尹子靜，劉裕田

（山西省呂梁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西呂梁 033000）

基層監(jiān)測(cè)采樣問(wèn)題的解決措施

尹子靜，劉裕田

（山西省呂梁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西呂梁 033000）

采樣監(jiān)測(cè)是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的基礎(chǔ)，樣品質(zhì)量是否符合要求直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，基層采樣過(guò)程中存在著血清溶血、樣品受污染、樣品采集保存不規(guī)范等問(wèn)題進(jìn)行分析，建議使用負(fù)壓采血管、嚴(yán)格采樣規(guī)程等措施加以改進(jìn)。

畜禽采樣；問(wèn)題；措施

采樣監(jiān)測(cè)是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的基礎(chǔ)，合格的樣品才能得到科學(xué)的結(jié)論，為重大動(dòng)物疫病防控、動(dòng)物檢疫和養(yǎng)殖場(chǎng)疫病凈化提供可靠的診斷依據(jù)。由于我市地處呂梁山區(qū)，基層動(dòng)物防疫工作者技術(shù)水平低，在監(jiān)測(cè)采樣中存在著諸多問(wèn)題，下面就本人在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作中對(duì)基層采樣存在的問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)并提出改進(jìn)方法，以供同仁參考。

1 在基層采樣中存在的具體問(wèn)題表現(xiàn)為

1.1 血清制備存在問(wèn)題

血清學(xué)檢測(cè)方法是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作中最基本的檢測(cè)方法，而血清標(biāo)本的質(zhì)量是否符合要求直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此血清的制備最為關(guān)鍵。血清是指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體。在我市基層采集血清常見的問(wèn)題如溶血、膠凍樣血清等。溶血是由于各種原因造成紅細(xì)胞破壞，胞內(nèi)血紅蛋白（Hb）等物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)液進(jìn)入血清。制備血清過(guò)程中例如采血時(shí)在血腫的地方采集血樣、血液注入采血管中時(shí)未取下針頭或用力推出產(chǎn)生大量氣泡、機(jī)械性強(qiáng)力振蕩、突然低溫冷凍或突然化凍都能引起溶血。溶血對(duì)ELISA檢測(cè)法的影響主要是由紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。劉玉振等研究發(fā)現(xiàn)，溶血對(duì)HBsAg的檢測(cè)有影響，當(dāng)紅細(xì)胞濃度＞25%造成的溶血可導(dǎo)致假陽(yáng)性。由于基層采血未能普及含有分離膠及促凝劑的采血管，現(xiàn)場(chǎng)分離血清使得凝血時(shí)間不足，血清中的蛋白纖維未能完全分離，導(dǎo)致析出的血清在放置一段時(shí)間后呈現(xiàn)膠凍樣（尤其是雞豬血清最明顯）。還有可能是脂濁血清，出現(xiàn)的原因脂肪堆積過(guò)多，或血清離心不合適（時(shí)間、速度等因素），導(dǎo)致分離出的血清中存在著脂質(zhì)小粒，這些小粒容易附著在酶標(biāo)板內(nèi)壁，非離子洗滌劑對(duì)這些物資洗滌不徹底，造成非特異型吸附使得吸光值偏高而造成假陽(yáng)性結(jié)果。吳澤馨研究表明，脂濁標(biāo)本對(duì)ELISA法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾較大，極易容易形成假陽(yáng)性結(jié)果，嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果的正確度。

1.2 缺乏無(wú)菌概念，樣品污染嚴(yán)重

在采集豬、雞血液過(guò)程中容易扎破血管，導(dǎo)致流出血管外的血液受污染。由于血清受到細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。

1.3 病原學(xué)采樣不規(guī)范

病原學(xué)可以從疫病的病原、流行病學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等角度，深入揭示重要?jiǎng)游镆卟〔≡淖儺愐?guī)律、流行特點(diǎn)、致病機(jī)制及機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制，為動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)、預(yù)警及防控提供技術(shù)支持。隨著生物學(xué)研究由宏觀領(lǐng)域向微觀領(lǐng)域的發(fā)展，病原體檢測(cè)方法也從組織形態(tài)學(xué)水平深入到分子水平、基因水平。例如高致病性禽流感鼻咽拭子采樣是病原學(xué)監(jiān)測(cè)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，操作簡(jiǎn)單，但是基層采樣過(guò)程中存在采樣器具不合格、受污染、采樣部位、樣品保存液種類、保存方法不正確等問(wèn)題，使得病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果受到影響，浪費(fèi)了大量的人力、物力、財(cái)力。樣品采集的時(shí)間、部位及采集質(zhì)量對(duì)病毒分離、提取以及制備有活性的RNA至關(guān)重要，而樣本保存與運(yùn)輸不當(dāng)，也會(huì)影響病毒的分離。

1.4 樣品盛放容器標(biāo)準(zhǔn)不一，加大實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員工作量

采集血清時(shí)，由于各縣市區(qū)采樣的采樣器具不統(tǒng)一，分別為獸用采血器、真空管、注射器等，造成檢測(cè)過(guò)程中吸取血清困難，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率。

1.5 采樣單填寫簡(jiǎn)單，難以準(zhǔn)確研判檢測(cè)結(jié)果并評(píng)估免疫結(jié)果

由于基層防疫人員文化水平低、年齡老化，采樣單填寫簡(jiǎn)單，比如未能按照要求寫清楚畜禽種類、日齡、代次、免疫程序、免疫時(shí)間、疫苗種類、疫苗生產(chǎn)廠家及批號(hào)。由于現(xiàn)代疫苗技術(shù)發(fā)展，特異性的檢測(cè)試劑盒成為動(dòng)物防疫工作研究者的重點(diǎn)。例如薛雙等研究證實(shí)，豬口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗體的檢測(cè)不能使用IHA試劑盒檢測(cè)，豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA診斷試劑盒（VP1-ELISA）和口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒（LB-ELISA）都可以用來(lái)評(píng)價(jià)豬口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后血清抗體水平，這和陳方志等試驗(yàn)結(jié)果相同。

1.6 采血技術(shù)不規(guī)范、不熟練

直接導(dǎo)致畜禽應(yīng)激反應(yīng)大，造成畜主對(duì)采樣工作不支持。由于基層獸醫(yī)站人員部分為“三定”時(shí)期的人員，牛羊雞采樣使用“采血針+負(fù)壓管”尚未普及，以及豬前腔靜脈采樣法使用較少，造成采血時(shí)動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)大，畜主對(duì)采血有抵觸情緒。

1.7 樣品采集數(shù)量少

不足以代表整個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的抗體水平。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)一般規(guī)律，采樣量達(dá)20頭時(shí)可信度達(dá)98%，達(dá)30頭時(shí)可信度達(dá)99%，達(dá)40頭時(shí)可信度達(dá)99.5%，達(dá)50頭時(shí)可信度達(dá)99.9%。因此建議每個(gè)階段分別至少采樣30頭?？紤]到種公豬的特殊重要性，最好每頭種公豬都要采樣。

1.8 忽視樣品保存的時(shí)效性

對(duì)于市縣鄉(xiāng)三級(jí)動(dòng)物防疫部門來(lái)說(shuō)，由于集中監(jiān)測(cè)的時(shí)效性和區(qū)域性，從鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站組織采血到市級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展檢測(cè)需要5個(gè)工作日以上，因此存在著在夏季血清樣品冷藏容易腐敗、抗體效價(jià)降低以及細(xì)菌滋生等問(wèn)題。由于血清在冰箱中長(zhǎng)時(shí)間保存導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法ELISA的試劑本底加深。冷凍血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均。

2 原因分析及解決措施

2.1 采血前基層防疫人員提前告知養(yǎng)殖戶，相互配合，盡量在采血前12h減少飼喂飼料，多飲水。

2.2 普及使用真空負(fù)壓管采血技術(shù)，嚴(yán)格無(wú)菌采血。只要是扎破血管流出血管外的血液不能采集，因?yàn)檠阂呀?jīng)受到污染。制備血清的過(guò)程中有條件的話盡量在無(wú)菌操作臺(tái)制備血清，也可加入適當(dāng)防腐劑。標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。

2.3 制定血清制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。采血完成后，迅速將采血器傾斜30度左右放入37℃恒溫箱2h以上（冬季北方天氣溫度低，采集雞血清時(shí)候要帶熱水袋，加快血液凝集進(jìn)程），拿出后在冰箱4℃放置過(guò)夜，用3000轉(zhuǎn)/min離心10min分離血清。一般說(shuō)來(lái)，在5d內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需-20℃保存。

2.4 采集的樣品用防水油性記號(hào)筆標(biāo)記要清楚，編號(hào)要有規(guī)律，樣品的排列要有順序，以便于檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)結(jié)果。采集的樣品要有詳細(xì)的說(shuō)明，包括畜禽的健康狀況、日齡、胎齡、種類、免疫程序、近3個(gè)月的免疫時(shí)間、疫苗種類和疫苗來(lái)源等數(shù)據(jù)。

2.5 病原學(xué)所有標(biāo)本的收集、運(yùn)輸和保藏都應(yīng)裝在有螺旋蓋的塑料管中，以防止開、關(guān)標(biāo)本管時(shí)產(chǎn)生氣溶膠，并用兩層封口袋包裹嚴(yán)實(shí)，不同場(chǎng)（村）不能混裝，同時(shí)注意采樣過(guò)程中器械交叉污染。采集樣品要裝在有冰袋的保溫盒內(nèi)及時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)送途中盡量避免搖晃，以免溶血。采樣的鼻咽拭子WHO及美國(guó)CDC規(guī)定，鼻咽拭子采集只能用塑料桿的滌綸或人造棉拭子（如常用的聚酯纖維拭子），不能用藻酸鈣拭子或木桿拭子，因可能使某些病毒失活或抑制PCR，脫脂棉含有熒光物質(zhì)，影響實(shí)時(shí)應(yīng)熒光定量PCR結(jié)果。

2.6 加強(qiáng)基層動(dòng)物防疫人員采樣技術(shù)培訓(xùn)。通過(guò)組織骨干現(xiàn)場(chǎng)示范、防疫人員現(xiàn)場(chǎng)實(shí)踐等方式舉辦實(shí)驗(yàn)室技術(shù)培訓(xùn)以及技術(shù)比武，同時(shí)發(fā)放自制的采樣視頻音像資料以期提高技術(shù)水平。

[1]劉玉振，等.溶血對(duì)抗-HCV、HBsAg等測(cè)定結(jié)果的影響.中國(guó)輸血雜志[J].1999，12（1）:32-33.

[2]吳澤馨，等.脂濁標(biāo)本對(duì)ELISA法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原結(jié)果的影響.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥[J].2012（17）:107-108.

[3]薛雙，等.不同方法檢測(cè)豬口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗體的對(duì)比試驗(yàn)[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2012（07）:68-69.

[4]陳方志，等.豬口蹄疫O型合成肽疫苗抗體水平檢測(cè).動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展[J].2009（08期）:116-118.

[5]人感染H7N9禽流感病毒標(biāo)本采集及運(yùn)送技術(shù)規(guī)范.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．11.008

尹子靜（1963～），山西省興縣人，主要從事動(dòng)物疫病防治工作