盧朝成，符華林，范巧佳，張 偉，舒 剛，周 濤，張艷麗，劉夢(mèng)嬌

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

響應(yīng)面法優(yōu)化促孕灌注液中總黃酮的提取工藝

盧朝成，符華林，范巧佳，張 偉，舒 剛，周 濤，張艷麗，劉夢(mèng)嬌

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

【目的】 采用響應(yīng)面法優(yōu)化促孕灌注液中總黃酮的提取工藝，為促孕灌注液總黃酮的實(shí)際生產(chǎn)提供參考?！痉椒ā?采用水煎醇沉法制備促孕灌注液，以總黃酮得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面的中心組合設(shè)計(jì)，考察液(mL)料(g)比(下同)、煎煮時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)促孕灌注液中總黃酮得率的影響，對(duì)總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析。【結(jié)果】 單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳浸泡時(shí)間為10 min，液料比為15∶1，煎煮時(shí)間為30 min，提取次數(shù)為3次。選擇對(duì)總黃酮得率影響明顯的液料比、煎煮時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗(yàn)，得到總黃酮最優(yōu)提取條件為：液料比17.5∶1，煎煮38 min，提取3次。在最優(yōu)提取工藝條件下，促孕灌注液總黃酮的理論得率為14.082 mg/g，實(shí)測(cè)得率為14.193 mg/g，二者誤差較小?！窘Y(jié)論】 優(yōu)化得到了促孕灌注液中總黃酮提取工藝，該工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好、總黃酮得率高。

促孕灌注液；總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面優(yōu)化；水煎醇沉法

促孕灌注液為《中國(guó)獸藥典》(2010年版第2部)收錄的成方制劑，由淫羊藿、紅花和益母草3味中藥通過水煎醇沉法制備而成，是防治母畜卵巢靜止和持久黃體不孕癥的中藥成方制劑。經(jīng)臨床證明，該制劑治療效果確切、治愈率高、不良反應(yīng)小、耐藥率低，因而受到越來越多的關(guān)注[1-2]。黃酮是促孕灌注液中的主要成分，有激素樣作用[3-5]。有研究表明，促孕灌注液中的黃酮有促進(jìn)子宮生長(zhǎng)和卵巢排卵的作用[6-7]。

目前對(duì)促孕灌注液的研究較多[2,7]，也已有不同提取工藝的研究報(bào)道[8-9]。如周淑貞等[10]考察了不同提取方法對(duì)促孕灌注液中有效成分含量的影響，認(rèn)為半仿生醇沉法能夠提高有效成分的含量。水煎醇沉法是《中國(guó)獸藥典》中促孕灌注液的法定提取方法，但這種方法對(duì)促孕灌注液總黃酮的提取效率如何尚未見研究報(bào)道。本研究采用紫外分光光度法測(cè)定促孕灌注液中的總黃酮含量，利用單因素試驗(yàn)分析水煎醇沉法提取促孕灌注液中黃酮類化合物的主要影響因素，并采用響應(yīng)面法[11-12]優(yōu)化提取工藝，以期得到促孕灌注液總黃酮的最優(yōu)提取條件，進(jìn)而為其實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀 器

UV-2102P型分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；電子天平，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司。

1.2 材 料

淫羊藿，四川洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120401；紅花，四川御鼎堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：465120901；益母草，四川洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120601；以上藥材經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)范巧佳副教授鑒定均為正品藥材。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707；無水三氯化鋁，天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20121102。其他試劑均為分析純。

1.3 總黃酮測(cè)定方法的建立

采用紫外分光光度法測(cè)定促孕灌注液中的總黃酮。精密稱定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇適量，水浴微熱溶解，放冷至室溫，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容，配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的蘆丁母液。吸取蘆丁母液1.25，1.50，1.75，2.00，2.25，2.50，2.75 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加l mol/L三氯化鋁溶液1.00 mL，再加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇至刻度，搖勻，使蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液最終質(zhì)量濃度分別為10，12，14，16，18，20和22 μg/mL，以不加蘆丁母液的溶液為空白對(duì)照，于415 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、吸光度為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.4 供試品中總黃酮的測(cè)定

精密吸取制備的促孕灌注液供試品100 μL置于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容，搖勻；取1 mL樣品于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L三氯化鋁溶液1 mL，加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液至刻度，搖勻，以不加樣品的溶液為空白對(duì)照，于415 nm處測(cè)定吸光度，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算總黃酮的質(zhì)量濃度，并按以下公式計(jì)算提取物中總黃酮的得率(Y，mg/g)：

式中：c為供試品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，μg/mL,由回歸方程計(jì)算；a為測(cè)定時(shí)提取液的稀釋倍數(shù)；V為提取液的總體積,mL；m為3味藥材的總質(zhì)量,g。

1.5 促孕灌注液的制備

稱取淫羊藿4.0 g、益母草4.0 g、紅花2.0 g于300 mL燒杯中，加入適量的蒸餾水，浸泡一定時(shí)間后，按不同提取次數(shù)和提取時(shí)間煮沸提取，紗布過濾，合并提取液，濃縮，放冷，加入一定量的乙醇除去雜質(zhì)，抽濾，除去濾液中的乙醇，加蒸餾水到10.0 mL，即得促孕灌注液。

1.6 促孕灌注液中總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

按照1.5節(jié)方法，保持其他條件不變，分別考察浸泡時(shí)間、液(mL)料(g)比(下同)、煎煮時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響。

(1)浸泡時(shí)間。固定液料比為10∶1，煎煮10 min，提取2次，考察不同浸泡時(shí)間(0，10，20，30，40 min)對(duì)總黃酮得率的影響。

(2)液料比。固定浸泡時(shí)間為10 min，煎煮10 min，提取2次，考察不同液料比(10∶1，12.5∶1，15∶1，17.5∶1，20∶1)對(duì)總黃酮得率的影響。

(3)煎煮時(shí)間。固定浸泡時(shí)間為10 min，液料比為15∶1，提取2次，考察不同煎煮時(shí)間(10，20，30，40，50 min)對(duì)總黃酮得率的影響。

(4)提取次數(shù)。固定浸泡時(shí)間為10 min，液料比為15∶1，煎煮10 min，考察不同提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.7 響應(yīng)面法優(yōu)化促孕灌注液中總黃酮的提取工藝

為了分析各因素之間的交互作用對(duì)促孕灌注液中總黃酮得率的影響，以確定最佳的提取工藝，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert 8.05b設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別以液料比、煎煮時(shí)間、提取次數(shù)這3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平組合試驗(yàn)，共計(jì)17個(gè)試驗(yàn)組合，試驗(yàn)因素及水平見表1。每個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，以總黃酮得率為指標(biāo)確定最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮測(cè)定方法的建立

以蘆丁質(zhì)量濃度為自變量x、吸光度為因變量y進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.024 6x+0.017 4，R2=0.999 3，在x=10～22 μg/mL線性關(guān)系良好。日內(nèi)和日間精密度及回收率測(cè)算結(jié)果(表2)表明，該測(cè)定方法穩(wěn)定，重復(fù)性高。

2.2 浸泡時(shí)間對(duì)促孕灌注液中總黃酮得率的影響

如圖1顯示，浸泡時(shí)間對(duì)促孕灌注液中總黃酮得率的影響不明顯，這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的總黃酮等有效成分因細(xì)胞壁的影響不易擴(kuò)散到提取液中所致。但是為了盡量使藥材表面潤(rùn)濕，為加熱時(shí)有效成分的擴(kuò)散提供條件，浸泡時(shí)間以10 min為宜。

2.3 液料比對(duì)促孕灌注液中總黃酮得率的影響

圖2結(jié)果表明，當(dāng)液料比達(dá)到15∶1之前，隨著液料比的增加，總黃酮得率變化較大。這可能是在一定范圍內(nèi)，液料比的增加使得提取過程中的濃度差增加，藥物易于從藥材組織中擴(kuò)散出來[13]；但是隨著液料比的進(jìn)一步增加，提取液的增加使?jié)饪s時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮因長(zhǎng)時(shí)間受熱被破壞，使得其得率未能明顯增加[14]。所以本著節(jié)約資源和控制生產(chǎn)成本的原則，選擇液料比為15∶1。

2.4 煎煮時(shí)間對(duì)促孕灌注液中總黃酮得率的影響

圖3表明，在煎煮10～50 min時(shí),隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，促孕灌注液總黃酮得率呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，其中以煎煮時(shí)間為30 min時(shí)提取效果最好。這可能是因?yàn)殡S著煎煮時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，其中的黃酮類物質(zhì)因長(zhǎng)時(shí)間受熱而分解[15]所致。

2.5 提取次數(shù)對(duì)促孕灌注液中總黃酮得率的影響

由圖4可以看出，提取次數(shù)為1～3次時(shí)，隨提取次數(shù)增加，促孕灌注液總黃酮得率持續(xù)增加。提取次數(shù)為4次和5次時(shí)，總黃酮得率與提取3次時(shí)相比略有下降?？紤]到增加提取次數(shù)可使提取液體積增加，導(dǎo)致濃縮時(shí)工作量增加，從而增加生產(chǎn)成本，所以提取次數(shù)以3次為宜。

2.6 促孕灌注液總黃酮提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，浸泡時(shí)間對(duì)促孕灌注液中總黃酮提取影響不大，因此選取對(duì)總黃酮提取影響顯著的液料比(A)、煎煮時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)為變量，以總黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合。得到促孕灌注液中總黃酮的得率(Y)對(duì)液料比(A)、煎煮時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)的二次多項(xiàng)回歸模型為：總黃酮得率(Y,mg/g)=14.11+0.16A+0.27B+0.60C+0.21AB+0.056AC+0.099BC-0.55A2-0.36B2-0.66C2。方程回歸分析及促孕灌注液中總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析結(jié)果見表4。

對(duì)各項(xiàng)進(jìn)行F檢驗(yàn)，P<0.05為顯著項(xiàng)，P<0.01為極顯著項(xiàng)。由表4方差分析結(jié)果可知，模型F值為4.957 163，0.01F=0.023 2<0.05，表明該模型顯著，不同處理間差異顯著，說明試驗(yàn)結(jié)果合理，回歸方程在試驗(yàn)點(diǎn)上與結(jié)果擬合較好。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.864 4，說明此模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好；試驗(yàn)失擬項(xiàng)小，說明試驗(yàn)方法可靠，能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，使用該方程代替真實(shí)的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析是可行的；其中C、A2、C2項(xiàng)對(duì)總黃酮得率的影響顯著，由此可以看出試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的關(guān)系不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[16]，二次項(xiàng)也對(duì)響應(yīng)值有很大的影響，根據(jù)方程所繪制的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5～7。

圖5顯示，促孕灌注液總黃酮得率受液料比與煎煮時(shí)間交互作用的影響，當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率先增加達(dá)到峰值后又有所減小；當(dāng)煎煮時(shí)間一定時(shí)，得率隨著液料比的增加也是先增加后減小。圖6表明，總黃酮得率受液料比與提取次數(shù)交互作用的影響，當(dāng)液料比(或提取次數(shù))一定時(shí)，得率均隨著提取次數(shù)(或液料比)的增加先提高后降低。圖7表明，煎煮時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)總黃酮的得率有交互影響，當(dāng)煎煮時(shí)間一定時(shí)，總黃酮得率隨提取次數(shù)的增加先增加后減??；當(dāng)提取次數(shù)一定時(shí)，得率隨著煎煮時(shí)間的增加先增加后減小。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert 8.05b軟件求解方程，得到促孕灌注液中總黃酮的最佳提取工藝條件為：液料比17.5∶1，煎煮時(shí)間37.55 min，提取次數(shù)3.55次，此條件下總黃酮理論得率為14.082 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的局限性，將上述試驗(yàn)條件修正為：液料比17.5∶1，煎煮38 min，提取3次。用修正后的試驗(yàn)條件進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總黃酮的平均得率為14.193 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本一致(相對(duì)誤差僅為0.78%)，表明該方程對(duì)實(shí)際情況擬合較好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。

3 結(jié) 論

本研究以促孕灌注液中的總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)際生產(chǎn)中從促孕灌注液提取總黃酮的工藝條件。最終優(yōu)化得到的提取工藝為：液料比17.5∶1，煎煮時(shí)間38 min，提取次數(shù)3次，在該工藝條件下總黃酮的平均得率較高，為 14.193 mg/g。本研究結(jié)果為實(shí)際生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of total flavonoids extraction from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid using response surface methodology

LU Chao-cheng,FU Hua-lin,FAN Qiao-jia,ZHANG Wei,SHU Gang, ZHOU Tao,ZHANG Yan-li,LIU Meng-jiao

(CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 This study estimated the optimal conditions for total flavonoids extraction from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid based on response surface methodology to provide theoretical foundation for its further processing and utilization.【Method】 The Fertility-promoting intrauterine infusion liquid was prepared by decoction and alcohol precipitation.On the basis of single factor test,response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions including water (mL)-feed (g) ratio (the same below),boiling time,and extraction times.【Result】 The optimum soaking time,water-feed ratio,boiling time,and extraction times based on single factor test were 10 min,15∶1,30 min,and 3 times,respectively.The water-feed ratio,boiling time and extraction times that had significant effects on the extraction rate of total flavonoids were selected for response surface optimization test.The optimal water-feed ratio,boiling time,and extraction times were 17.5∶1,38 min,and 3 times,respectively.The predicted extraction rate of 14.082 mg/g was very close to observed rate of 14.193 mg/g.【Conclusion】 The optimized extraction process was stable,reproducible,and had high total flavonids yield from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid.

Fertility-promoting intrauterine infusion liquid;total flavonoids;extraction of condition;response surface optimization;decoction and alcohol precipitation

2013-10-22

教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目(IRT0848)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“優(yōu)秀碩士論文培育基金”項(xiàng)目

盧朝成(1987-)，男，四川龍泉驛人，在讀碩士，主要從事藥物新劑型研究。E-mail:luchaocheng712@sina.com

符華林(1972-)，男，四川華鎣人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型與新制劑研究。 E-mail:fuhl2005@sohu.com

時(shí)間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.022

S853.76;R944.1

A

1671-9387(2015)03-0007-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.022.html