梁美娥，李小峰，張莉蕓，許 珂，王彩虹，曲世晶

甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α、IL-1的影響

梁美娥1，李小峰2*，張莉蕓1，許 珂1，王彩虹2，曲世晶3

目的 研究甲氨蝶呤(MTX)聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CTX)治療對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)大鼠血清TNF-α、IL-1水平的影響，探討甲氨蝶呤(MTX)聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CTX)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的機(jī)制。方法 建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的雌性Wistar大鼠CIA模型。取15只未造模的健康大鼠作為健康對照組(A組)。將造模成功的75只大鼠隨機(jī)分成5組(每組15只)，B組：造模對照組；C組：小劑量MTX組(每周0.9 mg/kg)；D組：大劑量MTX組(每周2.7 mg/kg)；E組：小劑量CTX組(每3周24 mg/kg)；F組：小劑量MTX聯(lián)合小劑量CTX組(MTX每周0.9 mg/kg，CTX每3周24 mg/kg)。分別在6周、24周檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1的水平。結(jié)果 聯(lián)合應(yīng)用MTX和CTX優(yōu)于小劑量MTX、小劑量CTX單藥治療組。結(jié)論 MTX和CTX聯(lián)合應(yīng)用在RA的治療中具有協(xié)同效應(yīng)。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；甲氨蝶呤；環(huán)磷酰胺；協(xié)同效應(yīng)

0 引言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種高度致殘的自身免疫性疾病，炎性細(xì)胞因子在放大全身免疫紊亂和關(guān)節(jié)局部破壞中發(fā)揮了重要作用，以IL-1、TNF-α作用最為顯著，最終導(dǎo)致周圍關(guān)節(jié)的慢性、對稱性、侵蝕性關(guān)節(jié)炎以及關(guān)節(jié)外血管炎?？梢愿纳芌A病情的抗風(fēng)濕藥物有甲氨蝶呤(MTX)、環(huán)磷酰胺(CTX)等。以往研究已證實(shí)，抗風(fēng)濕藥物的聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于單藥治療[1-2]。本研究采用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen induced arthritis，CIA)大鼠模型[3]檢測MTX、CTX單藥及聯(lián)合用藥后CIA大鼠血清中細(xì)胞因子IL-1、TNF-α水平的變化，旨在探討兩者聯(lián)合應(yīng)用在治療RA時是否有協(xié)同效應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性Wistar大鼠，購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重160～180 g，正常飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 MTX(上海信誼制藥廠)，CTX(山西大同制藥廠)，天然牛Ⅱ型膠原，完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)，大鼠血清TNF-α檢測試劑盒(晶美生物工程有限公司)，大鼠血清IL-1檢測試劑盒(美國Biosource公司)。

1.3 造模和動物分組 根據(jù)文獻(xiàn)[4]的方法加以改進(jìn)。配制Ⅱ型膠原乳劑，初次免疫采用尾根部、背部、任一后足跖部多點(diǎn)皮內(nèi)注射法，每只動物注射免疫復(fù)合物0.5 mL；2周后加強(qiáng)免疫，腹腔注射免疫復(fù)合物0.2 mL(含Ⅱ型膠原0.2 mg)[5]。根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)評分標(biāo)準(zhǔn)評估造模是否成功。取15只未造模的健康大鼠作為健康對照組(A組)。將75只造模成功的CIA大鼠，于造模第21天隨機(jī)分成5組，每組15只，B組：造模對照組；C組：小劑量MTX組(每周0.9 mg/kg)；D組：大劑量MTX組(每周2.7 mg/kg)；E組：小劑量CTX組(每3周24 mg/kg)；F組：小劑量MTX聯(lián)合小劑量CTX組(MTX每周0.9 mg/kg，CTX每3周24 mg/kg)。

1.4 給藥方法 初次免疫設(shè)為第1天，至動物全部處死，歷時24周。初次免疫后3周，C、D、E、F組開始給藥，治療21周，每3周為1個周期。①M(fèi)TX：制成MTX混懸液，采用灌胃給藥法，C組0.9 mg/kg，每周1次；D組2.7 mg/kg，每周1次；首次給藥為初次免疫后3周，共給藥21次。②CTX：于給藥當(dāng)天制成CTX混懸液，采用腹腔注射給藥法；給藥劑量為24 mg/kg，每3周1次；CTX給藥應(yīng)晚于MTX 1 d，即首次給藥為初次免疫后22 d，共給藥8次。③正常組和造模對照組分別給予等量蒸餾水灌胃及等量0.9%氯化鈉液注射。

1.5 采血及細(xì)胞因子的檢測 每只大鼠予5%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，待大鼠肌張力和結(jié)膜反射消失后，將其以俯臥位固定于解剖板，用1 cm左右的毛細(xì)管于眼眶下采血，留取2 mL全血，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心5 min，取上層血清約1 mL，分裝于離心管，置于-70 ℃保存。于初次免疫前及初次免疫后每3周留取血清，直至24周。采用ELISA法檢測血清中兩種細(xì)胞因子的水平。

2 結(jié)果

本研究從初次免疫開始?xì)v時24周，A～E組分別存活8、10、9、8、9、9只。

6周與24周時B組大鼠血清中TNF-α、IL-1水平的比較見表1，24周時B組大鼠血清中TNF-α和IL-1水平均明顯高于6周時(P<0.01)，表明在關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中TNF-α、IL-1水平呈現(xiàn)升高趨勢。對24周時各組TNF-α、IL-1水平(見表2)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用甲氨蝶呤或環(huán)磷酰胺對關(guān)節(jié)炎大鼠TNF-α、IL-1均有抑制作用，兩藥聯(lián)合應(yīng)用時對TNF-α、IL-1的抑制作用更強(qiáng)，兩藥具有協(xié)同作用，見表3、表4。

表1 未用藥組細(xì)胞因子水平比較(U/L)

表2 24周細(xì)胞因子水平比較(U/L)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，▽P<0.05；與D組比較，△P<0.05；與E組比較，※P<0.05

表3 完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計(jì)24周TNF-α水平的方差分析表

表4 完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計(jì)24周IL-1水平的方差分析表

3 討論

關(guān)于RA的發(fā)病機(jī)制，一種學(xué)說認(rèn)為，RA是抗原驅(qū)動，T細(xì)胞依賴的細(xì)胞因子、黏附分子和降解酶參與的炎癥反應(yīng)[6]。環(huán)境抗原進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)過抗原提呈細(xì)胞處理，刺激T細(xì)胞、滑膜發(fā)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，釋放多種細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷；細(xì)胞因子是RA炎癥和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)，其中以“姐妹細(xì)胞因子TNF-а、IL-1”[7]最為重要，它們分別與相應(yīng)受體TNF-a、IL-1結(jié)合后，導(dǎo)致IκB-B發(fā)生磷酸化并降解，導(dǎo)致活化NF-κB蛋白的釋放和核轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步調(diào)節(jié)TNF、IL-2、IL-6、IL-12、M-CSF、GM-CSF、G-CSF等細(xì)胞因子的表達(dá)，這些細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)IL-8、MCP-1、MCP-2等趨化因子而刺激E-cadherin、ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達(dá)[8]，進(jìn)一步活化細(xì)胞、體液免疫，從而產(chǎn)生如下效應(yīng)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。①激活并增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞對黏附分子的表達(dá)，使血液中的白細(xì)胞通過與黏附分子相互作用而集中在關(guān)節(jié)腔，刺激結(jié)締組織細(xì)胞和多形核細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素等小分子炎癥介質(zhì)，使得在RA發(fā)病早期滑膜增生并滲出大量液體，同時導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊、肌腱和腱鞘發(fā)生炎性改變，出現(xiàn)關(guān)節(jié)明顯腫脹；②襯里層滑膜成纖維細(xì)胞大量增生，富含有血管的肉芽組織從關(guān)節(jié)軟骨邊緣的滑膜向軟骨面伸展，最后將軟骨完全覆蓋，阻斷軟骨從滑液中攝取營養(yǎng)，軟骨發(fā)生潰瘍，表面的肉芽組織纖維化，使上下關(guān)節(jié)面相互融合，形成纖維性強(qiáng)直；③刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，使破骨細(xì)胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產(chǎn)生過量的膠原酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維蛋白溶酶激活劑、一氧化氮、基質(zhì)溶素、蛋白聚糖、變性蛋白酶，使得軟骨基質(zhì)崩解，骨質(zhì)疏松，肌肉和皮膚萎縮，關(guān)節(jié)本身畸形或脫位；④有活性的NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)通過抑制胱天蛋白酶-8、10途徑發(fā)揮抗凋亡作用，從而阻斷淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞的凋亡，并使免疫細(xì)胞發(fā)揮正常功能，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的紊亂和局部炎癥反應(yīng)的持續(xù)[9]。故TNF-α、IL-1是RA炎癥形成、血管翳進(jìn)一步增生、軟骨和骨破壞的“罪魁禍?zhǔn)住盵10-12]。

目前，MTX是治療RA的首選藥物。它是二氫葉酸還原酶抑制劑，通過使胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成原料耗竭而抑制DNA和RNA的合成，從而發(fā)揮細(xì)胞毒作用[13-17]。MTX主要作用于S期，對G0/G1到S期轉(zhuǎn)換有延緩作用。MTX的常用劑量為7.5～25 mg/周，其療效容易達(dá)到平臺即類似耐藥現(xiàn)象，而增加劑量可引起較多不良反應(yīng)；故在RA的治療中常采取MTX聯(lián)合其他藥物的治療方案。CTX是烷化劑，主要抑制DNA合成，同時對RNA和蛋白質(zhì)合成也有抑制作用；其對各期細(xì)胞均有殺傷作用，尤其對G0/G1期和G2/M期細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)，屬細(xì)胞周期非特異性藥物。在治療RA時，MTX、CTX聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)細(xì)胞毒作用[2]；同時，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞周期，小劑量間歇性點(diǎn)式給藥。有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：聯(lián)合組較單藥組對RA患者外周血淋巴細(xì)胞(PBL)抑制率明顯增加；細(xì)胞周期檢測，聯(lián)合組PBL的G0/G1期比例明顯增多，細(xì)胞增殖指數(shù)降低，表明MTX、CTX聯(lián)合用藥在抑制RA患者的PBL增殖方面可能有協(xié)同作用[18]。

本研究顯示，未用藥組CIA大鼠24周時血清中TNF-α、IL-1水平高于6周時，表明在關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中TNF-α、IL-1水平呈現(xiàn)升高趨勢；24周時小劑量聯(lián)合治療組與高劑量MTX組對TNF-α、IL-1水平的影響程度相當(dāng)，明顯優(yōu)于小劑量單用藥組；進(jìn)一步對24周時各藥對TNF-α、IL-1影響的析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，MTX與CTX聯(lián)合應(yīng)用時具有協(xié)同作用。

綜上所述，MTX與CTX具有協(xié)同作用，故二者聯(lián)合應(yīng)用于RA的治療，可能效果更好。

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Effect of methotrexate and cyclophosphamide intermittent combination therapy on serum levels of IL-1,TNF-α in collagen-induced arthritis rats

LIANG Mei-e1,LI Xiao-feng2*,ZHANG Li-yun1,XU Ke1,WANG Cai-hong2,QU Shi-jing3

(1.Department of Rheumatology and Immunology,Shanxi Dayi Hospital,Taiyuan 030032,China; 2.Department of Rheumatology and Immunology,The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China; 3.Department of Internal Medicline,The Third Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

Objective To study the effect of methotrexate (MTX) and cyclophosphamide (CTX) intermittent combination therapy on serum TNF-α and IL-1 levels in collagen-induced arthritis (CIA) rats,in order to investigate the possible synergistic effect of the two drugs in the treatment of rheumatoid arthritis (RA).Methods A total of 90 Wistar rats were involved.Among them,75 received two times mixed liquor of cattle Ⅱ collagen and Freund′s complete adjuvant (CFA) by endermic injection to construct CIA rat model,and then divided into 5 groups randomly (15 rats in each group) and received MTX and CTX intermittent combination therapy or control drugs,respectively for 24 weeks.Another 15 non-CIA model rats were included as control group.The changes of arthritis index,arthritis swelling degree,and appearance of imageology and pathology were observed; the serum levels of IL-1 and TNF-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results MTX in the doses of 0.9 mg/kg and 2.7 mg/kg a week could inhibit the appearance of arthritis and serum levels of IL-1 and TNF-α in CIA rats.CTX in a dose of 24 mg/kg every 3 weeks had the same effects.Combination of MTX 0.9 mg/kg a week and CTX 24 mg/kg every 3 weeks could inhibit arthritis index,arthritis swelling degree,and serum levels of IL-1 and TNF-α in CIA rats obviously,and the effect was better than single use of MTX or CTX.Conclusion MTX and CTX have synergistic effects at low dosage in the treatment of CIA.

Collagen-induced arthritis；Methotrexate；Cyclophosphamide；Synergistic effect

2015-01-13

1.山西大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030032；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030001；3.山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院內(nèi)科，太原 030001

山西省自然科學(xué)基金(200711116)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507007

*通信作者