1細胞促腎上腺皮質(zhì)激素受體（Mc2r）轉錄水平很低，經(jīng)1 μmol·L－1FSK處理后，Mc2r基因表達有升高趨勢，但差異無顯著性，有學者也發(fā)現(xiàn)Mc2r對FSK應答弱［10］。

值得注意的是，F(xiàn)SK不僅可促進皮質(zhì)酮合成酶表達上調(diào)，還可促進調(diào)節(jié)皮質(zhì)酮合成過程的一些轉錄因子表達，尤其是NR4孤兒核受體基因表達，在10 μmol·L－1FSK干預1 h后升高幅度達40～120倍，在10 μmol·L－1FSK作用6 h后NR4A1蛋白表達也明顯升高，由于Nr4a1和Nr4a2屬于即刻早期表達基因，提示FSK對皮質(zhì)酮合成過程中即刻早期表達基因作用強烈且短暫，據(jù)報道NR4家族分子直接參與對人腎上腺皮質(zhì)細胞（H295R）皮質(zhì)激素分泌的調(diào)控［11－12］。然而，10 μmol·L－1FSK對NR5孤兒核受體分子無明顯影響，有報道認為Nr5a1 （SF-1）分子主要參與腎上腺皮質(zhì)細胞的發(fā)育與分化［13］，可能與皮質(zhì)激素合成的功能關系不密切。

綜上所述，本研究觀察佛司可林對小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細胞皮質(zhì)激素合成酶及其轉錄調(diào)控因子的作用、及其對細胞皮質(zhì)酮分泌的影響，我們發(fā)現(xiàn)小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤Y1細胞對腺苷酸環(huán)化酶激活劑佛司可林具有強烈的應答反應，以促進皮質(zhì)酮合成與分泌

的藥理學作用為突出特征，因此，該研究為佛司可林作為Y1細胞皮質(zhì)激素的合成與分泌的強有效誘導劑提供科學依據(jù)。

Fig 4 Immediate early genes mRNA expression by 10μmol·L－1forskolin treatment from 15 min to 12 h in Y1 cells

Fig 5 Forskolin stimulates protein expressions after treatment for indicated time in Y1 cells

（致謝：本研究在上海中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局細胞分子生物學三級實驗室完成。）

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Effect of forskolin on corticosterone secretion in Y1 mouse adrenocortical tumor cells

PAN Zhi-qiang，LIANG Long-long，F(xiàn)ANG Zhao-qin
（Basic Medical School of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract：Aim To study the effect of forskolin on cor-ticosterone secretion in mouse adrenocortical tumor cells．Methods Y1 cells were treated with 1μmol· L－1or 10μmol·L－1forskolin for 15 min to 24 h．Y1 cells growth morphology was observed，cell culture su-pernatants were collected and corticosterone was tested by ELISA kit．The cells total RNA was extracted using TRIzol kit and was reversely transcribed to obtain the cDNA，then was amplificated by real time quantitative PCR．The cells were lysed with RIPA lysis buffer and protein expressions were carried out by Western blot．Results Y1 cells morphology changed from flat adher-ent to shrink and spherical growth after 1μmol·L－1forskolin treatment for 3 h．Compared with the control group，corticosterone levels were increased significantly by 1μmol·L－1forskolin treatment for 24 h（P＜0.01），then，forskolin significantly enhanced steroid ogenic acute regulatory protein（Star）mRNA and pro- tein expression（P＜0.01），moreover，the steroido-genic enzymes such as Cyp11a1 and Cyp11b1 mRNA expressions were also up-regulated significantly by fors-kolin（P＜0.01）．Additionally，Star mRNA expres-sion was increased significantly in a time-dependent re-sponse after 10μmol·L－1forskolin treatment from 1 h to 12 h（P＜0.01）．Furthermore，Nr4a1 and Nr4a2 mRNA expressions were up-regulated significantly after 10μmol·L－1forskolin treatment from 15 min and reached the top at 1 h（P＜0.01）．However，forsko-lin showed no effect on Mc2r and Nr5a1 mRNA expres-sions．Conclusion Y1 mouse adrenocortical tumor cells have a strong response to adenylate cyclase ago-nists，then，forskolin can be used to glucocorticoid se-cretion inducer reagent．

Key words：forskolin；adrenocortical；Y1 mouse ad-renocortical tumor cell；corticosterone；steroidogenic enzyme；Star；Cyp11b1

通訊作者

作者簡介：潘志強（1977－），男，博士，碩士生導師，副教授，研究方向：中醫(yī)基礎實驗研究，，Tel：021-51322116，E-mail：pzq527＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81473562）；上海市進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃（No ZY3-CCCX-3-3010）

收稿日期：2015－06－10，修回日期：2015－08－11

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1408－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．017