張蔚屏，于 影，高 琴，郭曉磊，關宿東

（蚌埠醫(yī)學院生理學教研室，安徽蚌埠 233030）

促紅細胞生成素對肝硬化大鼠心肌TGF-β1 及ColⅠ基因表達的影響

張蔚屏，于 影，高 琴，郭曉磊，關宿東

（蚌埠醫(yī)學院生理學教研室，安徽蚌埠 233030）

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R394.2；R542.202；R575.2；R977.9

摘要：目的 觀察肝硬化對大鼠心肌轉化生長因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）及膠原Ⅰ（collagenⅠ，ColⅠ）基因表達的影響及促紅細胞生成素的干預作用。方法 清潔級SD大鼠36只，隨機分為3組：正常對照組、肝硬化組及EPO干預組。在體測定各組心臟血流動力學指標，測血清乳酸脫氫酶（LDH）及肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，Masson染色法觀察各組大鼠心肌膠原形成情況，RT-PCR法檢測各組心肌TGF-β1、ColⅠmRNA基因表達的變化。結果 與正常對照組相比，肝硬化組大鼠左心室收縮和舒張功能下降，心肌酶增高，心肌膠原沉積明顯增加，心肌TGF-β1及ColⅠ基因表達升高。與肝硬化組相比，EPO干預組大鼠心室收縮和舒張功能提高，心肌酶指標降低，心肌膠原沉積改善，心肌TGF-β1及ColⅠ基因表達降低。結論肝硬化能引起大鼠心肌結構和功能的改變，促進心肌間質纖維化的發(fā)生；EPO對肝硬化大鼠心肌損傷有一定的保護作用。

關鍵詞：肝硬化；心??；EPO；膠原；心功能；TGF-β1

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．030．html

1953年Kowalski等［1］首次報道肝硬化患者存在心功能異常，肝硬化引起長期的高動力循環(huán)及一

系列神經體液因素的共同作用造成心室負荷加重、鈉水潴留、心肌的相對供血不足，導致心肌細胞肥大和心肌間質纖維化即心室重構，許多因子及信號通路參與心室重構的致病過程，其中轉化生長因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）信號通路在心肌肥大及心肌間質纖維化的過程中發(fā)揮重要的作用，是諸多因素導致心肌纖維化共同的中介物之一。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）作為一種造血因子已應用于臨床，近年來研究表明，EPO可激活多種細胞信號轉導通路發(fā)揮促進新生血管生成，對抗細胞凋亡、氧化應激、減輕炎癥反應，抑制纖維生成等作用。目前尚未見關于EPO對肝硬化心肌纖維化干預作用的報道。本實驗旨在觀察肝硬化對大鼠心肌功能的影響，在此基礎上給予一定劑量EPO的干預，初步探討EPO對肝硬化心肌的抗纖維化作用及其和TGF-β1之間的關系，為臨床降低和改善肝硬化患者可能出現的心臟并發(fā)癥提供一定的實驗依據和治療方向。

1　材料與方法

1．1材料 健康Sprague-Dawley大鼠36只，質量180～220g，購于蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心。四氯化碳（分析純，天津博迪化工股份有限公司出品），膽固醇（Sigma公司出品），RT-PCR引物、溴化乙錠（EB）、DEPC（焦碳酸二乙酯）、瓊脂糖等購于上海生工生物工程公司，Beyozol 100 mL／瓶（碧云天公司出品），逆轉錄試劑盒及PCR擴增試劑盒（Fermentas公司），玉米面、白酒等為當地超市所購，其它常用試劑為國產分析純。

1．2方法

1．2．1實驗分組、模型建立與給藥 ♀SD大鼠36只，適應性飼養(yǎng)1周，給予普通飼料與自來水喂養(yǎng)，隨機分為3組，正常對照組（normal組，n＝10），肝硬化模型組：（liver cirrhosis，LC組，n＝13），肝硬化＋EPO干預組（liver cirrhosis＋erythropoietin，LC＋EPO干預組，n＝13），正常對照組大鼠腹部皮下注射等量的生理鹽水，給予普通飼料和自來水；其余各組大鼠每隔3天腹部皮下多點注射CCl4玉米油溶液，同時給予0.59 mol·L－1乙醇飲用［2］，第5周開始，肝硬化＋EPO干預組大鼠腹腔注射重組人紅細胞生成素（rhEPO），2 000 IU·kg－1，每周2次，共4周至建模結束。第9周各組隨機抽出兩只大鼠，水合氯醛300 mg·kg－1腹腔注射麻醉，打開腹腔取肝臟，多聚甲醛固定，24 h后石蠟包埋，切片進行HE染色，光鏡下觀察顯示肝硬化模型建立成功。

1．2．2左心室血流動力學指標 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，置于手術臺上，仰臥固定，頸部正中切開，氣管插管，接小型動物呼吸機，吸氣：呼氣為1∶1，潮氣量2－3 mL／100 g，呼吸頻率75 times· min－1，分離右側頸總動脈，心室內插管，與Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)相連，平衡30 min，實時監(jiān)測左心室峰壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室內壓最大上升速率（＋dp／dtmax）和左心室內壓最大下降速率（－dp／dtmax）等各項指標。

1．2．3血清心肌酶學測定 各組大鼠心室血流動力學指標檢測完畢后，打開腹腔，腹主動脈取血約5 mL，室溫放置30 min后，3 000 r·min－1離心15 min，收集血清，取血清約500 μL自然解凍后，采用全自動生化分析儀測定LDH、CK-MB含量。

1．2．4心肌Masson染色 取相同部位心肌組織，10%甲醛溶液中固定，24 h后無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，病理切片機切5 μm厚，進行Masson染色，光鏡下觀察。

1．2．5RT-PCR方法檢測TGF-β1和ColⅠmRNA表達 取心肌組織約100 mg，勻漿器研磨，加Beyo-zol試劑1 000 μL，用以提取心肌組織總RNA，提引物3 μL，按照逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒要求分別加入上下游引物，于PCR儀上進行擴增，TGF-β1擴增條件：95℃預變性3 min后，以①95℃，50 s變性；②退火溫度58℃，45 s；③72℃，60 s反應，30個循環(huán)，最后一輪延10 min。ColⅠ擴增條件：95℃預變性4 min后，以①94℃45 s變性；②退火溫度57℃，45 s；③72℃，60 s反應35個循環(huán)，最后一輪延伸10 min。結果以目的產物與內參擴增產物的比值作為表達量（附各種基因引物序列，見Tab 1）。

Tab 1 Primer squences for each gene

2　結果

2．1左心室功能變化 與正常組相比，肝硬化組LVSP、＋dp／dtmax、－dp／dtmax均明顯降低（P＜0.01）；與肝硬化組相比，肝硬化＋EPO干預組

LVSP、＋dp／dtmax、－dp／dtmax明顯增高（P＜0.05～P ＜0.01）（Tab 2）。

Tab 2 Hemodynamic LVSP，＋dp／dtmax，－dp／dtmaxparameters in different groups（±s，n＝8）

Tab 2 Hemodynamic LVSP，＋dp／dtmax，－dp／dtmaxparameters in different groups（±s，n＝8）

1 mmHg＝0.133 kPa；P＜0.05，P＜0.01 vs normal group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs LC

Group　LVSP ／mmHg ＋dp／dtmax／mmHg·s－1－dp／dtmax／mmHg·s－1Normal　110．15±21．93　4173．47±942．48　3305．00±1006．10 LC　78．78±10．252554．86±553．421855．48±323．22LC＋EPO　98．77±13．47?！?457．08±566．25＃　2982．55±694．48＃＃

2．2心肌酶學改變 與正常對照組相比，肝硬化模型組大鼠心肌LDH、CK-MB均明顯升高（P＜0.01），與肝硬化模型組相比，肝硬化＋EPO干預組各項心肌酶指標有一定程度降低（P＜0.05），但高于正常對照組（P＜0.05）（Fig 1）。

Fig 1 Changes of LDH，CK-MB content in different groups

2．3心臟Masson染色 Masson染色顯示心肌細胞呈紅色，細胞間質中的膠原纖維呈藍色。正常對照組：心肌纖維紅染，排列整齊，走向規(guī)則，未見肌絲斷裂，細胞間隙均勻，可見少量纖維組織，少許間質藍染；肝硬化模型組：心肌纖維排列紊亂，間質水腫，增生明顯，出現較多藍染的膠原纖維蓄積；肝硬化＋EPO干預組：心肌細胞排列較整齊，間質增生減輕，有部分膠原纖維蓄積，較肝硬化模型組有改善（Fig 2）。

Fig 2 Histopathology changes of myocardium in every group（masson staining，×400）

2．4心肌組織中TGF-β1和ColⅠmRNA的表達

與正常組相比，肝硬化組心肌組織TGF-β1mRNA水平明顯上調（P＜0.01），ColⅠmRNA水平明顯上調（P＜0.01），與肝硬化組相比，肝硬化＋EPO干預組TGF-β1mRNA水平下調（P＜0.05），ColⅠmRNA水平下調（P＜0.05）（Fig 3，4）。

3　討論

1953年Kowalski等［1］首次報道肝硬化患者存在心功能異常。隨后大量的動物實驗及臨床報道顯示肝硬化損傷心臟的收縮和舒張功能［3－4］。目前研究顯示肝硬化引起心肌損傷的主要機制可能與β腎上腺素受體表達下調、腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)高度激活、長期高動力循環(huán)狀態(tài)、內源性大麻素及炎癥介質增加、心肌細胞膜膽固醇／磷脂比例失調和離子通道改變等有關［5－6］。由于一系列神經體液因素的共同作用造成心室負荷加重、鈉水潴留、心肌的相對供血不足從而造成心肌細胞肥大和心肌間質纖維化即心室重構，心室重構是肝硬化心臟功能出現減退的比較明確的病理改變［7］。

實驗中觀察到，肝硬化大鼠在體心室血流動力學發(fā)生了改變：LVSP和±dp／dtmax都有明顯降低，提示肝硬化大鼠心臟收縮和舒張功能均受到到損傷，心肌泵血功能減弱。LDH和CK-MB是反映心肌細

胞損傷較為敏感的酶學指標。正常情況下，它們大多在細胞內、血中含量較少，肝硬化造成長期高動力循環(huán)以及一系列的神經體液因素，導致心肌能量消耗劇烈，局部耗氧增多，心肌細胞內線粒體負荷過重，大量自由基產生，引發(fā)功能紊亂，對心肌細胞的正常結構和功能起直接的損傷作用，同時膜通透性增加，細胞內蛋白漏出。肝硬化時其值的增高，也更加說明了肝硬化損傷了心肌結構的完整性。

Fig 3 Changes in TGF-β1mRNA and ColⅠmRNA of different groups

Fig 4 TGF-β1 mRNA，ColⅠmRNA agarose gel electrophoresis of different groups

心肌間質纖維化是造成心肌功能損害的重要因素之一。正常時心肌間質膠原纖維的合成與降解速度幾乎相等，以保持膠原含量的穩(wěn)定。一旦二者之間的動態(tài)平衡破壞，就會引起心室重構，最終導致功能障礙。本實驗通過Masson三色染色法及RT-PCR觀察到肝硬化時，心肌間質中膠原沉積明顯增多，Ⅰ型膠原表達增強，心肌僵硬度增加，順應性降低，造成舒張功能障礙；同時，膠原含量的增加使心肌細胞被增生的膠原包圍和封閉，影響心肌細胞力的產生與傳遞，誘發(fā)收縮功能障礙。

心肌纖維化的形成是一個緩慢的動態(tài)過程，涉及到細胞、細胞因子和ECM等多種因素、多環(huán)節(jié)間相互作用和相互調節(jié)，具體機制尚不明確。已有的急、慢性動物心肌損傷模型研究顯示，心肌肥大和心肌纖維化往往伴隨有TGF-β1基因表達的上調［8］，而且利用TGF-β1抗體中和TGF-β1也可使心肌纖維化減輕［9］。本實驗利用RT-PCR法觀察到肝硬化組心肌的TGF-β1 mRNA表達明顯高于正常對照組，推測TGF-β1可能參與促進肝硬化心肌ColⅠ的生成，促進心肌間質細胞生成，加速了肝硬化心肌間質纖維化，影響到心室重構，從而減弱了心臟的功能。

促紅細胞生成素是一種由腎臟分泌的酸性糖蛋白，可以調節(jié)紅系祖細胞增殖、分化和成熟，臨床上一直廣泛用于治療各種原因所造成的貧血。近年來陸續(xù)有報道EPO及其衍生物在心血管疾病中的保護作用，并認為調節(jié)炎癥、抑制心室重構以及促血管生成作用可能是EPO能夠用于心腦血管疾病治療的基礎［10－11］。最新資料顯示，EPO能通過降低腫瘤壞死因子及白介素的活性而提高肝硬化心肌的收縮和舒張功能［12］，且研究顯示EPO對多種原因造成的心肌纖維化都有一定的改善作用［13］，但具體機制尚不明確。本實驗觀察到，一定劑量的EPO干預后，EPO可以在一定程度上提高肝硬化大鼠心室血流動力學指標，增加肝硬化左心室的收縮力，改善心肌舒張功能；同時降低了LDH和CK-MB的水平，提示EPO可以減輕心肌細胞生物膜結構損傷，使胞質內酶釋放減少，從而降低心肌的損傷程度；TGF-β1 和ColⅠ表達水平下調進一步證明了EPO可以減少Ⅰ型膠原的形成，降低心肌間質的纖維化程度，改善

左室重構，恢復心肌順應性，發(fā)揮其對肝硬化心肌損傷的干預作用。

綜上所述，肝硬化可引起心肌結構和泵血功能發(fā)生變化，誘發(fā)心室重構，而TGF-β1的高表達對肝硬化心室重構起著非常重要的作用。EPO作為細胞保護因子，可以一定程度地減輕肝硬化對心肌的損傷，降低間質纖維的增生，改善心室重構，TGF-β1及其下游的分子信號傳導通路可能參與了這一過程，具體的機制還有待于進一步的研究和探討。

參考文獻：

［1］ Kowalski H J，Abelmann W H．The cardiac output at rest in Laen-nec′s cirrhosis［J］．Clin Invest，1953，32（10）：1025－33．

［2］ 張蔚屏，高 琴，李正紅，等．肝硬化對大鼠心肌肌球蛋白重鏈表達的影響［J］．中國臨床藥理學與治療學，2013，18（10）：1121－5．

［2］ Zhang W P，Gao Q，Li Z H，et al．Effects of liver cirrhosis on the pression of myosin heavy chain in rat myocardium［J］．Chin J Clin Pharmacol Ther，2013，18（10）：1121－5．

［3］ Abd-El-Aziz TA，Abdou M，Fathy A，et al．Evaluation of cardiac function in patients with liver cirrhosis［J］．Intern Med，2010，49 （23）：2547－52．

［4］ Finucci G，Desideri A，Sacerdoti D，et al．Left ventricular dias-tolic function in liver cirrhosis［J］．Scand J Gastroenterol，1996，31：279－84．

［5］ Ceolotto G，Papparella I，Sticca A，et al．An abnormal gene ex- pression of the beta-adrenergic system contributes to the pathogene-sis of cardiomyopathy in cirrhotic rats［J］．Hepatology，2008，48 （6）：1913－23．

［6］ Alqahtani S A，Fouad T R，Lee S S．Cirrhotic cardiomyopathy ［J］．Semin Liver Dis，2008，28（1）：59－69．

［7］ Mller S，Henriksen J H．Cirrhotic cardiomyopathy［J］．Hepatol，2010，53（1）：170－90．

［8］ Dean R G，Balding L C，Candido R，et al．Connective tissue growth factor and cardiac fibrosis after myocardial infarction［J］．Histochem Cytochem，2005，53（10）：1245－56．

［9］ Li Y，Takemura G，Okada H，et al．Reduction of inflammatory cytokine expression and oxidative damage by erythropoietin in chronic heart failure［J］．Cardiovasc Res，2006，71（4）：684－94．

［10］Moon C，Krawczyk M，Paik D，et al．Erythropoietin，modified to not stimulate red blood cell production，retains its cardioprotective properties［J］．J Pharmacol Exp Ther，2006，316（3）：999－1005．

［11］Fiordaliso F，Chimenti S，Staszewsky L，et al．A nonerythropoiet-ic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ische-mia-reperfusion injury［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102 （6）：2046－51．

［12］Liu L，Liu H，Nam S W，et al．Protective effects of erythropoietin on cirrhotic cardiomyopathy in rats［J］．Dig Liver Dis，2012，44 （12）：1012－7．

［13］Lu J，Yao Y Y，Dai Q M，et al．Erythropoietin attenuates cardiac dysfunction by increasing myocardial angiogenesis and inhibiting interstitial fibrosis in diabetic rats［J］．Cardiovasc Diabetol，2012，11：105．

Effects of EPO on expression of TGF-β1 and ColⅠin myocardium of liver cirrhosis rats

ZHANG Wei-ping，YU Ying，GAO Qin，GUO Xiao-lei，GUAN Su-dong
（Dept of Physiology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China）

Abstract：Aim To observe the effects of liver cirrho-sis on the expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）and ColⅠin rat myocardium and interven-tion of erythropoietin（EPO）．Methods Thirty-six male Sprague-Dasley rats were randomly divided into three groups：control group，liver cirrhosis group and EPO group，then the cardic hemodynamic parameters in vivo and levels of serum lactate dehydrogenase （LDH）as well as creatine kinase isoenzyme（CK-MB）were measured．With Masson′s trichrome stain，changes of collagen formation of myocardial tissue in different groups were observed．Also the mRNA ex-pressions of TGF-β1 and ColⅠin myocardium were de-tected by RT-PCR．Results In contrast to control group，rats in liver cirrhosis group showed a decline in systolic and diastolic function of left ventricule，rising myocardial enzyme，a distinct increase of cardiac colla-gen deposition，as well as an elevation of TGF-β1 and ColⅠmRNA expressions．In contrast to liver cirrhosis group，rats in EPO group demonstrated an improve-ment in systolic and diastolic function of left ventricule as well as in cardiac collagen deposition，and a de-crease in both myocardial enzyme and TGF-β1 and Col ⅠmRNA expressions．Conclusion Liver cirrhosis can lead to the changes of myocardial structure and function in rats，and it can accelerate myocardial inter-stitial fibrosis；EPO can protect the myocardial injury in liver cirrhosis rats．

Key words：liver cirrhosis；myocardium；EPO；colla-gen；cardiac function；TGF-β1

作者簡介：張蔚屏（1981－），女，碩士，講師，研究方向：心血管生理學，Tel：0552-3175269，E-mail：wpzhang982003＠aliyun．com；關宿東（1961－），男，教授，研究方向：損傷與修復，通訊作者，Tel：0552-3175270，E-mail：guansdbbmc＠163．com

基金項目：安徽省高等學校自然科學研究項目（KJ2015B058by）；安徽省自然科學基金資助項目（No 1508085QH150）

收稿日期：2015－06－20，修回日期：2015－08－09

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1398－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．015