李淑娟，張 超，張彥妮，董亞茹，馬旭俊

(東北林業(yè)大學(xué) a 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，b 園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

毛果楊HDAC基因家族序列及其表達(dá)分析

李淑娟a，張 超a，張彥妮b，董亞茹b，馬旭俊a

(東北林業(yè)大學(xué) a 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，b 園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

【目的】 研究毛果楊組蛋白去乙酰化酶(HDAC)基因家族序列及其對(duì)脫落酸(ABA)的應(yīng)答反應(yīng)，為HDAC 家族基因的功能研究奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?采用生物信息學(xué)方法對(duì)毛果楊HDAC家族的16種蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法，分析了100 μmol/L ABA葉面噴灑處理后6和24 h毛果楊葉片HDAC家族16個(gè)基因的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】 HDAC家族蛋白分析顯示，毛果楊HDAC可分為3個(gè)亞家族，即RPD3/HDA1、HD2和SIR2亞家族，與擬南芥HDAC蛋白的親緣關(guān)系較近。HDAC家族大多數(shù)成員為親水性蛋白質(zhì)(HDA912屬于疏水性蛋白)，其等電點(diǎn)呈酸性(除了HDA912和SIR2亞家族)。HDAC家族蛋白受磷酸化調(diào)節(jié)，磷酸化位點(diǎn)主要發(fā)生在絲氨酸殘基上。絕大部分HDAC蛋白都有不同數(shù)目的跨膜螺旋和不同的跨膜方向，而在HD2蛋白中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，RPD3/HDA1和SIR2亞家族成員均含有不同比例的α-螺旋、β-折疊片和無(wú)規(guī)則卷曲，其中無(wú)規(guī)則卷曲比例達(dá)到50%以上(HDA912除外)；而HD2亞家族成員不含有α-螺旋，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，比例高達(dá)80%左右。HDAC家族蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器及其他膜結(jié)構(gòu)中也有分布， HD2蛋白幾乎都定位于細(xì)胞核內(nèi)。RPD3/HDA1和SIR2亞家族成員的三級(jí)結(jié)構(gòu)可分為6種類型，預(yù)示其生物學(xué)功能也可能存在差異。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析結(jié)果表明，ABA處理6 h顯著提高了毛果楊HDA901、HDA903和HDT901基因的表達(dá)，而ABA處理24 h則會(huì)顯著降低HDA907和HDT901基因的表達(dá)?！窘Y(jié)論】 作為植物特有的一類組蛋白去乙?；?，毛果楊HD2亞家族蛋白在序列和結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面與其他2個(gè)亞家族不同。ABA能夠調(diào)節(jié)楊樹HDAC家族基因的表達(dá)，HDAC家族基因不同成員對(duì)ABA的應(yīng)答反應(yīng)不同。

毛果楊；組蛋白去乙酰化酶；生物信息學(xué)；脫落酸(ABA)；基因表達(dá)

表觀遺傳調(diào)控是植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的一個(gè)十分重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。表觀遺傳調(diào)控是在不改變DNA序列的情況下，通過(guò)DNA或組蛋白修飾來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，具有快速、可逆和可遺傳[1]的特點(diǎn)。最近研究表明，不同的環(huán)境脅迫均可導(dǎo)致組蛋白修飾的改變[2]。組蛋白翻譯后修飾包括組蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化和甲基化等。其中，對(duì)組蛋白乙?；芯康米钤鏪3]且比較清楚，其在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活動(dòng)調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。組蛋白乙?；饕l(fā)生在組蛋白尾部的賴氨酸(Lysine)殘基上，是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase，HAT)催化的組蛋白乙酰化和組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDAC)催化的組蛋白去乙酰化共同調(diào)節(jié)。HAT可將乙?；o酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白末端的賴氨酸殘基上；而HDAC可將組蛋白末端的乙?；コ?。HAT介導(dǎo)的組蛋白乙?；谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)處于伸展?fàn)顟B(tài)，有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，因此一般被認(rèn)為與基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)；而HDAC介導(dǎo)的組蛋白去乙?；谷旧|(zhì)處于緊縮狀態(tài)，不利于轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與DNA結(jié)合，因此一般被認(rèn)為與基因的抑制/沉默有關(guān)。由于HAT與基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，因此有關(guān)HAT的研究相對(duì)較多。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，HDAC可與多種調(diào)節(jié)蛋白形成大的復(fù)合體來(lái)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[4-6]，使人們逐漸認(rèn)識(shí)到基因的表達(dá)是由HAT和HDAC共同調(diào)節(jié)的，二者缺一不可，HDAC的研究也因此逐漸受到人們的重視。

HDAC在真核生物如酵母、真菌、動(dòng)物、植物以及人類中廣泛存在。很多研究表明，人HDAC與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系[7]。1988年首次在植物中發(fā)現(xiàn)HDAC的存在[8]。直到最近幾年，植物HDAC的研究才開始受到重視，相關(guān)研究也逐漸增多，HDAC蛋白和基因在多種植物中得到克隆和鑒定。HDAC的功能研究主要集中在玉米[6,9-11]、擬南芥[10-14]、水稻[15-16]等草本植物上。雖然目前來(lái)自不同植物的眾多HDAC基因的功能還有待研究，但已有的研究結(jié)果均表明，HDAC與基因沉默、植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫反應(yīng)直接相關(guān)。

基于酵母HDAC序列的同源性分析可知，植物HDAC可分為3個(gè)亞家族：RPD3/HDA1、HD2 和SIR2[17]。RPD3/HDA1是HDAC家族最大的一個(gè)亞家族，所有的成員都含有一個(gè)典型的組蛋白去乙酰化酶結(jié)構(gòu)域，其酶活性的發(fā)揮需要Zn2+的存在。RPD3/HDA1 類型的組蛋白去乙?；钢饕植加诩?xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間[18]，與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及生物和非生物脅迫有關(guān)。HD2蛋白在玉米胚中首次被發(fā)現(xiàn)[9,12]，與其他真核生物中已確定的HDAC沒(méi)有序列相似性，在動(dòng)物和酵母中均未發(fā)現(xiàn)，是植物自身特有的一類組蛋白去乙?；浮Ｒ延械难芯勘砻?，HD2蛋白主要定位于細(xì)胞核[18]，可能與核仁染色質(zhì)區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。擬南芥AtHD2C除與環(huán)境脅迫有關(guān)[19]外，還與生殖發(fā)育有關(guān)[20-21]。植物SIR2蛋白(又稱Sirtuin)是與酵母SIR2同源的一類組蛋白去乙?；?，這類組蛋白去乙酰化酶與其他HDAC沒(méi)有相似的結(jié)構(gòu)，其酶活性的發(fā)揮依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的存在。RPD3/HDA1 類型的組蛋白去乙?；负虷D2蛋白均能被trichostatin A (TSA)或butynate所抑制，而SIR2蛋白的酶活性不能被這些抑制劑抑制，其酶活性可被煙酰胺(nicotinamide)、splitomicin、sirtinol等所抑制[22]。因此，SIR2 蛋白被看作是一類新型的組蛋白去乙?；?。SIR2蛋白與染色質(zhì)沉默、細(xì)胞代謝和壽命有關(guān)[23]。人們對(duì)植物SIR2蛋白的功能了解甚少。最近發(fā)現(xiàn)，水稻OsSRTI具有保護(hù)基因組穩(wěn)定和抗氧化脅迫的作用[15,24]。玉米有15個(gè)HDAC基因，編碼10個(gè)RPD3/HDA1蛋白、4個(gè)HD2 蛋白和1個(gè)SIR2蛋白[6]。最近發(fā)現(xiàn)，玉米R(shí)PD3亞家族基因與細(xì)胞發(fā)育[25]和細(xì)胞周期有關(guān)[26]。水稻中存在18個(gè)HDAC基因，編碼14個(gè)RPD3/HDA1蛋白、2個(gè)HD2 蛋白和2個(gè)SIR2蛋白[27]。水稻HDAC基因表達(dá)受環(huán)境脅迫的影響[15,28]，例如低溫脅迫會(huì)抑制水稻HDA712、SRT701、SRT702的表達(dá)；甘露醇處理能夠誘導(dǎo)HDT701的表達(dá)，抑制SRT701和SRT702的表達(dá)；NaCl處理能夠誘導(dǎo)HDT701和HDA714的表達(dá)，降低SRT701和SRT702的表達(dá)[15]。擬南芥有18個(gè)HDAC基因， 編碼12個(gè)RPD3/HDA1蛋白、4個(gè)HD2 蛋白和2個(gè)SIR2蛋白[27]。其中，對(duì)RPD3/HDA1亞家族的AtHDA19、AtHDA6和AtHDA18基因以及HD2亞家族的AtHD2C和AtHD2A基因的功能研究得比較清楚，其他家族成員的基因功能尚有待研究。AtHDA19與發(fā)育[29-30]和脅迫[31-33]相關(guān)，AtHDA19的反義抑制或T-DNA插入突變會(huì)導(dǎo)致植株出現(xiàn)多種表型上的改變，如早期衰老、葉片呈鋸齒狀、空中花環(huán)、花器官一致性上的缺陷和晚開花等[19]；此外，AtHDA19第2個(gè)外顯子插入一段 T-DNA產(chǎn)生的突變體對(duì)脫落酸(ABA)和NaCl高敏感[31]；擬南芥AtHDA6與轉(zhuǎn)座因子抑制[34-35]、基因沉默[36-37]和脅迫反應(yīng)[31,38-39]相關(guān)；AtHDA18與根表皮細(xì)胞模式形成有關(guān)，TSA處理引起根毛細(xì)胞在非根毛形成部位出現(xiàn)和發(fā)育[40]；AtHD2C與環(huán)境脅迫有關(guān)，擬南芥AtHD2C的過(guò)量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[41]；AtHD2A與生殖發(fā)育有關(guān)[20-21]?？傮w而言，目前只是對(duì)少數(shù)HDAC基因研究得相對(duì)深入，而對(duì)來(lái)自多種植物的眾多HDAC基因的功能仍有待研究。

脫落酸是一種非常重要的植物激素，主要調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)逆境脅迫(如滲透脅迫)的適應(yīng)。一般情況下，非生物脅迫能夠誘導(dǎo)ABA的積累，ABA通過(guò)調(diào)節(jié)染色體的重塑來(lái)調(diào)節(jié)脅迫基因的表達(dá)和脅迫耐受性，以及種子的成熟、休眠和發(fā)芽[42]。Chen等[38]研究發(fā)現(xiàn)，ABA能夠誘導(dǎo)擬南芥H3K4三甲基化和ABA應(yīng)答基因的表達(dá)，而這些作用都需要HDA6的存在。在HDA6突變體axe-5中，H3K4三甲基化水平降低，ABA應(yīng)答基因(如ABI1、ABI2、 3KAT1、KAT2和RRD29B)的表達(dá)下降，種子發(fā)芽對(duì)ABA和鹽脅迫敏感，發(fā)芽率下降。此外，擬南芥HDA19 T-DNA插入突變體hda19-1也對(duì)ABA和鹽脅迫超敏感，其ABA應(yīng)答基因ABI1、ABI2、3KAT1、KAT2和RRD29B的表達(dá)下降，種子發(fā)芽率也下降[31]。ABA還能夠抑制擬南芥HD2C基因的表達(dá)，hd2c-1和 hd2c-3突變體對(duì)ABA和NaCl敏感[43]，而HD2C在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)降低了植株對(duì)ABA的敏感性，降低了蒸騰速率，提高了植株對(duì)鹽和干旱的耐受性[41]。這些研究表明，HDAC參與植物對(duì)ABA和脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。

近年來(lái)，人們對(duì)HDAC的研究主要集中在草本植物上，而對(duì)木本植物HDAC基因的結(jié)構(gòu)和功能了解甚少。本研究以毛果楊(PopulustrichocarpaTorr.& Gary)基因組信息為基礎(chǔ)，對(duì)其HDAC家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化、理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、親/疏水性、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)；同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)HDAC基因家族的表達(dá)與ABA的關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為HDAC基因的功能研究提供有用的參考信息和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

毛果楊無(wú)菌苗由林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))程玉祥教授饋贈(zèng)。

從植物染色質(zhì)因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.chromdb.org)得到毛果楊HDAC家族16個(gè)成員的氨基酸序列。

1.2 毛果楊HDAC家族蛋白的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)和互聯(lián)網(wǎng)上的生物信息學(xué)程序，對(duì)毛果楊HDAC家族成員的一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)、跨膜域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；并且利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建毛果楊與擬南芥HDAC的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析它們?cè)谶M(jìn)化上的關(guān)系。

1.2.1 毛果楊HDAC序列系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 HDAC家族功能研究最多的植物是擬南芥，擬南芥HDAC家族有18個(gè)成員，從植物染色質(zhì)因子數(shù)據(jù)庫(kù)得到擬南芥HDAC家族18個(gè)成員的氨基酸序列，利用Clustal W 對(duì)HDAC家族氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并利用生物學(xué)軟件MEGA 5.0構(gòu)建毛果楊和擬南芥HDAC家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用遺傳距離建樹法的相鄰連接法(Neighbor-Joining，NJ)建樹，對(duì)生成的樹進(jìn)行1 000次的Bootstrap(自引導(dǎo))校正。

1.2.2 毛果楊HDAC家族蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析 利用ExPaSy提供的ProtParam在線程序(http://web.expasy.org/protparam/)，對(duì)HDAC家族蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用ExPaSy提供的ProtScale在線程序(http://expasy.org/tools/protscale.html)，對(duì)HDAC家族蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)親/疏水性分析；利用NetPhos 2.0 在線分析程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，對(duì)HDAC家族蛋白進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)分析。

1.2.3 毛果楊HDAC家族蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)及二級(jí)結(jié)構(gòu) 利用TMpred在線程序(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)，對(duì)HDAC家族蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析；利用PredictProtein在線程序(https://www.predictprotein.org/)，對(duì)HDAC家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，包括對(duì)各個(gè)家族成員其蛋白α-螺旋(α-helix，H)、β-折疊(β-strand，E)和無(wú)規(guī)則卷曲(loop，L)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 毛果楊HDAC家族蛋白亞細(xì)胞定位及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用WoLF PSORT在線軟件(https://wolfpsort.org/)，對(duì)HDAC家族蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析；利用SWISSMODEL同源建模服務(wù)器(http//swissmodel.expasy.org)，對(duì)HDAC家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 毛果楊HDAC家族基因的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)ABA處理?xiàng)l件下HDAC家族16個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.3.1 毛果楊無(wú)菌苗的ABA處理 毛果楊無(wú)菌苗培養(yǎng)1個(gè)月后，轉(zhuǎn)移至裝有蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽中，澆灌1/4 MS培養(yǎng)基，在植物培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為22～25 ℃，光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h。培養(yǎng)1周后選取株高和生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗進(jìn)行ABA處理，ABA濃度為100 μmol/L，采用葉片噴灑的方式處理 0，6和24 h，然后剪取葉片，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃，用于葉片總RNA的提取。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 植物總RNA的提取和cDNA的合成 采用Trizol試劑提取毛果楊葉片總RNA，具體提取方法參見(jiàn)Trizol試劑盒使用說(shuō)明書；采用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；合成的cDNA稀釋10倍后作為模板用于HDAC家族基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

1.3.3 毛果楊HDAC家族基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 人工合成HDAC家族基因的特異引物(表1)，采用SYBR Premix ExTaqⅡ(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析ABA對(duì)16個(gè)HDAC家族基因表達(dá)的影響。以毛果楊18S為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算HDAC家族基因的表達(dá)水平。ABA處理前(0 h)HDAC基因家族每個(gè)成員的表達(dá)水平均指定為1；與處理0 h的表達(dá)水平相比，從而得出ABA處理6和24 h的表達(dá)水平(n倍)。采用t檢驗(yàn)法比較ABA處理6和24 h mRNA表達(dá)量與處理前(0 h)的差異。P<0.05表示表達(dá)水平存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊HDAC家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Clustal W程序?qū)γ麠?Pt)和擬南芥(At)HDAC家族蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并利用MEGA 5.0軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1表明，毛果楊和擬南芥HDAC家族蛋白可分為3個(gè)亞家族，即RPD3/HDA1、HD2和SIR2亞家族。3個(gè)亞家族的基因分別命名為HDA、HDT和SRT(http://www.chromdb.org)。毛果楊RPD3/HDA1亞家族有11個(gè)成員，包括HDA901、HDA902、HDA903、HDA904、HDA905、HDA906、HDA907、HDA908、HDA909、HDA910和HDA912；HD2亞家族有3個(gè)成員，包括HDT901、HDT902和HDT903；SIR2亞家族有2個(gè)成員，包括SRT901和SRT902。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，毛果楊與擬南芥HDAC家族在進(jìn)化關(guān)系上比較近，有很高的同源性。

2.2 毛果楊HDAC家族蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

2.2.1 理化性質(zhì) 利用ProtParam在線程序(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)毛果楊HDAC家族蛋白進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

注：總平均疏水性指蛋白質(zhì)序列所有氨基酸殘基疏水性的平均值，說(shuō)明蛋白質(zhì)的溶解性，正值代表疏水，負(fù)值代表親水；不穩(wěn)定指數(shù)用于描述蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，若此值超過(guò)40則為不穩(wěn)定蛋白；aa代表氨基酸。

Note:Grand Average Hydropathicity (GRAVY) is the average value of the hydropathicity of all amino acid residues in a protein,indicating the solubility of proteins.Positive GRAVY value means hydrophobic and negative GRAVY value means hydrophilic.Instability index is used to describe the stability of the primary structure of a protein and a value of >40 means the protein is unstable.aa means amino acid.

表2顯示，HDAC家族蛋白氨基酸殘基數(shù)為260～646。RPD3/HDA1亞家族的11個(gè)蛋白中，除HDA912等電點(diǎn)為8.77，呈堿性外，其他10個(gè)家族蛋白的等電點(diǎn)在5.06～6.29，均呈酸性；HDA912總平均疏水性為0.234，其他10個(gè)成員總平均疏水性在-0.071～-0.521，即屬于親水性蛋白；與之相對(duì)應(yīng)，除了HDA912帶正電外，其他RPD3/HDA1亞家族蛋白則是負(fù)電氨基酸殘基數(shù)目多于正電氨基酸殘基數(shù)目，帶負(fù)電；在RPD3/HDA1亞家族的11個(gè)蛋白中，HDA901、HDA902、HDA903、HDA904、HDA905、HDA906和HDA912是穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其他成員則屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。HD2亞家族的3個(gè)成員具有一致的理化性質(zhì)，等電點(diǎn)均在5.0左右，呈酸性，均帶負(fù)電；總平均疏水性在-1.0左右，都屬于親水性蛋白；一級(jí)結(jié)構(gòu)均不穩(wěn)定。SIR2亞家族的2個(gè)成員的理化性質(zhì)與其他2個(gè)亞家族略有不同，SRT901與SRT902的等電點(diǎn)在9.0左右，均呈堿性，負(fù)電氨基酸殘基數(shù)目小于正電氨基酸殘基數(shù)目，帶正電，屬于親水性蛋白?？傊琀DAC家族蛋白絕大多數(shù)都是親水性(HDA912除外)和酸性(HDA912和SIR2亞家族除外)蛋白質(zhì)。

2.2.2 磷酸化位點(diǎn) 蛋白質(zhì)磷酸化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程中具有十分重要的作用，也是蛋白質(zhì)活性的一種調(diào)節(jié)方式。Brosch等[44]和Kolle等[45]首次發(fā)現(xiàn)，玉米 HDAC受磷酸化的調(diào)節(jié)，磷酸化能夠改變HDAC的酶活性和底物特異性。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果(表3)表明，毛果楊HDAC也受磷酸化的調(diào)節(jié)，毛果楊HDAC家族成員在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上均能發(fā)生磷酸化，但磷酸化位點(diǎn)主要發(fā)生在絲氨酸殘基上。此外，不同的HDAC家族成員具有不同的磷酸化位點(diǎn)數(shù)。

2.2.3 親/疏水性 蛋白質(zhì)的功能往往是由其三維結(jié)構(gòu)決定的，而氨基酸的親/疏水性在一定程度上反應(yīng)了蛋白質(zhì)的折疊方式，這對(duì)蛋白質(zhì)形成特定的功能具有非常重要的作用，且在維持生物膜的結(jié)構(gòu)等方面具有一定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸組成及其所在的位置，可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用ExPaSy提供的ProtScale在線程序(http://expasy.org/tools/protscale.html),對(duì)毛果楊HDAC 3個(gè)亞家族的成員進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 毛果楊HDAC家族蛋白疏水性預(yù)測(cè)HDA902、HDT901和SRT901分別代表毛果楊HDAC家族的RPD3/HDA1、HD2和SIR2亞家族蛋白,圖3和圖4同；方框代表疏水性氨基酸殘基組成的有意義的跨膜螺旋
Fig.2 Hydrophobicity of HDACs inPopulustrichocarpaHDA902,HDT901 and SRT901 represent the RPD3/HDA1,HD2 and SIR2 sub-families,respectively;Box shows the position of significant trans-membrane helix

圖2顯示，HDAC家族大部分成員的親/疏水性氨基酸分布較為均勻。例如，RPD3/HDA1亞家族的HDA902和SIR2亞家族的SRT901，其親/疏水區(qū)域分布較為平均，只是HDA902的N-端親水，而SRT901的N-端疏水。HDA902和SRT901的中后部均能形成由約20個(gè)疏水性氨基酸殘基組成的跨膜螺旋。而HD2亞家族則不同于其他2個(gè)亞家族，其多由親水性氨基酸組成，不能形成跨膜螺旋。HD2亞家族的3個(gè)成員HDT901、HDT902和HDT903的疏水性分布曲線相似，且都有3個(gè)主要的親水區(qū)，主要分布在30-40以及120-200區(qū)域，多肽鏈N-端多是疏水性氨基酸，C-端多是親水性氨基酸。

2.3 毛果楊HDAC家族蛋白的跨膜區(qū)和二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3.1 跨膜區(qū) 跨膜區(qū)是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白行使底物結(jié)合等功能的重要結(jié)構(gòu)，對(duì)氨基酸序列的跨膜區(qū)分析，在推斷該蛋白在細(xì)胞中的功能及作用位點(diǎn)等方面具有重要參考意義。利用TMpred在線分析程序(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對(duì)毛果楊HDAC家族蛋白進(jìn)行了跨膜分析，結(jié)果(表4)顯示，RPD3/HDA1亞家族的11個(gè)蛋白中，除HDA904外，其他10個(gè)蛋白都有不同數(shù)目的跨膜螺旋和跨膜方向，且都有一定數(shù)目的有意義的跨膜螺旋。HD2亞家族的3個(gè)蛋白比較特殊，均沒(méi)有跨膜螺旋，這可能與其在細(xì)胞中的分布有關(guān)。SIR2亞家族蛋白的跨膜區(qū)與RPD3/HDA1亞家族基本一致，即有一定數(shù)目的跨膜螺旋和跨膜方向?？傮w而言，HDAC家族蛋白存在有意義的跨膜區(qū)，但數(shù)目不多(2～3個(gè))。

以HDA902、HDT901和SRT901為例，詳細(xì)說(shuō)明HDAC不同亞家族蛋白跨膜區(qū)的特征，結(jié)果見(jiàn)圖3。

HDA902在114-134、158-176、299-315區(qū)域形成了3個(gè)膜內(nèi)到膜外的跨膜螺旋，其中心位置分別為124，166，307；在115-133、156-173、296-314區(qū)域形成了3個(gè)由膜外到膜內(nèi)的跨膜螺旋，其中心位置分別為125，165和304(圖3-A)。跨膜分析得分大于500才被認(rèn)為是有意義的跨膜，因而在上述跨膜分析中，只有299-315的膜內(nèi)到膜外和296-314的膜外到膜內(nèi)的分析是有意義的跨膜。因此認(rèn)為HDA902的跨膜區(qū)域在296-315處，長(zhǎng)度約為20個(gè)氨基酸。在HDT901中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有意義的跨膜區(qū)(圖3-B)。SRT901在72-90和283-303區(qū)域可形成2個(gè)分別以82，293為中心的由膜內(nèi)到膜外的跨膜螺旋，在280-300、305-324和338-354區(qū)域可形成3個(gè)分別以290，313，346為中心的由膜外到膜內(nèi)的跨膜螺旋，但有意義的只有2處，分別是從283-303的膜內(nèi)到膜外和280-300的膜外到膜內(nèi)的跨膜，且各跨膜區(qū)長(zhǎng)度約為21個(gè)氨基酸(圖3-C)。

2.3.2 二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指其主鏈折疊產(chǎn)生的由氫鍵維系的有規(guī)則結(jié)構(gòu)。利用PredictProtein在線程序(https://www.predictprotein.org/)對(duì)HDAC家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果(表5)顯示，毛果楊HDAC家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主。在RPD3/HDA1亞家族的11個(gè)蛋白中，除了HDA912無(wú)規(guī)則卷曲比例為49.66%外，其他10個(gè)蛋白無(wú)規(guī)則卷曲比例都在50%以上，β-折疊在10%左右，其余為α-螺旋。HD2作為植物特有的一類組蛋白去乙?；?，在二級(jí)結(jié)構(gòu)上明顯不同于其他2個(gè)亞家族成員。HD2亞家族中的3個(gè)成員HDT901、HDT902和HDT903均不含有α-螺旋，含有β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，其中無(wú)規(guī)則卷曲比例較高，達(dá)80%左右。而SIR2亞家族各蛋白結(jié)構(gòu)比例由高到低依次為無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊。

分別以3個(gè)家族的HDA901、HDT901和SRT901為例，來(lái)說(shuō)明α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲在HDAC不同亞家族蛋白質(zhì)分子中的分布(圖4)。RPD3/HDA1亞家族成員的α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲在整個(gè)蛋白分子各部位均有分布。HD2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)比較特殊，不含有α-螺旋，β-折疊位于蛋白質(zhì)的N-端，其后為大段的無(wú)規(guī)則卷曲。SIR2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與RPD3/HDA1亞家族成員類似，其α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲散布于整個(gè)蛋白分子。

2.4 毛果楊HDAC家族蛋白亞細(xì)胞定位

研究HDAC家族蛋白的細(xì)胞定位，對(duì)于分析該蛋白的功能具有重要意義。對(duì)玉米、擬南芥和水稻等植物的研究表明，RPD3/HDA1亞家族蛋白定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器中[18]。利用WoLF PSORT在線軟件(https://wolfpsort.org/)對(duì)毛果楊HDAC家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果(表6)表明，毛果楊HDAC家族蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布比較廣泛，但主要定位于細(xì)胞核，其次是細(xì)胞質(zhì)和線粒體，有的在葉綠體、過(guò)氧化物酶體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架等部位也有分布。在RPD3/HDA1亞家族的11個(gè)蛋白中，HDA901、HDA910和HDA912這3種蛋白沒(méi)有定位于細(xì)胞核內(nèi)，主要位于細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)中；HDA904、HDA905、HDA906主要定位在細(xì)胞質(zhì)；其他的RPD3/HDA1亞家族成員主要定位在細(xì)胞核。此外，RPD3/HDA1亞家族蛋白的某些成員在過(guò)氧化物酶體、質(zhì)膜、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架中也有少量分布，或者在細(xì)胞器之間穿梭。HDAC定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器表明除了組蛋白外，其他非組蛋白類的蛋白質(zhì)也可能是HDAC的作用底物。HD2亞家族的3個(gè)蛋白主要定位在細(xì)胞核，只有HDT901在線粒體有少量分布。SIR2亞家族的SRT901主要定位于線粒體，也穿梭于葉綠體-線粒體和細(xì)胞質(zhì)之間；而SRT902在細(xì)胞中定位廣泛，主要分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。

2.5 毛果楊HDAC家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線分析工具SWISSMODEL同源建模服務(wù)器對(duì)毛果楊HDAC家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，方法為同源比對(duì)建模的方式，取Blast之后期望值(E值)最小的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果(圖5)顯示，HDAC家族16種蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)可分為6種類型。RPD3/HDA1亞家族中HDA902、HDA903、HDA904、HDA908和HDA909三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度較高；HDA901、HDA905、HDA906和HDA907三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度較高；HDA912具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，不同于其他的在進(jìn)化上與之相近的蛋白質(zhì)(如HDA901、HDA905、HDA906和HDA907)；HDA910與其他RPD3/HDA1 亞家族蛋白在序列上存在差異，其三級(jí)結(jié)構(gòu)也有差異。HD2亞家族序列在SWISSMODEL預(yù)測(cè)中無(wú)三級(jí)結(jié)構(gòu)，可能由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)缺少α-螺旋所致。SIR2亞家族共有2個(gè)成員，2個(gè)成員間序列差異較大，三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)相似性?？傮w而言，HDAC在三級(jí)結(jié)構(gòu)上有共同之處，即主要由5～8個(gè)同向的β-折疊排列形成β-片層結(jié)構(gòu)，外面由6～9個(gè)α-螺旋包圍；但不同類別的HDAC所擁有的α-螺旋和β-折疊在數(shù)目及空間排布有所不同。在三級(jí)結(jié)構(gòu)上相似度高的HDAC家族成員可能具有相近的功能，三級(jí)結(jié)構(gòu)明顯不同的HDAC蛋白在功能上可能存在差別。

2.6 ABA對(duì)毛果楊HDAC家族基因表達(dá)的影響

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分析了毛果楊葉片HDAC家族基因的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 ABA處理對(duì)毛果楊葉片HDAC家族基因表達(dá)的影響HDAC基因相對(duì)表達(dá)水平指與處理前(0 h)比較的相對(duì)值，* 表示基因表達(dá)與處理前相比差異達(dá)到顯著水平(P<0.05 )
Fig.6 Expression of leaf HDAC genes inPopulustrichocarpain response to ABA treatment The expression levels of 16 HDAC genes are relative to their respective transcription levels before ABA treatment. * represents significant difference (P<0.05)

圖6表明，毛果楊HDAC家族基因的表達(dá)受ABA的調(diào)節(jié)，不同家族成員對(duì)ABA的應(yīng)答反應(yīng)不同。ABA處理6 h顯著提高了毛果楊HDA901、HDA903和HDT901基因的表達(dá)，其中HDA901的表達(dá)水平較對(duì)照(0 h)提高了2.1倍。而ABA處理24 h顯著降低了HDA907和HDT901基因的表達(dá)，其中HDT901表達(dá)水平較對(duì)照(0 h)下降了約2/3。HDA901和HDT901這2個(gè)基因的表達(dá)水平受ABA處理時(shí)間的影響，這2個(gè)基因在ABA處理早期(6 h)表達(dá)上調(diào)，在ABA處理晚期(24 h)表達(dá)下調(diào)。

3 討 論

在眾多植物中，人們對(duì)擬南芥HDAC家族基因的功能研究相對(duì)比較清楚，如擬南芥AtHDA6、AtHDA19和AtHD2C等。本研究對(duì)毛果楊HDAC家族成員和擬南芥HDAC家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，毛果楊RPD3/HDA1亞家族中的PtHDA902和 PtHDA903與擬南芥AtHDA19處于一個(gè)進(jìn)化分支，在氨基酸序列上具有很高的同源性，相似性分別達(dá)85%和83%。毛果楊PtHDA908和 PtHDA909與擬南芥AtHDA6處于一個(gè)進(jìn)化分支，其氨基酸序列上與擬南芥AtHDA6具有很高的同源性，相似性分別達(dá)82%和79%。毛果楊3個(gè)HD2蛋白(PtHDT901、PtHDT902和PtHDT903)與擬南芥AtHDT3處于同一進(jìn)化分支。進(jìn)化途徑相似、同源性高預(yù)示這些蛋白可能具有相似的功能。而擬南芥AtHDA19、 AtHDA6、AtHDT3已經(jīng)被證明參與了生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)及多種生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，故推測(cè)PtHDA902、PtHDA903、PtHDA908、PtHDA909和HD2蛋白很可能在毛果楊生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究經(jīng)過(guò)多種分析后發(fā)現(xiàn)，毛果楊HD2亞家族蛋白與其他HDAC亞家族成員有很大差異。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，毛果楊HD2亞家族3個(gè)成員均不含α-螺旋，也不含跨膜螺旋。α-螺旋一般是由疏水性氨基酸疏水作用形成的，是跨膜蛋白中跨膜螺旋的主要組成部分。毛果楊HD2亞家族蛋白的氨基酸序列富含親水性氨基酸，不易形成α-螺旋，而α-螺旋的缺失導(dǎo)致其跨膜功能喪失。據(jù)此推測(cè)，毛果楊HD2亞家族蛋白不是膜蛋白，很可能是可溶性蛋白。對(duì)毛果楊HDAC家族蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，毛果楊HD2蛋白幾乎只在細(xì)胞核內(nèi)分布，與擬南芥和玉米HD2蛋白相同[18]。HD2蛋白在氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞定位上的獨(dú)特性，暗示其生理功能可能不同于HDAC的其他亞家族成員。

ABA調(diào)節(jié)HDAC基因的表達(dá)是植物對(duì)ABA應(yīng)答反應(yīng)的一部分。一些研究表明，ABA能夠抑制HDAC基因的表達(dá)。例如ABA處理24 h能夠抑制水稻HDAC一些基因，如HDT701、HDT702、SRT701和SRT702的表達(dá)[15]；ABA處理6 h能夠抑制擬南芥HD2亞家族基因(包括HD2A、HD2B、HD2C和HD2D)的表達(dá)[41,43]；Zhang等[46]的研究表明，ABA處理48和72 h后均能抑制玉米HDAC基因(包括HDA101、HDA102、HDA106、HDA108、HD1B和HD2)的表達(dá)。此外，不同的HDAC家族成員可能對(duì)ABA的反應(yīng)也不同，如大麥HvHDAC2-1 在ABA處理24 h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平顯著提高；而HvHDAC2-2 在ABA處理24 h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平則沒(méi)有顯著變化，在ABA處理6 h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平下降[47]。

目前，對(duì)楊樹HDAC基因的表達(dá)和功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究分析了ABA處理?xiàng)l件下毛果楊HDAC基因的表達(dá)，結(jié)果表明，某些HDAC基因的表達(dá)受ABA的調(diào)節(jié)，暗示這些HDAC基因可能參與ABA信號(hào)反應(yīng)過(guò)程。ABA處理6 h時(shí)，HDA901基因的表達(dá)上調(diào)了2倍以上，這與前人在大麥[47]中的研究相似，大麥HvHDAC2-1的表達(dá)也受ABA的誘導(dǎo)[47]。而ABA處理24 h能夠抑制毛果楊HD2亞家族成員HDT901的表達(dá)(下降了近2/3)，這與在擬南芥[41-42]、水稻[15]和玉米[46]中的研究相似，即ABA處理能夠抑制HDAC的表達(dá)。在大多數(shù)的研究中，HDAC基因的表達(dá)是受ABA抑制的，HDAC基因的抑制可能與ABA和逆境脅迫條件下染色體重塑有關(guān)[48]，進(jìn)而影響與ABA和脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，使植物對(duì)脅迫和相關(guān)生理過(guò)程做出應(yīng)答反應(yīng)。

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Sequence and gene expression of histone deacetylases (HDAC) gene family ofPopulustrichocarpa

LI Shu-juana,ZHANG Chaoa,ZHANG Yan-nib,DONG Ya-rub,MA Xu-juna

(aStateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreeding(NortheastForestryUniversity),bSchoolofLandscape,NortheastForestryUniversity,Harbin,Heilongjiang150040,China)

【Objective】 The sequence and expression of histone deacetylase (HDAC) family genes ofPopulustrichocarpaand their response to ABA were investigated to provide useful information for future functional studies.【Method】 16 HDAC proteins fromPopulustrichocarpawere analyzed with the bio-informatics tools.The expression levels of the 16 HDAC family genes in leaves after 100 μmol/L ABA treatment for 6 and 12h were analyzed using real-time PCR.【Result】 The populus HDACs could be classified into three sub-families,including RPD3/HDA1,HD2 and SIR2,and they had close relationship with HDACs fromArabidopsisthaliana.Almost all of the HDACs (except HDA912) were hydrophilic proteins and their isoelectric points (pI) were low (except for HDA912 and SIR2 sub-family).HDACs activities were regulated by phosphorylation,whichmajorly occured at the serine residues.Most of the populus HDACs had trans-membrane helices with different numbers and directions,whereas no helices were predicted in HD2 proteins.For RPD3/HDA1 and SIR2 proteins,the secondary structures included α-helices,β-strands and loops,and the percentages of loops were as high as 50% (except for HDA912).The three populus HD2 proteins had no α-helices in their secondary structures,and the loops were their primary secondary structure,accounting for ～80%.Populus HDACs were majorly localized in nucleus.They also distributed in organelles,cytoplasm or membrane components,whereas HD2 proteins were exclusively localized in nucleus. The tertiary structures of populus HDACs could be classified into 6 types,suggesting that they may have different functions.Real-time PCR analysis showed that the expression ofHDA901,HDA903 andHDT901 genes were significantly improved by 6 h ABA treatment,whereas the expression ofHDA907 andHDT901 gene were significantly down-regulated by 24h ABA treatment. 【Conclusion】 The populus HD2 sub-family members,as plant specific histone deacetylases,were found different in many properties from other HDAC members.The expressions of HDAC genes were regulated by ABA and different HDAC members responded differently.

Populustrichocarpa;histone deacetylase;bio-informatics;abscisic acid (ABA);gene expression

2013-10-28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31200497)；中央高校青年教師自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目 (DL12BA01)；黑龍江省博士后基金項(xiàng)目(LBH-Z13006)；國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102701)

李淑娟(1967-)，女，黑龍江哈爾濱人，副教授，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail:lishujuan@126.com

馬旭俊(1974-)，女，黑龍江哈爾濱人，講師，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail:mxj3000@sina.com

時(shí)間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.001

S792.119；Q78

A

1671-9387(2015)03-0063-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.001.html