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國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心

編者按:國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心(四川大學(xué))顧忠偉課題組的主要研究方向涉及生物醫(yī)用高分子、藥物/基因高效傳遞系統(tǒng)、功能納米生物材料與有序組裝等，從可控合成、結(jié)構(gòu)調(diào)控、新功能與多功能構(gòu)筑等方面做了一系列開(kāi)創(chuàng)性工作。近5年來(lái)，在AdvMater,AngewChemIntEd,ACSNano,AdvFunctMater,Biomaterials,JControlRel,Small等國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文150余篇，國(guó)際及全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議提交報(bào)告摘要100余篇；獲授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利20余項(xiàng)；編寫及翻譯10余部專著及章節(jié)(含英文專著/章節(jié)),研究成果得到了國(guó)際國(guó)內(nèi)學(xué)術(shù)界的高度評(píng)價(jià)。

肽類樹(shù)狀大分子的可控合成、選擇性功能化與生物醫(yī)學(xué)功能構(gòu)筑

在國(guó)際上率先建立了用“點(diǎn)擊化學(xué)”可控合成結(jié)構(gòu)精確規(guī)整、分子量單一，并由不同氨基酸組成的鏈結(jié)構(gòu)有序排列的高代數(shù)(≥5代)肽類樹(shù)狀大分子(PD)新技術(shù)；建立了以表面含多官能團(tuán)的無(wú)機(jī)納米粒(如：八官能團(tuán)倍半硅氧烷(POSS)、超順磁氧化鐵納米粒(SPIO)、介孔二氧化硅等)為核可控合成PD，以及選擇性多功能化PD的新技術(shù)和新方法；為深入開(kāi)展新一代肽類樹(shù)狀大分子生物醫(yī)用高分子材料的研究奠定了基礎(chǔ)。主要成果：①成功研發(fā)了具有靶向功能的肽類樹(shù)狀大分子磁共振(MRI)分子探針，解決了單個(gè)PD分子上靶向基團(tuán)(硫代半乳糖)與顯影基團(tuán)(Gd-DTPA)精確調(diào)控的難題；發(fā)現(xiàn)PD的多價(jià)特征和納米尺度效應(yīng)使該系列MRI分子探針顯示出良好的水相弛豫率、成像質(zhì)量，以及高出臨床試劑～7倍的信號(hào)強(qiáng)度，并具有血液長(zhǎng)循環(huán)特點(diǎn)；揭示了探針的生物學(xué)效能與PD外圍官能團(tuán)分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、數(shù)量等具有相關(guān)性，調(diào)控PD外圍功能團(tuán)可實(shí)現(xiàn)低Gd (III)含量下MRI的高效能成像，以及高的水相弛豫率(達(dá)臨床試劑的～10倍)。②研發(fā)了結(jié)構(gòu)精確的高代數(shù)雜化肽類樹(shù)狀大分子，發(fā)現(xiàn)了肽類樹(shù)狀大分子的分子結(jié)構(gòu)、鏈結(jié)構(gòu)及其序列分布與基因轉(zhuǎn)染效率及生物安全性之間的關(guān)系與規(guī)律，獲得了數(shù)倍于國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)聚乙烯亞胺(PEI)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的PD非病毒基因載體。③利用特定生物微環(huán)境可觸發(fā)斷裂的動(dòng)態(tài)化學(xué)鍵(腙鍵、肽鍵、配位鍵等)構(gòu)建了PD外圍的生物活性功能分子，研發(fā)了系列基于肽類樹(shù)狀大分子的高效能藥物遞送系統(tǒng)；首次發(fā)現(xiàn)并確證了酶促分子的肽鍵斷裂位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了高分子偶聯(lián)藥物在腫瘤組織的快速及精確控釋，保持了藥物分子結(jié)構(gòu)的完整性并維持其生理活性；生物分布顯示鉑類藥物在腫瘤組織的富集量超過(guò)了8%(是文獻(xiàn)報(bào)道同類藥物遞送系統(tǒng)的兩倍以上，臨床藥物的25倍)，為解決藥物遞送系統(tǒng)在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性與腫瘤組織/細(xì)胞內(nèi)藥物快速釋放(高富集)這一矛盾奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

圖1　肽類樹(shù)狀大分子納米載藥系統(tǒng)(a)，顯著調(diào)高抗腫瘤效果(b)和腫瘤部位高聚集(c)

肽類樹(shù)狀大分子可控超分子自組裝及仿生生物醫(yī)學(xué)功能構(gòu)筑

于國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)了特定端基的線型多肽與肽類樹(shù)狀大分子能發(fā)生“協(xié)同自組裝”現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了肽類樹(shù)狀大分子聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的有序調(diào)控，建立了低代數(shù)PD與聚氨基酸協(xié)同自組裝的方法，發(fā)現(xiàn)了分子間的弱相互作用形成了α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)，并驅(qū)動(dòng)組裝基元形成了具有多層次結(jié)構(gòu)的仿病毒衣殼，揭示了肽類組裝基元的pH感知特性，賦予了肽類樹(shù)狀大分子組裝體的細(xì)胞微環(huán)境響應(yīng)性，實(shí)現(xiàn)了高效的藥物和基因遞送功能。構(gòu)建了低代數(shù)雜化PD在量子點(diǎn)QD表面的光促模板組裝的新方法，發(fā)現(xiàn)了生物醫(yī)學(xué)功能組裝增強(qiáng)的機(jī)理，獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比相應(yīng)的PD高出5萬(wàn)倍，而且在體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染特別是p53抑癌功能基因的表達(dá)也十分顯著，并實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與示蹤。發(fā)現(xiàn)具有精確結(jié)構(gòu)并富含色氨酸的肽類樹(shù)狀大分子能與腫瘤細(xì)胞的DNA發(fā)生超分子反應(yīng)而使其凋亡，揭示了三維空間結(jié)構(gòu)、高度支化并富含外圍功能團(tuán)的PD抑制腫瘤細(xì)胞乃至耐藥腫瘤細(xì)胞等生物功能倍增效應(yīng)的機(jī)理，開(kāi)創(chuàng)了治療性肽類樹(shù)狀大分子這一新的研究方向。

圖2　治療型肽類樹(shù)狀大分子結(jié)構(gòu)式及其抗腫瘤機(jī)制(a),肽類樹(shù)狀大分子二元協(xié)同自組裝策略及仿病毒衣殼組裝體納米結(jié)構(gòu)(b),肽類樹(shù)狀大分子自組裝/解組裝機(jī)制及其藥物控釋(c)和肽類樹(shù)狀大分子光促模板組裝策略及其可示蹤的基因遞送系統(tǒng)(d)

生物降解高分子仿病毒基因遞送系統(tǒng)

受病毒結(jié)構(gòu)和功能的啟發(fā)，仿病毒基因遞送系統(tǒng)得到了業(yè)界高度的關(guān)注。課題組取得的成果如下：①提出了利用著名的特洛伊木馬(Trojan Horse)策略，構(gòu)建了基于雙硫鍵修飾的透明質(zhì)酸衍生物仿病毒包膜，克服了基因遞送系統(tǒng)體內(nèi)循環(huán)及靶向的生理屏障，并揭示其規(guī)律與作用機(jī)理；利用雙硫/雙硒鍵特定生物微環(huán)境敏感斷裂，提出了分級(jí)解組裝與基因程序化控釋的策略，構(gòu)建了具有仿病毒衣殼和包膜的基因靶向遞送系統(tǒng)，經(jīng)靜注后體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效率提高了150倍以上，實(shí)現(xiàn)了仿病毒基因遞送系統(tǒng)在血液循環(huán)中酶解保護(hù)、靶向及腫瘤靶組織/細(xì)胞的高效表達(dá)；成功介導(dǎo)抑癌基因p53抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，為研發(fā)高效能仿病毒基因靶向遞送系統(tǒng)提出了新的設(shè)計(jì)理念。②利用特定氨基酸持有的如穿膜、質(zhì)子海綿等功能，設(shè)計(jì)構(gòu)建了基于殼聚糖-氨基酸的仿病毒包膜的基因遞送系統(tǒng)，使多個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率提高近千倍，而體內(nèi)基因表達(dá)也超過(guò)PEI百余倍，闡明了促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞、DNA逃逸與入胞是大幅度提升細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵緣由。③針對(duì)腫瘤組織及細(xì)胞內(nèi)弱酸性以及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度比循環(huán)系統(tǒng)高千余倍的微環(huán)境特征，利用腙鍵、雙硫鍵等構(gòu)建了動(dòng)態(tài)“隱身”功能的仿病毒基因遞送系統(tǒng)，確證了特定細(xì)胞微環(huán)境能觸發(fā)動(dòng)態(tài)化學(xué)鍵斷裂而解離PEG并顯著提高基因轉(zhuǎn)染，為解決利用PEG長(zhǎng)循環(huán)功能并消除其影響基因轉(zhuǎn)染之弊端提供了新的設(shè)計(jì)思路；發(fā)現(xiàn)了Schiff-base碳氮雙鍵在弱酸環(huán)境斷裂導(dǎo)致DNA復(fù)合物的解組裝與DNA釋放，以及咪唑分子介導(dǎo)DNA的內(nèi)涵體逃逸是提高基因轉(zhuǎn)染效率的重要因素；為研發(fā)隱身可控的仿病毒基因遞送系統(tǒng)研究奠定了基礎(chǔ)。

圖3　可分級(jí)解組裝及基因程序化控釋的仿病毒基因遞送系統(tǒng)的組裝、解組裝及DNA程序化釋放(a)，介導(dǎo)抑癌基因p53(b)和報(bào)告基因的仿病毒基因遞送系統(tǒng)(c)

生物降解高分子與先進(jìn)藥物遞送系統(tǒng)

圖4　具有立構(gòu)復(fù)合結(jié)構(gòu)的雙殼-核納米載藥系統(tǒng)(a)，成膠速度快并可逆的水凝膠(b)，具有π-π共軛結(jié)構(gòu)高分子膠束(c)和集腫長(zhǎng)循環(huán)、瘤微環(huán)境敏感和線粒體靶向的多功能脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)(d)

生物降解高分子是構(gòu)建先進(jìn)藥物遞送系統(tǒng)的重要基礎(chǔ)。課題組重要研究成果如下：①于國(guó)際上率先創(chuàng)建了基于環(huán)狀碳酸酯的可控化學(xué)交聯(lián)聚合的新方法，獲得了一系列具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚碳酸酯聚/共聚物，解決了低分子量(<15萬(wàn))聚碳酸酯在生理環(huán)境易發(fā)生蠕變，而高分子量聚碳酸酯體內(nèi)降解速率快的關(guān)鍵難題；發(fā)現(xiàn)了交聯(lián)與共聚分子/鏈結(jié)構(gòu)調(diào)控降解行為的協(xié)同作用，揭示了體內(nèi)外的降解規(guī)律與調(diào)控機(jī)制，創(chuàng)建了基于聚碳酸酯的恒速釋藥功能；研發(fā)了聚合-成型一體化技術(shù)，克服了交聯(lián)聚合物難于加工成型的關(guān)鍵瓶頸；為無(wú)酸性降解產(chǎn)物的長(zhǎng)效恒速釋藥埋植劑的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。②提出了弱酸環(huán)境觸發(fā)咪唑基團(tuán)質(zhì)子化并溶脹高分子納米載藥系統(tǒng)使藥物快速釋放的策略，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了以生物降解聚丙交酯為疏水鏈段、聚組氨酸與PEG為親水鏈段的雙殼-核生物觸發(fā)式高分子納米載體，建立了精確定量調(diào)控其嵌段共聚組成比的方法；發(fā)現(xiàn)納米粒尺度在pH由中性降低至聚組氨酸鏈段pKa值時(shí)增加近20倍，獲得了弱酸環(huán)境觸發(fā)的藥物快速釋放，明顯增強(qiáng)了抗腫瘤效果。研究還發(fā)現(xiàn)具有不同光學(xué)異構(gòu)體聚丙交酯鏈段的三嵌段共聚物在水相自組裝形成立構(gòu)復(fù)合的雙殼-核納米載體，使其臨界凝聚濃度降低90%，實(shí)現(xiàn)了雙殼-核納米載藥系統(tǒng)在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的高穩(wěn)定性。③提出了基于藥物-載體材料相互作用構(gòu)建新型高分子載藥膠束的思想，設(shè)計(jì)合成了一系列具有π-π共軛結(jié)構(gòu)小分子疏水單元以替代傳統(tǒng)高分子膠束中生物降解疏水高分子鏈的新型高分子膠束，系統(tǒng)揭示了疏水單元結(jié)構(gòu)及藥物-載體間的π-π作用對(duì)載藥膠束性能的影響規(guī)律，獲得了臨界膠束濃度(CMC)比傳統(tǒng)高分子膠束低一個(gè)數(shù)量級(jí)、載藥量高3倍的高穩(wěn)定性載藥膠束材料。以光動(dòng)治療中的光敏劑卟啉為疏水單元，構(gòu)建了集化療和光動(dòng)治療于一體的具有聯(lián)合治療功能的高分子膠束載藥系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了腫瘤高效治療過(guò)程中的實(shí)時(shí)成像。④脂質(zhì)體是最具臨床使用價(jià)值的載藥遞送系統(tǒng)。我們以脂質(zhì)體的體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)及腫瘤細(xì)胞器靶向等關(guān)鍵問(wèn)題為切入點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建了具有pH觸發(fā)電荷翻轉(zhuǎn)及靶向細(xì)胞線粒體的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體；發(fā)現(xiàn)了其負(fù)電荷表面降低了非特異性蛋白吸附而減少蛋白暈(Protein Corona)，避免了傳統(tǒng)PEG化脂質(zhì)體重復(fù)使用而產(chǎn)生抗體并引發(fā)加速血液清除(ABC)的現(xiàn)象，而且由于電荷翻轉(zhuǎn)還大幅度提高了細(xì)胞內(nèi)吞(>8倍)；實(shí)現(xiàn)了線粒體的有效靶向和藥物的高富集，加速了腫瘤耐藥細(xì)胞的凋亡，提高了抗腫瘤效果，為克服腫瘤治療中的多藥耐藥(MDR)這一世界性難題提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

(國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心顧忠偉)