α-葡萄糖苷酶納米粒的制備及其性質(zhì)研究*

★陳嬋娟1*第一作者：陳蟬娟。研究方向：中藥活性成分。尹小英2*通信作者：尹小英，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥活性成分。Tel:13979189135，E-mail:912012993.com。沙碧瑩2衷友泉2(1.南豐縣新型農(nóng)村合作醫(yī)療管理局江西 撫州 344500；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330004)

摘要：目的：為從中藥提取物中高效的靶向分離、篩選具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分。方法：采用共價(jià)結(jié)合法以殼聚糖復(fù)合納米粒為載體，制備固定化α-葡萄糖苷酶靶向親和材料，并采用陽(yáng)性對(duì)照阿波糖驗(yàn)證該固定化酶對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的吸附性能。結(jié)果：固定化α-葡萄糖苷酶進(jìn)行富集實(shí)驗(yàn)的最佳pH為6，最適溫度為60℃，在有變性劑的條件下固定化酶的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于相應(yīng)游離酶。結(jié)論：α-葡萄糖苷酶納米?？蓱?yīng)用于中藥復(fù)雜體系中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選。

關(guān)鍵詞：α-葡萄糖苷酶；固定化酶；納米粒；抑制劑；篩選

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)又稱α-D-葡萄糖苷水解酶，它既能催化α-1,4-糖苷鍵，也是小腸內(nèi)麥芽糖、蔗糖等多種寡糖的水解酶[1-2]。α-葡糖苷酶抑制劑可以預(yù)防治療某些疾病如糖尿病，高脂蛋白血癥，肥胖癥和高脂血癥[3-6]。如何從中藥中獲取α-葡萄糖苷酶抑制劑是尋找新型糖尿病治療藥物的熱點(diǎn)問(wèn)題。

從中藥復(fù)雜體系中靶向篩選活性化合物最直接的方法是將中藥提取液與游離酶進(jìn)行孵育，再利用適當(dāng)方法將與酶結(jié)合的活性化合物進(jìn)行洗脫分離。這種方法最大不足是游離酶不能反復(fù)利用，實(shí)驗(yàn)成本高。因此，制備保持原有活性的固定化酶是實(shí)現(xiàn)活性成分靶向篩選的重要途徑。與游離酶相比固定化酶有以下優(yōu)點(diǎn)：①在大多數(shù)的情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；②易于把固定化酶與產(chǎn)物、底物分開(kāi)，可以反復(fù)利用；③增大酶對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗能力[7]。但是固定化酶較游離酶的活性降低，因此通過(guò)選擇合適的固定化載體和固定化方法以提高固定化酶的穩(wěn)定性，降低酶活性損失。

本實(shí)驗(yàn)中，采用共價(jià)結(jié)合法將α-葡萄糖苷酶固定在殼聚糖復(fù)合納米粒上,以期獲得一種生物相容性好，與酶結(jié)合穩(wěn)定性好的靶向分離親和材料，以實(shí)現(xiàn)反復(fù)使用。本文考察固定化酶的性質(zhì)，并應(yīng)用陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖驗(yàn)證固定化α-葡萄糖苷酶的吸附性能。這種靶向分離材料可以作為中藥中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選模型，為后續(xù)的應(yīng)用提供新型分離材料。

1材料

1.1　試劑

α-葡萄糖苷酶、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、叔丁基過(guò)氧化氫(TBHP)購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)購(gòu)于杭州民生生物科技有限公司；對(duì)硝基苯酚購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛(25%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿卡波糖對(duì)照品(批號(hào)100808-201003中國(guó)食品藥品檢定所)；甲醇、乙腈為色譜純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽為分析純；水為雙蒸水。

1.2　儀器

CHY-2型恒溫振蕩器(江蘇金壇富華儀器有限公司)；HH-HS恒溫水浴鍋(上海南陽(yáng)儀器公司)；UV2102型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Unico公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

2方法與結(jié)果

2.1　殼聚糖的純化

精密稱取2.0g殼聚糖溶于100 mL醋酸溶液(1%v/v)中，室溫?cái)嚢钘l件下用100g/L的氫氧化鈉溶液中和析出，過(guò)濾，蒸餾水洗滌沉淀至中性，60°C真空干燥。

2.2　殼核聚甲基丙烯酸甲酯/殼聚糖復(fù)合納米粒(PMMA/CS)的制備

分別稱取一定量的已純化的殼聚糖，溶于不同體積的1%(v/v)醋酸溶液中，將溶液轉(zhuǎn)入配備溫度計(jì)，冷凝器，磁力攪拌器，氮?dú)馊肟诘臒恐小Ｏ驘恐屑尤胍欢考兓腗MA，通氮?dú)?0min。升溫到80°C。將不同體積的TBHP分別添加到混合物中，在80°C氮?dú)獗Ｗo(hù)攪拌一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，離心(13 000r/min)10min，去除上清液液，烘干，用丙酮在索氏萃取器中抽提48h，除去PMMA多聚物，干燥至恒重。

2.3　α-葡萄糖苷酶的固定化

取一定量的殼聚糖納米粒溶液(殼聚糖含量為0.1mg)，加入40μL戊二醛溶液(25%)，室溫下振搖90min，離心，除去上清液，蒸餾水洗滌三次。加入2.0mL 1.0mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液(pH=6.8磷酸鹽緩沖液)，冰水浴(0℃～4℃)振搖混合液90min，離心10min(13000r/min)，收集上清液，蒸餾水洗滌沉淀3次，洗滌至用G-250試劑檢測(cè)不到洗滌液中蛋白質(zhì)的存在，將上清液與洗滌液合并以計(jì)算殘余α-葡萄糖苷酶的量。

2.4　固定化酶α-葡萄糖苷酶性能研究

2.4.1固定化α-葡萄糖苷酶的最佳pH值測(cè)定取一定量的固定化酶分別加入不同pH的磷酸鹽緩沖液(pH在3.0～7.0之間)，每0.5個(gè)pH單位為1份，在40℃下加入適量的底物反應(yīng)，測(cè)量酶活力。酶活力以最高酶活力的相對(duì)百分?jǐn)?shù)表示。

依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得固定化α-葡萄糖苷酶的pH值與相對(duì)酶活性的趨勢(shì)圖1，從圖1可以看出固定化α-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性明顯高于游離酶，尤其pH在4.5～6.5范圍內(nèi)，其相對(duì)酶活力均保持在80%以上，固定化α-葡萄糖苷酶的最佳pH在6附近。

圖1　固定化α-葡萄糖苷酶的pH值對(duì)固定化酶活性的影響

2.4.2固定化α-葡萄糖苷酶的最適溫度取一定量的固定化酶和1mL游離酶溶液分別在20，30，40，50，60，70，80℃下加入適量的底物反應(yīng)測(cè)定的固定化α-葡萄糖苷酶活力。酶活力以最高酶活力的相對(duì)百分?jǐn)?shù)表示。

依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得固定化α-葡萄糖苷酶的濕度對(duì)固定化酶活性影響的趨勢(shì)圖(見(jiàn)圖2)，從圖2可以看出α-葡萄糖苷酶的最適溫度為60℃，游離酶的最適溫度為50℃，固定化α-葡萄糖苷酶的最適溫度比游離酶高10℃。這可能是由于α-葡萄糖苷酶與殼聚糖吸附-固定化后，使其對(duì)溫度的敏感性增加。固定化酶的最適溫度與游離酶相比，有可能提高、降低或者不變。

圖2　固定化α-葡萄糖苷酶的溫度對(duì)固定化酶活性的影響

圖3　變性劑(甲醇)對(duì)固定化α-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響

圖4　固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.4.3變性劑(甲醇)對(duì)固定化酶穩(wěn)定性的影響在40℃下，用不同濃度(體積分?jǐn)?shù)為20%，40%，60%，80%，100%)的甲醇對(duì)固定化酶和游離酶分別處理4h，然后在40℃，pH=6.0條件下測(cè)定酶活力。依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得變性劑(甲醇)對(duì)固定化α-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性影響的趨勢(shì)圖(見(jiàn)圖3)。

結(jié)果表明，無(wú)論是游離酶還是固定化酶，都對(duì)甲醇不穩(wěn)定，但是固定化酶的穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于游離酶，可能是由于載體的存在減少了甲醇與酶的直接接觸。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)它耐有機(jī)溶劑能力很強(qiáng),它能在甲醇-pH=6.8緩沖液(0.1mol/L)中正常地水解底物PNPG，在甲醇-pH=6.8緩沖液(0.1mol/L)中水解底物PNPG的能力比正常情況下高。由于天然產(chǎn)物的成分非常復(fù)雜，有的成分是堿性的，有的成分是酸性，有的是醇溶性的，而有的是水溶性的，上述固定化酶的性質(zhì)為篩選模型提供了較廣的天然產(chǎn)物篩選范圍。

2.4.4固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性將固定化酶在4℃下貯存于pH=6.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中，每10d檢測(cè)1次酶的殘余活力，連續(xù)測(cè)定60d。

固定化酶經(jīng)貯存60d后酶活力無(wú)明顯下降，由圖4可見(jiàn)，經(jīng)固定化后貯存穩(wěn)定性大為提高。

2.5　陽(yáng)性對(duì)照藥驗(yàn)證固定化α-葡萄糖苷酶對(duì)抑制劑的篩選性能研究

取阿卡波糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1mL中含有10mg的溶液，量取lmL置入一定量的固定化酶混懸液中，孵育24h，放入恒溫?fù)u床中，振蕩反應(yīng)30min。將反應(yīng)體系放入高速離心機(jī)中，離心10min(13 000r/min)，取上清液，洗滌3次，合并上清液，檢測(cè)殘余阿卡波糖量。

圖5給出了阿卡波糖被吸附前后量的變化。通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算得出，被吸附后殘余阿卡波糖的量為19%，被吸附量為81%。表明固定化α-葡萄糖苷酶對(duì)阿卡波糖的吸附性能良好。

A.阿卡波糖原液；B.被吸附后的殘余阿卡波糖

圖6　殼核納米粒(PMMA/CS)納米粒透射電鏡照片

2.6　檢測(cè)色譜條件

用氨基硅烷鍵合硅膠為填充劑，磷酸鹽緩沖液-乙腈(28∶72)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm,柱溫35℃。

2.7　PMMA/CS納米粒形貌表征

圖6給出了采用接枝共聚法合成的殼核型的PMMA/CS納米粒的透射電鏡照片。由圖中可以看出PMMA/CS納米粒成圓整的球形，顆粒分散比較均勻。經(jīng)過(guò)磷鎢酸溶液染色后，從透射電鏡的照片中可以看出，分布均勻的PMMA內(nèi)核外包裹著一層厚的親水性殼層。通過(guò)Malvern激光納米粒度儀測(cè)試粒徑及粒徑分布指數(shù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示殼核殼聚糖接枝共聚微球的平均粒徑為239nm，粒徑分布圖為一單峰，統(tǒng)計(jì)圖為正態(tài)分布圖，表明納米粒粒徑均勻且呈單分散分布。

2.8　PMMA/CS納米粒紅外光譜分析

我們還對(duì)PMMA/CS納米粒進(jìn)行了紅外光譜測(cè)定，從殼聚糖紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)圖譜中可以看出3450cm-1是殼聚糖νN-H和νO-H的吸收峰，從圖7光譜圖中可以看出，νN-H的吸收峰增強(qiáng)，νO-H的吸收峰向高波數(shù)移至3630cm-1處。且在光譜圖中3000cm-1、2950cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，均為MMA單體上基團(tuán)中的吸收峰。說(shuō)明殼聚糖已與單體發(fā)生了接枝共聚反應(yīng)。

圖7　PMMA/CS納米粒紅外光譜圖

3討論

陽(yáng)性對(duì)照藥阿波糖已驗(yàn)證了固定化α-葡萄糖苷酶有很好的篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的能力，為了進(jìn)一步證實(shí)，我們選取木蘭花堿、槲皮素、蘆丁對(duì)照品溶液(濃度分別為100μg/mL，100μg/mL，200μg/mL)，經(jīng)與固定化α-葡萄糖苷酶進(jìn)行孵育后，洗脫檢測(cè)，結(jié)果表明，固定化α-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素、蘆丁基本無(wú)吸附作用，而對(duì)木蘭花堿的吸附率得到80%，木蘭花堿是有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，證實(shí)該固定化α-葡萄糖苷酶親和材料對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑具有很好的篩選性能。

參考文獻(xiàn)

[1]Kita A, Matsui H, Somoto A, et al. Substrate Specificity and Subsite Affinities of Crystalline α-Glucosidase from Aspergillus niger[J].Agricultural&Biological Chemistry.,1991,55(9)：2 327-2 335.

[2]Takewaki S I, Kimura A, Kubotra M. et al.Substrate Specificity and Subsite Affinities of Honeybee α-Glucosidase II[J].Bioscience Biotechnology&Biochemistry.,1993,57(9):1 508-1 513.

[3]Horii S, Fukase H. Synthesis of α-glucosidase inhibitiory activity of N-substituted valiolamine derivatives as potential oral antidiabetic agents[J].J Med Chem.,1986,29(6)：1 038-1 046.

[4]Ostrander G K, Scribner N K. Inhibition of V-fms-induced tummor growth in nude mice by castamospermine[J].Cancer Research,1988,48(5)：1 091-1 094.

[5]Gruters R A, Nessfjes J J. Interference with HIV-induced syncytiun formation and viral infectivity by inhibitors of trimming glucosidase[J].Nature,1987,330(6143)：74-77.

[6]Hunziker W, Spiess M, Semenza G,et al. The sucrase-isomaltase complex: primary structure, membrane-orientation, and evolution of astalked, intrinsic brush border protein[J].Cell,1986,46(2)：227-234.

[7]Kimym, Hyeonm, Rhoehi. A novelα-glucosidase inhibitor from pine bark[J].CarbohydrRes,2004,339(3)：715-717.

(收稿日期：2015-09-18)編輯：翟興英

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260690)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(GJJ13618,GJJ12518)。