張秋芳，譚 艷，汪選斌，潘龍瑞，李洪亮，劉 慧，向繼洲，付 琴

（1．華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥理系，湖北武漢 430071；2．湖北醫(yī)藥學(xué)院藥理教研室，湖北十堰 442000；3．湖北醫(yī)藥學(xué)院武當(dāng)特色中藥湖北省重點實驗室，湖北十堰 442000）

RISK信號通路在β2-腎上腺素受體激動劑Clenbuterol減輕心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷中的作用

張秋芳1，2，3，譚 艷2，汪選斌3，潘龍瑞2，李洪亮3，劉 慧1，向繼洲1，付 琴1

（1．華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥理系，湖北武漢 430071；2．湖北醫(yī)藥學(xué)院藥理教研室，湖北十堰 442000；3．湖北醫(yī)藥學(xué)院武當(dāng)特色中藥湖北省重點實驗室，湖北十堰 442000）

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R329.24；R392.11；R345.57；R845.22

摘要：目的 研究β2-腎上腺素受體激動劑clenbuterol對原代培養(yǎng)的心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷的作用及其是否與激活再灌注損傷挽救激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）信號通路有關(guān)。方法 將原代培養(yǎng)的新生Wistar大鼠乳鼠心肌細胞分為8組，①正常培養(yǎng)組；②缺氧／復(fù)氧（A／R）組；③clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R；④ICI118，551（10 μmol ·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組；⑤美托洛爾metoprolol（10 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組；⑥metoprolol（10μmol·L－1）＋A／R組；⑦PD98059 （20 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組；⑧LY294002（10 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組。采用MTT法測定各組細胞存活率；比色法檢測心肌細胞培養(yǎng)液的乳酸脫氫酶（LDH）含量；Hoechst 33342熒光染色法檢測細胞凋亡率；分子探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)活性氧的水平；Western blot檢測心肌細胞缺氧／復(fù)氧后ERK及 p-ERK1／2蛋白的表達水平。結(jié)果 與A／R組比較，clen-buterol＋A／R組明顯增高細胞存活率，降低LDH含量，降低細胞凋亡率，ROS產(chǎn)生減少，p-ERK1／2蛋白表達水平增高，而選擇性β2受體阻斷劑ICI 118，551可取消clenbuterol的上述作用，β1受體阻斷劑Metoprolol對clenbuterol的作用無影響，PI3K抑制劑LY294002和ERK1／2抑制劑PD98059可阻斷clenbuterol對心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷的保護作用。結(jié)論 clenbuterol能夠減輕心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷，加入選擇性β2受體阻斷劑ICI 118，551，PI3K抑制劑LY294002和ERK抑制劑PD98059均使clenbuterol的保護作用取消，表明clenbuterol可通過激動β2腎上腺素受體，激活RISK信號

通路發(fā)揮抗心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷的作用。

關(guān)鍵詞：clenbuterol；缺氧／復(fù)氧；心肌細胞；磷酸化ERK；PI3K；reperfusion injury salvage kinase（RISK）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．018．html

研究表明，再灌注損傷挽救激酶（reperfusion in-jury salvage kinase，RISK）信號系統(tǒng)，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、磷酸肌醇3激酶（PI3K）－蛋白激酶Akt途徑，p38及絲氨酸激酶JNK等［1］，在缺血／再灌中對心肌細胞起重要的保護作用，是治療急性心梗（acute myocardial infarction，AMI）的新靶點。在再灌初期，加入PI3K的抑制劑可取消缺血后處理（ischemic postconditioning）的心肌保護作用［2］。ERK抑制劑也會取消缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic precon-ditioning）的心肌保護作用［3］，提示再灌注后的補救激酶系統(tǒng)在缺血／再灌損傷中起著重要的保護作用，

也是缺血預(yù)適應(yīng)與缺血后處理共同激活的激酶系統(tǒng)［2，4－5］，是缺血預(yù)適應(yīng)與缺血后處理提供保護作用的共同通路。RISK信號系統(tǒng)的上游是G蛋白偶聯(lián)受體［1］，而β受體是GPCRs家族中的一員，提示β受體可能在保護心肌缺血／再灌注損傷中起重要的作用?？藗愄亓_（clenbuterol，Clen）作為β2受體激動劑，對血管、支氣管、子宮平滑肌都有舒張作用［6］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，clenbuterol對心肌細胞具有促“生理”性增生肥大作用［7］。而對右心衰后右心收縮功能有改善作用。臨床上已將clenbuterol應(yīng)用于心力衰竭患者除去左室輔助裝置后的恢復(fù)治療［8］。雖然Burniston等［9－10］報道clenbuterol可誘導(dǎo)正常健康大鼠心肌出現(xiàn)凋亡，但Xydas等［11］和Ahmet等［12］發(fā)現(xiàn)clenbuterol及其他選擇性β2受體激動劑fenoterol或zinterol等可改善冠脈左前降支（LAD）結(jié)扎后的心室舒張功能。Clenbuterol還可減少缺血性心肌病左室重塑，降低心肌細胞凋亡，改善鈣穩(wěn)態(tài)等；另外，clenbuterol還可上調(diào)暫時性前腦缺血模型中的Bcl-2／Bax［13］。而本課題組已經(jīng)報道clenbuterol對缺血／再灌注的心肌細胞有抗凋亡作用［14－15］，但clenbuterol對缺血／再灌注損傷的保護作用是否與RISK通路有關(guān)，需進一步探索。本實驗擬采用原代培養(yǎng)心肌細胞，建立缺氧／復(fù)氧實驗?zāi)Ｐ鸵阅M缺血／再灌注損傷，觀察clenbuterol對缺氧／復(fù)氧損傷的作用，并采用PI3K／Akt抑制劑LY294002和ERK1／2抑制劑PD98059，探索clen-buterol對缺氧／復(fù)氧損傷的保護作用是否與RISK信號通路有關(guān)。

1　材料與方法

1．1藥品與試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS）購自杭州四季青公司；胰蛋白酶購自Amerco公司；PD98059 （167869-21-8）和LY294002（154447-36-6）購自Pro-mega corporation公司；ICI 118，551、克倫特羅（clen-buterol）（批號：MFCD00083280）、膠原酶I（批號：MFCD00130830）和Hoechst33342（批號：MFCD00012678）購自Sigma；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ROS試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為市售分析純。

1．2乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng) 取新生1～2 d Wist-ar乳鼠（由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗中心提供），在無菌條件下，在其劍突下剪開十字切口，取下心臟下1／3，用預(yù)冷D-Hanks洗去殘血，將心肌組織剪碎，并用冷D-Hanks清洗3遍，加入0.08%胰酶37℃消化1次，然后以0.08%膠原酶37℃消化數(shù)次，每次10 min，棄去第1次消化所得上清液，收集其余幾次消化所得上清液，以1∶1（體積）加入含10%胎牛血清高糖DMEM終止消化，1 000 r· min－1離心10 min，棄去上清，以含10%胎牛血清高糖DMEM重懸細胞，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，用差速貼壁法于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min，使成纖維細胞貼壁，然后轉(zhuǎn)移細胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細胞密度至2×108·L－1，并加入終濃度為0.1 mmol·L－15-Br-dU（Sigma-Aldrich）以抑制成纖維細胞的生長，接種至24、96或6孔板內(nèi)，置入CO2細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3 d后，更換無血清的培養(yǎng)基同步化12h開始做實驗。

1．3建立心肌細胞缺氧／復(fù)氧（anoxia／reoxygen-ation，A／R）損傷模型 心肌細胞生長接近融合狀態(tài)，呈現(xiàn)同步搏動時開始實驗。模擬缺血溶液（mmol·L－1：NaCl 98.5，KCl 10，NaCl 98.5，KCl 10，MgSO41.2，CaCl21.0，HEPES 20，sodium lac-tate 40，pH 6.8）。以95%N2＋5%CO2預(yù)飽和1 h，將培養(yǎng)的細胞以擬缺血溶液置換無血清的培養(yǎng)基，并置于95%N2＋5%CO2，37℃的密閉容器中，持續(xù)正壓通混合氣95%N2＋5%CO2，為心肌細胞缺氧即缺血；然后恢復(fù)心肌細胞的有糖復(fù)氧液（mmol· L－1：NaH2PO40.9，NaHCO320.0，CaCl21.0，Mg-SO41.2，HEPES 20.0，NaCl 129.5，KCl 5.0，glu-cose 5.5，pH 7.4，37℃）［16］于37℃，95%空氣＋5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為心肌細胞復(fù)氧即再灌。心肌細胞缺氧培養(yǎng)4 h和復(fù)氧培養(yǎng)2 h后做相應(yīng)指標(biāo)的檢測。

clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組。

1．5MTT法檢測細胞存活率 細胞存活率通過活細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶將MTT還原紫色結(jié)晶物甲（Formazan）的量來判斷。按實驗分組作相應(yīng)處理，處理結(jié)束后，每孔加入終濃度為0.5 g·L－1MTT，37℃孵育4 h后，吸棄上清液，PBS洗1次，加入150 μL DMSO，待結(jié)晶完全溶解后，以620 nm為參比，用酶標(biāo)儀在波長570 nm測定吸光度值（OD），按公式：細胞存活率／%＝（測定孔OD－空白孔OD）／（對照孔OD－空白孔OD）×100%。

1．6培養(yǎng)液中LDH測定 造模給藥處理后收集培養(yǎng)液，按LDH試劑盒說明操作，采用化學(xué)比色法測定LDH的釋放量。

1．7ROS的測定 原代心肌細胞按上述實驗分組處理結(jié)束后，用溫HBSS／Ca／Mg液輕柔洗心肌細胞1次，96孔板每孔加入100 μL的終濃度為10 μmol ·L－1的DCFH-DA，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用溫HBSS／Ca／Mg液輕柔洗心肌細胞3次，用熒光酶標(biāo)儀測定OD值，DCFH-DA波長選擇Ex／Em：488／525 nm。陽性對照孔中加入終濃度100 μmol·L－1的H2O2，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。

1．8Western blot檢測心肌細胞P-ERK的水平經(jīng)處理后用RIPA裂解細胞，BCA法蛋白定量。將蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h，加入p-ERK 和ERK2一抗，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h。加入ECL反應(yīng)體系，曝光，成像，利用Syngene凝膠成像分析系統(tǒng)，計算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

1．9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD（least sig-nificant difference）檢驗。

2　結(jié)果

2．1不同濃度的clenbuterol對缺氧／復(fù)氧后心肌細胞存活率的影響 結(jié)果顯示，缺氧／復(fù)氧組與正常對照組相比，細胞存活率降低（60.40%±1.60%，P ＜0.01）。而不同濃度的clenbuterol（0.1、1、10 μmol·L－1）＋A／R組與A／R組相比，只有clen-buterol（1 μmol·L－1）＋A／R組的細胞存活率與A／R組間差異有顯著性（70.67%±4.81%vs 60.40%±1.60%，P＜0.05），這為clenbuterol濃度的選擇提供依據(jù)（Fig 1）。

班主任擔(dān)負(fù)著教書和育人的雙重任務(wù)，對學(xué)生的個性心理品質(zhì)培養(yǎng)，行為習(xí)慣的培養(yǎng)，以及學(xué)習(xí)態(tài)度培養(yǎng)起著巨大的作用。因此，讓每一個班主任上崗前就具備扎實的理論知識和先進的管理理念，不能再摸著石頭過河，這樣浪費的是學(xué)生的時間，同時有可能讓學(xué)生喪失學(xué)習(xí)的興趣。

2．2clenbuterol對缺氧／復(fù)氧后心肌細胞存活率和LDH的影響 缺氧／復(fù)氧組與正常對照組相比細胞存活率明顯降低，培養(yǎng)液中LDH釋放量增高（P＜ 0.01）；clenbuterol＋A／R組、metoprolol＋A／R組和clenbuterol＋metoprolol＋A／R組與A／R組相比，細胞存活率增高，LDH釋放量減少（P＜0.05）；而ICI 118，551＋clenbuterol＋A／R組與A／R組差異無顯著性（Fig 2、3）。

Fig 1 Effect of different concentrations of clenbuterol on viability of cardiomycytes subjected to 4 h of anoxia／2h of reoxygenation（A／R）

Fig 2 Effect of clenbuterol，Metoprolol and in combination on viability of cardiomycytes subjected to 4 h of anoxia／2h of reoxygenation（A／R）．Cell viability was measured by MTT assay as decribed in the material and｜methods section

2．3clenbuterol對缺氧／復(fù)氧后心肌細胞ROS產(chǎn)生的影響 正常培養(yǎng)組心肌細胞只產(chǎn)生少量ROS，缺氧／復(fù)氧組ROS明顯增加（與正常培養(yǎng)組相比，P ＜0.01）；clenbuterol＋A／R組，metoprolol＋A／R組，clenbuterol＋metoprolol＋A／R組與A／R組相比較，ROS產(chǎn)生明顯減少（與缺氧／復(fù)氧組比較，P＜

0.05）；ICI 118，551＋clenbuterol＋A／R組與A／R組相比差異沒有顯著性（P＞0.05），但與clenbuterol＋A／R組相比，ROS明顯增高；而clenbuterol＋meto-prolol＋A／R組與clenbuterol＋A／R組相比較，差異無顯著性（Fig 4）。

Fig 3 Effects of Metoprolol，clenbuterol and clenbuterol combination with ICI or Metoprolol on LDH activity in cardiomyocytes subjected to anoxia／reoxygenation（A／R）

Fig 4 Effects of clenbuterol，metoprolol，and clenbuterol combination with ICI or Metoprolol on the formation of ROS induced by A／R in cardiomyocytes

2．4ERK抑制劑PD98059對clenbuterol抗缺氧／復(fù)氧后心肌細胞損傷的影響 為了進一步探討ERK1／2途徑是否參與clenbuterol對缺氧／復(fù)氧心肌細胞的保護作用，本實驗預(yù)先給予ERK1／2抑制劑PD98059，采用MTT法檢測缺氧／復(fù)氧后心肌細胞的存活率，用Hoechst熒光染色觀察心肌細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，缺氧／復(fù)氧組與正常培養(yǎng)組比較，細胞生存率下降至63%，凋亡率升高至48%。而給予clen-buterol后，缺氧／復(fù)氧后存活率上升至70%，凋亡率降低24.6%，但預(yù)先加入PD98059后，細胞存活率下降至56%，凋亡率（50.8%）比clenbuterol＋A／R組高，并差異具有顯著性（P＜0.05）。（Fig 5、6）。

2．5PI3K抑制劑LY294002對clenbuterol抗缺氧／復(fù)氧后心肌細胞損傷的影響 為了進一步觀察PI3K／Akt途徑是否參與clenbuterol對缺氧／復(fù)氧心肌細胞的保護作用，本實驗預(yù)先給予PI3K抑制劑LY294002，MTT法檢測缺氧／復(fù)氧后的存活率和Ho-echst熒光染色檢測細胞凋亡率。與正常培養(yǎng)組相比，缺氧／復(fù)氧組細胞存活率明顯下降，凋亡率明顯上升（P＜0.01）。而預(yù)先給予clenbuterol后，細胞存活增加，凋亡率下降。但預(yù)加入LY294002后，clen-buterol對缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)細胞損傷的保護作用被取消（Fig 5、6）。

Fig 5 Effects of clenbuterol and combination with LY294002（LY）or PD98059（PD）on viability of cardiomyocytes subjected to anoxia／reoxygenation（A／R）

2．6對心肌細胞p-ERK的表達水平的影響 各組缺氧復(fù)氧后心肌細胞ERK2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但缺氧／復(fù)氧組p-ERK蛋白水平比正常培養(yǎng)組降低，而clenbuterol＋A／R組較缺氧／復(fù)氧組p-ERK蛋白水平明顯增高（P＜0.01），加入ERK1／2阻斷劑PD98059后，p-ERK蛋白表達水平明顯降低；而PI3K／Akt阻斷劑LY294002對clenbuterol誘導(dǎo)的ERK磷酸化無阻斷作用（Fig 7）。

Fig 6 Effects of Clenbuterol and combination with LY294002（LY）or PD98059（PD）on A／R-induced apoptosis as stained by Hoechst 33342

Fig 7 Effects of clenbuterol and combination with LY294002（LY）or PD98059（PD）on the expressions of p-ERK1／2 in cardiomyocytes subjected to anoxia／reoxygenation（A／R）．

3　討論

有研究表明，心肌缺血／再灌注損傷涉及多方面因素，如自由基大量堆積、細胞內(nèi)超載、炎癥因子釋放等。心肌缺血／再灌注過程，大量的氧自由基爆發(fā)式產(chǎn)生，氧自由基通過過氧化生物膜上的多價不飽和脂肪酸和產(chǎn)生的過氧化物損傷心肌細胞膜，并刺激線粒體細胞色素C釋放，后者進一步激活Caspase信號，誘導(dǎo)細胞凋亡［17］。LDH是細胞損傷程度的標(biāo)志。正常生理情況下，LDH存在于心肌細胞內(nèi)，只有當(dāng)細胞膜受損，通透性發(fā)生改變時，LDH才會外漏，所以通常檢測LDH評價細胞損傷的程度。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧／復(fù)氧后心肌細胞存活率降低，LDH釋放增多，表明缺氧／復(fù)氧后心肌受到嚴(yán)重?fù)p傷，ROS產(chǎn)生增多，給予clenbuterol可增加原代培養(yǎng)新生大鼠乳鼠的心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷存活率，減少LDH釋放量，降低ROS，這說明β2-腎上腺素受體激動劑clenbuterol可通過減少氧自由基的產(chǎn)生，降低缺氧／復(fù)氧損傷，從而發(fā)揮對心肌細胞有保護作用，而β2-腎上腺素受體阻斷劑ICI 118，551可以取消上述作用，而β1-腎上腺素受體阻斷劑美托洛爾不能阻斷clenbuterol的作用，但兩者之間也無協(xié)同作用，表明clenbuterol是通過激動β2-腎上腺素受體而對缺氧／復(fù)氧損傷發(fā)揮保護作用。

RISK信號系統(tǒng)包括PI3K-Akt和ERK途徑［18］。Tong等［2］首次確定PI3K-Akt途徑的作用，在離體再灌心臟模型發(fā)現(xiàn)預(yù)適應(yīng)能增加Akt的磷酸化，而其磷酸化抑制劑wortmannin和LY294002能取消缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1／2）是MAPK家族中的一員，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、存活。缺血／再灌、低氧或激動β受體等可活化ERK1／2。雖然有少部分學(xué)者對p-ERK在缺血后再灌中的有爭議；大部分學(xué)者都認(rèn)為激活ERK有利于細胞的存活，如ERK磷酸化也參與了缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用［19］，而MEK-1抑制劑PD98059也可取消缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用。RISK的上游是G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）。研究表明，許多藥物或內(nèi)源肽（如Urocorin、腎上腺

髓質(zhì)素等）都可通過激活GPCR，從而激活RISK從而對缺血／再灌后損傷的心肌細胞產(chǎn)生保護作用。而β受體是GPCRs家族中的一員，提示β受體可能在保護心肌缺血／再灌注損傷中起重要的作用。Stevens等［20］研究表明，clenbuterol主要通過β2-AR／Gi信號途徑，改善心肌病理性損傷，減輕凋亡。Lochner等［21］研究發(fā)現(xiàn)，Isopreterol提供的心肌保護作用與缺血預(yù)適應(yīng)相似［21］。Tong等［22］也證明在β2受體被敲除的小鼠心肌，缺血預(yù)適應(yīng)并不能保護心肌細胞。Hedin等［23］研究表明：在培養(yǎng)的成熟大鼠心肌細胞，β2受體激動劑的抗凋亡作用可能是通過激活ERK。最近研究報道，選擇性β2-受體激動劑Zinterol對原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌低氧和H2O2引起的凋亡有保護作用，并且是通過Gi偶聯(lián)受體，激活下游的PI3K／Akt發(fā)揮效應(yīng)的［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，clenbuterol在保護缺氧／復(fù)氧損傷心肌細胞的同時，亦可提高p-ERK1／2水平，而應(yīng)用ICI118551阻斷β2受體或LY294002阻斷PI3K／Akt通路或PD98059阻斷ERK1／2信號通路，均可明顯抑制clenbuterol對心肌的保護作用，表現(xiàn)為細胞存活率下降，LDH釋放量增高，細胞凋亡率增加。

大量的動物實驗和臨床應(yīng)用病例都證實，β1受體拮抗劑具有抗氧化、抗凋亡和膜穩(wěn)定作用，對缺血／再灌心肌有保護作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心肌細胞缺氧－復(fù)氧模型單獨給予metoprolol中可提高細胞存活率，降低LDH及ROS，減少心肌細胞凋亡。這與文獻報道相一致，但與clenbuterolol聯(lián)合應(yīng)用既不能抑制clenbuterolo對缺氧／復(fù)氧損傷的保護作用，也無協(xié)同抗心肌細胞凋亡作用。

綜上所述，clenbuterol對缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的心肌細胞損傷的保護作用與激動β2-AR，激活RISK信號通路有關(guān)，關(guān)于clenbuterol對其通路上下游蛋白的影響，本實驗未進行驗證，仍需進一步研究。

（致謝：本實驗在華中科技大同濟醫(yī)學(xué)院藥理系向繼洲實驗室完成，感謝實驗室老師與同學(xué)提供的大力幫助。）

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Role of RISK signal pathway in reducing clenbuterol-induced cardiomycytes A／R injury of neonatal rat

ZHANG Qiu-fang1，2，3，TAN Yan2，WANG Xuan-bin3，PAN Long-rui2，LI Hong-liang3，LIU Hui1，XIANG Ji-zhou1，F(xiàn)U Qin1
（1．Dept of Pharmacology，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430071，China；2．Dept of Pharmacology，Hubei University of Medicine，Shiyan Hubei 442000，China；3．Hubei Key Laboratory of Wudang Local Chinese Medicine Research（Hubei University of Medicine，Shiyan Hubei 442000 China）

Abstract：Aims To study the effects of clenbuterol on anoxia／reoxygenation（A／R）injury in neonatal Wistar rat cardiomyocytes and to explore whether its mecha-nism is related to reperfusion injury salvage kinase （RISK）or not．Methods The cultured primary neo-natal cardiomyocytes were randomly divided into eight groups：①normal culture group；②anoxia／reoxygen-ation（A／R）group；③clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R；④ICI118，551（10 μmol·L－1）＋clenbuterol （1 μmol·L－1）＋A／R；⑤Metoprolol（10μmol· L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R group；⑥Metoprolol（10 μmol·L－1）＋A／R group；⑦PD98059（20 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol· L－1）＋A／R group；⑧LY294002（10 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R group．Cell via-bility was determined by the conventional MTT reduc-tion assay．The content of LDH in cultured medium was measured with colorimetry．Cardiomyocyte apopto-sis was determined by Hoechst33342．Intracellular re-active species（ROS）were monitored by the fluorescent DCFH-DA．Total ERK2 and phosphorylated ERK were detected by western blot．Results Compared with A／R group，clenbuterol significantly increased vaibility of cells，reduced LDH release，lowered the rate of apop-tosis and ROS production．When added β2receptor an-tagonist ICI118，551，PI3K inhibitor LY294002 and ERK inhibitor PD98059，the effects of clenbuterol a-bove were inhibited；but β1 receptor antagonist Meto-prolol protected the cardiomyocytes from A／R injury，as evidenced by decreased LDH release and increased cell viability．There were no synergistic effects in the combined use of clenbuterol and Metoprolol．Conclu-sion clenbuterol exerts cardioprotective effects against A／R injury by inhibiting oxidative stress and apopto-sis．The protection of clenbuterol is inhibited by ICI118，551，LY294002 and PD98059．clenbuterol protects cardiomyocytes against A／R injury via RISK pathway by activation of β2receptor．

Key words：clenbuterol；anoxia／reoxygenation；car-diomyocyte；phosphorylation extracellular signal-activa-ted kinase（ERK）；PI3K；reperfusion injury salvage kinase（RISK）

作者簡介：張秋芳（1973－），女，博士，副教授，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：zqf1112000＠163．com；付 琴（1974－），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：fu＿qin＠aliyun．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81303254，81102438）；湖北省教育廳重點項目（No D20122402）；湖北醫(yī)藥學(xué)院項目（No 2010QDJ12和2012GPY11）；武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點實驗室資助項目（No WDCM003）

收稿日期：2015－06－29，修回日期：2015－08－05

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1368－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．009