歐陽(yáng)露，段雪梅，李洪亮，劉 明，劉 英，汪選斌*

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選補(bǔ)腎化瘀浸膏的水提取工藝

歐陽(yáng)露1,2，段雪梅2，李洪亮1,2，劉 明1,2，劉 英1,2，汪選斌1,2*

目的 優(yōu)選補(bǔ)腎化瘀浸膏的最佳水提取工藝。方法 采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法，以干膏得率、淫羊藿苷和柚皮苷含量為考察指標(biāo)，以提取時(shí)間、提取水量、提取次數(shù)為考察因素，篩選最佳水提取工藝條件。結(jié)果 最佳提取工藝為：藥材加8倍量水，提取3次，每次1 h。結(jié)論 該提取工藝科學(xué)合理，穩(wěn)定可靠，可行性佳，可作為實(shí)際生產(chǎn)提取工藝。

補(bǔ)腎化瘀浸膏；正交實(shí)驗(yàn)；水提取工藝

0 引言

補(bǔ)腎化瘀浸膏處方由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、熟地、當(dāng)歸、地鱉蟲(chóng)五味藥材組成，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，該方具有補(bǔ)腎壯骨、活血止痛之功效，對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有良好的治療作用，具有很高的臨床應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值[1-3]。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察補(bǔ)腎化瘀浸膏的水提取工藝，使其制備工藝更加科學(xué)合理，從而保證其臨床應(yīng)用的安全有效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20A系列高效液相色譜儀：工作站LC solution，LC-20AD泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M20A檢測(cè)器。分析天平(FA2004型,上海天平儀器廠)。超聲波清洗機(jī)(KQ3200型,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 淫羊藿、骨碎補(bǔ)、熟地、當(dāng)歸、地鱉蟲(chóng)(5味藥材均由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院中藥房提供)，淫羊藿苷、柚皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):200415、201111)，甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)藥材性質(zhì)和實(shí)際生產(chǎn)要求選取提取水量(A)、提取時(shí)間(B)以及提取次數(shù)(C)為因素，正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.2 干膏得率的測(cè)定 稱取處方量藥材共9份，每份48 g，按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取液濃縮至100 mL，靜置放冷后稱量其質(zhì)量。取正交實(shí)驗(yàn)提取液，搖勻，分別量取50 g，置于干燥至恒重蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，然后至干燥器中冷卻30 min，迅速用分析天平精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率，干膏得率=干膏質(zhì)量/原藥材質(zhì)量×100%。

2.3 淫羊藿苷、柚皮苷含量測(cè)定[4]

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)性試驗(yàn) 色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；梯度洗脫，流動(dòng)相：磷酸水溶液(0.2% H4PO3，pH=2.9)-乙腈(0～13 min體積分?jǐn)?shù)為77%，13～20 min體積分?jǐn)?shù)為67%，20～35 min體積分?jǐn)?shù)為77%)，檢測(cè)波長(zhǎng)為269 nm，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，各峰的理論塔板數(shù)不低于5 000。

2.3.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液配制：分別取淫羊藿苷及柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL約含0.3 mg的淫羊藿苷和0.12 mg的柚皮苷溶液，搖勻即得。樣品溶液的制備：精密稱取上述提取液約20 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL后精密稱定重量，超聲提取30 min，靜置放冷至室溫，精密稱定質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足損失重量，濾過(guò)，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。陰性對(duì)照品溶液的制備：按處方和工藝制法分別制備不含淫羊藿和骨碎補(bǔ)的陰性樣品，再按“樣品溶液的制備”方法制得陰性樣品溶液。

2.3.3 淫羊藿苷、柚皮苷的含量測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2。以干膏得率、淫羊藿苷與柚皮苷含量的綜合評(píng)分作為指標(biāo)，根據(jù)各指標(biāo)對(duì)提取工藝的影響程度賦予不同的權(quán)重系數(shù)，綜合評(píng)分=(干膏得率隸屬度×0.4+淫羊藿苷隸屬度×0.3+柚皮苷隸屬度×0.3)×100%[5]。以多指標(biāo)實(shí)驗(yàn)公式法統(tǒng)計(jì)分析P值為考察指標(biāo)，由表2中極差R值大小，判斷各因素作用的主次，作提取工藝方差分析綜合得出最佳水提取工藝。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 補(bǔ)腎化瘀浸膏HPLC色譜圖

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

極差大小分析顯示，以各指標(biāo)的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，影響水提取效果的順序?yàn)镃>B>A，且C3>C2>C1，B2>B3>B1，A3>A1>A2。方差分析結(jié)果顯示，因素C(提取次數(shù))有顯著影響，而因素A(提取水量)、因素B(提取時(shí)間)沒(méi)有顯著影響。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中考慮到節(jié)約成本和時(shí)間，確定最佳提取工藝為A1B1C3，即用8倍的水量提取3次，每次提取1 h。

表3 方差分析結(jié)果

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取處方量藥材共3份，每份48 g，按照優(yōu)選的最佳提取工藝：提取水量8倍，提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)3次進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。按照上文所述進(jìn)行干膏得率測(cè)定、淫羊藿苷及柚皮苷含量測(cè)定，計(jì)算得出驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示該工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究中的補(bǔ)腎化瘀經(jīng)驗(yàn)方在臨床以水煎劑使用，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出的對(duì)原發(fā)性抗骨質(zhì)疏松癥的治療作用也是使用水煎劑，且方中主要的有效成分水溶性較好，因此采用水提法作為該浸膏的提取方法。淫羊藿苷和柚皮苷分別是方中主藥的有效成分，具有明確抗骨質(zhì)疏松的藥理作用[6-7]，因此，選擇檢測(cè)淫羊藿苷和柚皮苷的含量作為提取工藝的考察指標(biāo)。中藥提取工藝的考察如以單一指標(biāo)成分作為考察指標(biāo)難以體現(xiàn)中藥效應(yīng)整體性的特征，本實(shí)驗(yàn)選擇以淫羊藿含量、柚皮苷含量以及干膏得率共同作為該制劑提取工藝的考察指標(biāo)，根據(jù)各指標(biāo)對(duì)提取工藝影響的程度不同，賦予不同的權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行加權(quán)綜合評(píng)價(jià)，使所考察提取工藝更加科學(xué)合理。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，優(yōu)選出的水提取工藝科學(xué)合理，穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)單，可行性佳，可作為實(shí)際生產(chǎn)提取工藝。

[1] 歐陽(yáng)露,汪選斌,國(guó)宏莉,等.補(bǔ)腎化瘀浸膏對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度及骨組織形態(tài)的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2009,28(12):1533-1535.

[2] 歐陽(yáng)露,汪選斌,肖雨清,等.補(bǔ)腎化瘀浸膏對(duì)去勢(shì)大鼠血清ALP、E2及IL-6水平的影響[J].中國(guó)藥師,2009,12(10):1342-1344.

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[5] 李云雁,胡傳榮.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M].第2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008:134-137.

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[7] 彭雙,韓立峰,王濤,等.骨碎補(bǔ)中的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,31(2):122-125.

Optimization of extraction process for bushenhuayu extracts with orthogonal test

OUYANG Lu1,2,DUAN Xue-mei2,LI Hong-liang1,2,LIU Ming1,2,LIU Ying1,2,WANG Xuan-bin1,2*

(1.Laboratory of Chinese Herbal Pharmacology,Renmin Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China；2.School of Pharmacy,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;)

Objective To optimize the aqueous extraction process for bushenhuayu extracts (BSHY).Methods L9(34) orthogonal experiments were conducted to choose the optimal conditions by using naringin and icariin as quantitative index.The factors included time,volume of water,frequence of extraction.Results The optimal conditions were 8 fold volume of water with 1 h per time for three times.Conclusion The method of extraction is reasonable,stable and relatively ideal to extract the active ingredients of BSHY for its real preparation.

Bushenhuayu extracts;Orthogonal test;Aqueous extraction process

2015-01-06

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000

湖北省教育廳項(xiàng)目(B2015487)；湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金(4)；湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014CFB642)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508020

*通信作者