王 雪， 劉燕隔， 逯家輝， 王春月， 賈冰璇， 孟慶繁， 張 洋， 王 迪

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130012)

·研究報(bào)告——生物質(zhì)活性成分·

黃芩中抗菌有效成分提取工藝研究

王 雪， 劉燕隔， 逯家輝， 王春月， 賈冰璇， 孟慶繁， 張 洋， 王 迪*

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130012)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時(shí)間和液料比為影響因素,應(yīng)用 Box-Behnken中心組合進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),以對白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑作為響應(yīng)值,對結(jié)果進(jìn)行多元線性和二項(xiàng)式擬合,采用響應(yīng)面(RSA)法選取黃芩中抗菌有效成分提取的最佳工藝條件。最佳工藝條件為:提取溫度61 ℃，提取時(shí)間2 h，液料比13∶1(mL∶g),經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得黃芩水提物質(zhì)量濃度為0.5 g/mL時(shí)，抑菌圈平均直徑為12.637 mm，與預(yù)測值12.665 mm接近，陽性對照枯草桿菌肽的平均抑菌圈直徑為11.85 mm，表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黃岑水提物對白色念珠菌的抑菌作用顯著。

黃芩；抗菌成分；提取工藝；中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。黃芩的粗提物及其活性部位、單體具有抗真菌、抗突變、抗炎癥、抗血管平滑肌增殖、抗氧化和抗腫瘤等多方面的藥理活性和很好的臨床價(jià)值[1-5]。白念珠菌(Canidiaalbicans)是臨床最常見的女性婦科疾病致病真菌[6]，目前治療婦科炎癥類疾病的抗生素和化學(xué)合成類藥物極為有限, 且毒副作用較大,中草藥在抗白念珠菌感染的預(yù)防和治療中的應(yīng)用克服了上述問題[7],大量研究表明,黃芩對白念珠菌等深部真菌感染有良好的抗菌作用[8]。 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法(RSM)能將多因素試驗(yàn)中各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的復(fù)雜關(guān)系，以多元二次回歸方程表示，簡單、快速地對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面的研究，并得到最優(yōu)化參數(shù)[9]，被廣泛的應(yīng)用于中藥提取工藝優(yōu)化[10]、菌粉發(fā)酵工藝優(yōu)化[11]及胞內(nèi)有效成分提取優(yōu)化[12]中。本研究采用響應(yīng)面法對黃芩抗菌有效成分提取工藝進(jìn)行研究，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合模型，研究了提取溫度、提取時(shí)間和液料比對黃芩中抗菌有效成分的影響以及各因素之間的相互作用，確定了最優(yōu)的提取工藝，為黃芩抗菌、抗病毒新藥的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

黃芩藥材購自吉林省龍康藥業(yè)有限公司。白色念珠菌購自中國藥品生物制品檢定所(ATCC 10231)。陽性對照藥枯草桿菌肽購于上海，阿拉丁試劑；酵母浸粉、蛋白胨,均為BR,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉,AR；瓊脂粉,生化試劑。

HDM-2000回流裝置,北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；BS2243電子分析天平；ZHJH-C1109C超凈工作臺(tái),上海智城分析儀器制造有限公司；HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；Mf 3菌落自動(dòng)計(jì)數(shù)多功能一體機(jī),杭州迅數(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 LB液體培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，以NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4,121 ℃高壓滅菌30 min,備用。 LB固體培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L,蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，以NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，瓊脂粉20 g/L,121 ℃高壓滅菌30 min,備用。

1.2.2 菌種的活化 菌株于實(shí)驗(yàn)前接種于沙氏斜面,37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2次, 使之處于對數(shù)生長期,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),以沙氏液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至106CFU/mL。

1.2.3 抑菌效果的測定 采用濾紙片平板擴(kuò)散法測抑菌效果。用無菌移液管取0.5 mL菌濃度為106CFU/mL的菌懸液于濕熱滅菌的培養(yǎng)皿中,再將經(jīng)高壓蒸氣滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃,無菌操作傾注于加有0.5 mL菌液的培養(yǎng)皿中,每皿約15～20 mL的培養(yǎng)基,將培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)上輕輕搖動(dòng),將菌與培養(yǎng)基充分混勻,制成含菌平板。將滅菌后直徑6 mm的濾紙片置于一定質(zhì)量濃度的黃芩水提物中，浸泡30 min后取出,自然烘干,按無菌操作貼于含菌平板上，陰性對照組為不加黃岑水提物的處理液，陽性對照組為枯草桿菌肽，每皿貼4片,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀觀察有無抑菌作用,并測量其抑菌圈的大小，取平均值。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 精密稱取干燥的黃芩飲片15 g，在一定溫度下按一定的液料比加入適量水，于回流裝置中提取,濾出藥液后減壓濃縮, 靜置5 h，取上清液，即為黃芩水提物。主要考察提取溫度、提取時(shí)間和液料比對黃芩中抗菌有效成分的影響。

1.2.5 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3因素3水平的Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13-15]。采用響應(yīng)面分析法研究3個(gè)隨機(jī)因素(提取溫度、提取時(shí)間和液料比)對響應(yīng)值(抑菌圈直徑)的影響。每一自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。用SAS V 8.0的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工具箱對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，對回歸方程和關(guān)鍵因素進(jìn)行方差分析，并得到最優(yōu)的抗菌有效成分提取條件。應(yīng)用Matlab 7.0根據(jù)響應(yīng)方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度 液料比10∶1(mL∶g，下同)，提取溫度分別為60、70、80、90和100 ℃，提取1 h，藥液濃縮至適當(dāng)濃度，靜置5 h，取上清液，測定各組水提物對白色念珠菌的抑菌活性，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，隨著提取溫度的逐漸增加，黃芩水提物對白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑逐漸減小，可能由于黃芩中有效抑菌活性成分經(jīng)高溫加熱后易失活，故黃芩中抗菌有效活性成分提取的最佳溫度為70 ℃。

2.1.2 提取時(shí)間 液料比10∶1,提取溫度70 ℃條件下分別提取1、2、3、4和5 h，藥液濃縮至適當(dāng)濃度，靜置5 h，取上清液，測定各組水提物對白色念珠菌的抑菌活性，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以清楚的看出，隨著提取時(shí)間的增加，黃芩提取物的抑菌活性增加，2 h后抑菌圈直徑下降，故選擇黃芩抗菌有效成分的提取時(shí)間單因素優(yōu)化值為2 h。

2.1.3 液料比 在篩選得到的最佳提取溫度70 ℃，提取時(shí)間2 h下，分別按液料比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1和40∶1對黃芩進(jìn)行提取，藥液濃縮至適當(dāng)濃度，靜置5 h，取上清液，測定各組水提物對白色念珠菌的抑菌活性，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，液料比高于10∶1后，抑菌圈直徑有所降低，故選擇黃芩抗菌有效成分提取的最優(yōu)液料比為10∶1。

圖1 提取溫度對抑菌圈直徑的影響

Fig.1 Effect of extraction temp. on the bacteriostatic circle diameter

圖2 提取時(shí)間對抑菌圈直徑的影響

Fig.2 Effect of extraction time on the bacteriostatic circle diameter

圖3 液料比對抑菌圈直徑的影響

Fig.3 Effect of solvent/solid on the bacteriostatic circle diameter

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩抗菌有效成分提取條件

2.2.1 提取條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的優(yōu)化結(jié)果，以提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)和液料比(X3)為自變量，抑菌圈直徑Y(jié)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，采用多元二次回歸方法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)分析，并采用偏導(dǎo)方法求解多元二次回歸方程的極值，得到最佳提取條件。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

采用SAS RSREG程序?qū)Ρ?中數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，多元二次回歸方程為:

響應(yīng)面二次回歸模型ANOVA分析結(jié)果如表2所示。該模型的R2值為0.978 1，P值為0.001 3,說明試驗(yàn)點(diǎn)的數(shù)據(jù)的這種擬合方法是合理可靠的, 使用該方程模擬真實(shí)的3因素3水平的分析是可行的。各因素的顯著作用采用P檢測和F檢測方法。t值越大，P值越小則該因素對響應(yīng)值的影響越顯著。從結(jié)果中可以看出，提取溫度(X1)對抑菌圈直徑的影響非常大，P值為0.003 5，對二次變量而言，X1X3、X22項(xiàng)P值分別為0.000 6、 0.000 2，對Y值有極顯著影響(P<0.001)，X12、X32項(xiàng)P值分別為0.004 7和0.006 3，對Y值有顯著影響(P<0.05)。

表2 回歸分析結(jié)果

根據(jù)回歸方程，繪制響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖4所示。從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，發(fā)現(xiàn)其中曲線走勢越陡，其影響越顯著；曲線走勢越平滑，其影響越小。提取溫度、液料比和提取時(shí)間的圖形曲線走勢較陡，說明其對抑菌圈直徑影響最為顯著。

圖4 響應(yīng)面圖和等高線圖

采用SAS工具箱計(jì)算黃芩抗菌有效活性成分最優(yōu)提取條件的編碼值為：X1=-0.863 74，X2=0.073 316,X3=0.657 436。根據(jù)編碼值與非編碼值的轉(zhuǎn)換式解得真實(shí)值為X1=61.36，X2=2.037，X3=13.285。因此，將數(shù)據(jù)圓整后可得黃芩中抗菌有效成分的最佳提取工藝為：提取溫度61 ℃、提取時(shí)間2h、液料比13∶1。由回歸方程預(yù)測對白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌圈理論值可達(dá)到12.665mm。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，采用模型預(yù)測的最佳提取條件進(jìn)行黃芩中抗菌有效成分提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，采用的提取工藝為提取溫度61 ℃,提取時(shí)間2h,液料比13∶1。3次平行試驗(yàn)得到當(dāng)黃芩水提物質(zhì)量濃度為0.5g/mL時(shí)，抑菌圈的平均值為12.637mm，相對誤差小于0.1%，可見預(yù)測值與試驗(yàn)值吻合得很好，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 抑菌性比較

按照響應(yīng)面法優(yōu)選的最佳工藝條件對黃芩進(jìn)行提取，并減壓濃縮到質(zhì)量濃度0.5 g/mL，另作陽性和陰性對照進(jìn)行抑菌活性的測定，黃芩水提物濃縮液對白色念珠菌平均抑菌圈直徑為12.64 mm，陽性對照組平均抑菌圈直徑為11.85 mm，陰性對照組平均抑菌圈直徑為0 mm。

3 結(jié) 論

采用單因素及中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩中抗菌有效活性成分的提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 最優(yōu)的提取工藝為：提取溫度61 ℃、提取時(shí)間2 h、液料比13∶1(mL∶g)，在此條件下0.5 g/mL的黃芩水提物，能夠顯著抑制白色念珠菌活性，抑菌圈的平均直徑為12.637 mm，與理論預(yù)測值(12.665)的相對誤差小0.1%。

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Extraction of Effective Ingredients fromScutellariaBacalensisGeorgi

WANG Xue， LIU Yan-ge， LU Jia-hui， WANG Chun-yue， JIA Bing-xuan， MENG Qing-fan，ZHANG Yang， WANG Di

(School of Life Science,Jilin University, Changchun 130012, China)

In order to optimize the extraction condition for effective active ingredient from Scutellaria Bacalensis Georgi, a three-factor-three-level experiments design was developed by using Box-Benhken central composite design method based on single-factor experiments with extraction temperature, extraction time, solvent-solid ratio as influence factors. The bacteriostatic ring diameter againstCandidaalbicanswas used as the responsive values. The data were fitted by using multi-linear equation and second-order polynomial equation. And the extraction conditions were optimized by response surface method. The optimum conditions were as follows: extraction temperature 61 ℃, extraction time 2 h and solvent-solid ratio 13∶1. Under these conditions,the average diameter of bacteriostatic circles verified by three experiments was 12.637 mm closing to the predicted value(12.664 88 mm)，when the concentration of extractions was 0.5 g/mL.And the average diameter of bacteriostatic circle of positive contrast was 11.85 mm.The results showed that the aqueous extract ofScutellariabacalensisGeorgi had significant bacteriostatic effects onCandidaalbicans.

ScutellariabacalensisGeorgi; antibacterial ingredient; extraction; central composite design-response surface metho- dology

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.05.007

2014- 04- 03

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目(3R114P821413)

王 雪(1990—)，女，黑龍江齊齊哈爾，碩士生，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究

*通訊作者：王 迪，講師，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)、分子藥理學(xué)；E-mail:jluwangdi@outlook.com。

TQ35

A

1673-5854(2015)05- 0034- 05