付 娟，尹宜發(fā)，姚 霞，楊 欣

吲哚-3-原醇對人肺癌細胞株A549的促凋亡和增殖抑制作用

付 娟，尹宜發(fā)，姚 霞，楊 欣*

目的 探討吲哚-3-原醇(Indol-3-carbinol，I3C)對肺腺癌細胞株A549細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。方法 將對數(shù)生長期的A549細胞分別用不同濃度的I3C處理(0、25、50、100 μg/mL)。細胞培養(yǎng)72 h后，采用MTT觀察I3C對A549細胞的增殖抑制作用；Annexin V-PI/FITC檢測細胞凋亡；Western blotting檢測細胞中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2、Cleavage-PARP、Clevage-Caspase3蛋白的變化。結(jié)果 I3C可以呈濃度依賴性地誘導(dǎo)A549細胞的增殖抑制和凋亡，上調(diào)Bax和Cleavage-PARP、Cleavage-Caspase3表達，下調(diào)PI3K、p-AKT和Bcl-2，對AKT表達無明顯影響。結(jié)論 I3C可通過抑制PI3K/AKT信號通路而誘導(dǎo)A549細胞增殖抑制和凋亡。

吲哚-3-原醇；A549；增殖；凋亡；PI3K/AKT

0 引言

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率極高，目前高居男性死亡率的第1位，嚴重影響人類健康[1]。目前肺癌的治療方式包括早期手術(shù)切除、放療和化療等，但目前治療手段效果有限，而且不良反應(yīng)大[2]。近年來從自然界天然植物中提取有效成分抗腫瘤成為腫瘤研究的熱點[3-5]。吲哚-3-原醇(Indol-3-carbinol，I3C)是葡萄糖蔓芹苷的前體，大量存在于十字花科類食用蔬菜如西蘭花等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，I3C可以抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)癌細胞凋亡、清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化等作用[6-8]，常用來治療消化道、肝臟和前列腺等處的腫瘤[3-5]。肺癌的發(fā)生是細胞凋亡與細胞增殖平衡失調(diào)的結(jié)果[9]。本研究以人肺腺癌細胞株A549為靶細胞，探討I3C對肺腺癌細胞株A549的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞株A549，購于ATCC，I3C(Sigma，USA)經(jīng)HPLC鑒定純度超過99%；CCK-8試劑盒購自武漢谷歌；Annexin V-FITC凋亡試劑盒(Abcam，USA)，RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國Gibgo公司；小牛血清，杭州四季青公司；12孔培養(yǎng)板，美國Falcon公司；β-actin抗體(Abmart，China)，Bcl-2抗體(Santa Cruz，CA)，Bax抗體(Santa Cruz，CA)，Cleavage-PARP(Santa Cruz，CA)，Cleavage-Caspase3(Santa Cruz，CA)，PI3K(CST，USA)，AKT抗體(CST，USA)，p-AKT抗體(CST，USA)。蛋白裂解液RIPA(碧云天)，蛋白酶抑制劑cocktail及Western blot凝膠制備試劑盒購自武漢谷歌生物公司，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)，酶標儀(Thermo Fisher)。

1.2 細胞培養(yǎng) A549細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加入青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 U/mL)，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Forma scientific公司；倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；酶標儀(Thermo Fisher)。PVDF膜(Roche)，ECL試劑盒(Bi-pech),膠片及化學(xué)發(fā)光儀(Kodak)。

1.4 細胞增殖的MTT法檢測 取對數(shù)生長期A549細胞，接種于12孔板內(nèi)，調(diào)整密度為1×104/mL，每孔100 μL，加入A549(0、25、50、100 μg/mL)，計量參考文獻[10]，每組均設(shè)3個復(fù)孔。12孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后加入三聯(lián)裂解液[10% SDS+5%異丁醇+1% HCL(10 mol/L)，100 μL/孔]，37 ℃放置過夜后，用酶標儀于波長570 nm處讀取吸光度(OD)值，根據(jù)OD值計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=[對照孔OD值-實驗孔OD值]/[對照孔OD值-空白孔OD值]×100%。

1.5 Annexin-V雙染法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，調(diào)整密度為1×105/mL。細胞培養(yǎng)72 h后，收集各組所有懸浮細胞，調(diào)整細胞密度為1×104/mL，每孔100 μL，加入A549(0、25、50、100 μg/mL)，取1 mL細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去培養(yǎng)基，37 ℃水浴1 h，放入冰浴加入0.5 mg/L碘化丙啶(PI)及Annexin V，流式細胞儀檢測。采用CELIQUEST軟件分析細胞凋亡率。

1.6 Western blotting檢測各項指標表達 將各濃度組收集的細胞用預(yù)冷的PBS清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，將各組蛋白濃度調(diào)成一致，沸水煮5 min，待用。取各組細胞總蛋白樣品80 μg，以樣品中的β-actin為內(nèi)參，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋PI3K抗體(1∶400)，AKT抗體(1∶1 000)，p-AKT(1∶500)，Bax(1∶500)，Bcl-2(1∶500)，Cleavage-PARP (1∶1 000)，Cleavage-Caspase3(1∶500)和β-actin(1∶3 000)抗體，4 ℃孵育過夜。PBS洗膜3次，10 min/次，根據(jù)一抗的來源，再分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的HRP標記羊抗兔IgG(1∶500)、HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5 000)室溫下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色、壓片、顯影、定影、膠片掃描保存。用Ge-l Pro Analyzer(Ver.3.0)軟件測定蛋白條帶灰度值，PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2和Cleavage-Caspase3條帶灰度值與β-actin內(nèi)參條帶灰度值的比值，分別將上述蛋白表達量化。

2 結(jié)果

2.1 I3C對A549細胞增殖的影響 MTT檢測實驗結(jié)果顯示，A549呈劑量依賴性抑制HeLa細胞增殖，在100 μmol達到最大抑制率(P<0.05)。見圖1。

2.2 I3C對A549細胞凋亡的影響 流式檢測實驗結(jié)果顯示，I3C可以呈濃度依賴性促進A549細胞凋亡。見圖2。

2.3 I3C對A549細胞、PI3K和AKT的影響 Western blotting顯示，I3C呈劑量依賴性降低PI3K和p-AKT的表達，但對AKT表達無明顯影響，顯示I3C可以抑制A549細胞PI3K/AKT信號通路的激活。見圖3。

2.4 I3C對A549細胞BCL-2、Bax和Clevage-Caspase3表達的影響 Western blotting顯示，I3C可以呈劑量依賴性促進BCL-2的降解和上調(diào)Bax和Cleavage-PARP、Clevage-Caspase3的表達(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

圖1 MTT檢測I3C對A549細胞增殖的影響

圖2 流式檢測I3C對A549細胞凋亡的影響(n=6)

3 討論

肺癌發(fā)生于支氣管粘膜上皮，亦稱支氣管癌。近50年來肺癌的發(fā)病率明顯增高，在男性癌癥患者中，肺癌已居首位，女性發(fā)病率也迅速增高，占女性常見惡性腫瘤的第2位或第3位[1-5]。肺癌細胞具有較強的生長增殖、基質(zhì)黏附和抗凋亡等能力，這些都是影響肺癌預(yù)后的主要因素，目前肺癌的治療方式包括手術(shù)切除、藥物化療、射線放療等，效果有限，且不良反應(yīng)大，因此，尋找能抑制肺癌細胞增殖和促進肺癌細胞凋亡的藥物，成為各國研究關(guān)注的難點和熱點[6-7]。

圖3 Western blotting檢測I3C對各組細胞PI3K、p-AKT和AKT的表達

注：組間比較，*P<0.05

圖4 Western blotting檢測I3C對A549細胞BCL-2、Bax和Clevage-Caspase3表達的影響

注：組間比較，*P<0.05，**P<0.01

I3C是十字花科蔬菜的主要成分之一，作為一種天然抗氧化劑和自由基清除劑，研究發(fā)現(xiàn)，I3C對肝癌、鼻咽癌、宮頸癌等多種腫瘤細胞都具有良好的抑制作用[3-5]。大量研究表明，I3C可通過多種途徑發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，主要包括阻滯細胞周期、調(diào)控與細胞增殖分化密切相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等，以抑制腫瘤細胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，I3C可以通過PI3K/AKT信號通路的激活而抑制如肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡[11-14]。PI3K/AKT信號通路是經(jīng)典的信號通路，參與多種細胞信號的介導(dǎo)，這些信號涉及細胞周期分化、轉(zhuǎn)錄、翻譯、糖代謝、細胞增殖和凋亡受阻[11-14]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路激活可促進肺癌細胞增殖和凋亡受阻[15]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，I3C可以劑量依賴性地誘導(dǎo)A549細胞增殖抑制和凋亡，上調(diào)Bax、Cleavage-PARP和Cleavage-Caspase3的表達，下調(diào)PI3K、p-AKT和Bcl-2的表達，但對AKT表達無明顯影響。這提示I3C可通過抑制PI3K/AKT信號通路而誘導(dǎo)肺癌細胞系增殖抑制和凋亡。 綜上所述，I3C可通過抑制PI3K/Akt信號通路而誘導(dǎo)A549細胞增殖抑制和凋亡。但是I3C是直接作用于PI3K信號分子還是通過調(diào)節(jié)其上游激酶和/或信號分子而間接發(fā)揮作用仍不清楚，除PI3K/AKT信號通路外，是否還有其他信號通路涉及PI3K誘導(dǎo)A549細胞增殖抑制和凋亡，尚需進一步的研究。

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Effect of indole-3-carbinol on proliferation and apoptosis of A549 cells

FU Juan,YIN Yi-fa,YAO Xia,YANG Xin*

(The Second People′s Hospital and Yichang Second People′s Hospital of China Three Gorges University,Hubei 443000,China)

Objective To investigate the effect and mechanisms of the indole-3-carbinol on the apoptosis and proliferation of human lung adenocarcinoma cells line A549.Methods The A549 cells at logarithmic growth phase were divided into control group and I3C groups.The cells were normally treated with different concentrations of I3C (0,25,50,100 μg/mL).MTT and Annexin V-PI/FITC were used to examine the proliferation and apoptotic changes of the A549 cell after incubation for 72 h,respectively.The changes of PI3K,p-AKT,AKT,Bax,Bcl-2,Cleavage-PARP and Cleavage-Caspase3 protein were detected by Western blotting.Results The results showed that I3C treatment can decrease the proliferation of A549 and the expression of PI3K,p-AKT and Bcl-2 and increase the apoptosis rate of A549,the expression of Cleavage -PARP,Cleavage-Caspase3 and Bax.Moreover,I3C had no influence on the expression of AKT.Conclusion I3C can induce the apoptosis and growth inhibition of human lung adenocarcinoma cells line A549 and the mechanism is involved in PI3K/AKT signaling.

Indole-3-carbinol; A549 cells; Proliferation; Apoptosis; PI3K/AKT

2014-12-02

三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院暨宜昌市第二人民醫(yī)院，湖北 宜昌443000

國家自然科學(xué)基金(81100264)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507002

*通信作者