孫廣萍，朱 凱,李德天*

Rho激酶介導(dǎo)醛固酮致人近端腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化

孫廣萍1，朱 凱2,李德天1*

目的 探討醛固酮(Aldosterone,ALD)能否誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細胞(HK2細胞)發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及Rho激酶在此過程中的作用。方法 用無血清DMEM/F-12培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)HK2細胞24 h后,將HK2細胞分為對照組、ALD組、ALD+螺內(nèi)酯(鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑)組，ALD+Y-27632(Rho激酶抑制劑)組，觀察各組間E-cadherin、α-SMA 蛋白(Western blot法)及mRNA(real-time PCR法)表達，以及各組間磷酸化MYPT-1的表達(Western blot法)。結(jié)果 終濃度為10-7M的ALD作用下，隨作用時間延長，HK2細胞 E-cadherin蛋白及mRNA表達逐漸減少，α-SMA蛋白及mRNA表達逐漸增多，提示HK2細胞發(fā)生了EMT。與對照組相比，ALD組E-cadherin蛋白及mRNA表達明顯減少(P<0.05)，α-SMA蛋白及mRNA表達顯著增多(P<0.05)，伴有磷酸化MYPT-1表達增多；而螺內(nèi)酯及Y-27632均明顯減輕了上述改變，與醛固酮組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Rho激酶活化介導(dǎo)了醛固酮誘導(dǎo)的HK2細胞發(fā)生EMT。

醛固酮；EMT；Rho激酶；HK2細胞

0 引言

腎小管間質(zhì)纖維化是腎功能進行性進展至終末期腎病的共同途徑，其比腎小球病變更易引起腎功能進展亦成為共識。近年來研究認為，多種因素可以誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)[1]，使腎小管上皮細胞首先轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，再轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細胞，是促進腎間質(zhì)纖維化的重要途徑之一。

通常情況下，醛固酮(ALD)作為鹽皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)機體的水鹽代謝。但近年來發(fā)現(xiàn)，ALD有促進器官纖維化的作用，除心臟、血管、腦外，在腎臟的系膜細胞、足細胞、腎小管上皮細胞以及間質(zhì)成纖維細胞上都存在鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralosteroid receptor,MR)[2]。在ALD灌注大鼠[3]，不僅存在嚴(yán)重的腎小球損傷，還表現(xiàn)明顯的腎小管間質(zhì)纖維化，伴隨有腎小管上皮細胞表達α-SMA增多，表明ALD可能有誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生EMT的作用。

Rho激酶是小G蛋白Rho的一個效應(yīng)因子，激活后調(diào)節(jié)肌動、肌球蛋白交聯(lián)增加，促進應(yīng)力纖維和粘附斑的形成，調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的聚合，從而介導(dǎo)包括平滑肌收縮、細胞與基質(zhì)及細胞與細胞間粘附、細胞遷移、增生、分化等與腎臟損傷相關(guān)的細胞功能[4-5]。近年來許多體內(nèi)體外研究提示，Rho/Rho激酶通路參與調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，從而引起腎間質(zhì)纖維化[6-7]。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，在ALD作用下，大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿及腎臟纖維化的同時，伴有Rho激酶活性增強，腎小管上皮細胞表達α-SMA增多，應(yīng)用Rho激酶抑制劑fasudil抑制Rho激酶活性，雖無明顯降壓作用，卻明顯減輕了腎間質(zhì)纖維化，腎小管上皮細胞表達α-SMA減少，提示ALD可能通過激活Rho激酶誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生EMT[3]。本研究旨在利用人近端腎小管上皮細胞HK2細胞系，體外予ALD刺激，探討ALD能否通過Rho激酶途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人HK2細胞系 購于美國ATCC細胞平臺，在6孔板上接種HK2細胞，用10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液、置CO2培養(yǎng)箱(5% CO2,37 ℃)培養(yǎng)，待細胞生長達到70%融合，換用無血清DMEM/F-12培養(yǎng)液，置5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置24 h后細胞同步化進行條件干預(yù)。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F-12培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶購于美國Hyclone 公司,ALD粉劑(Sigma)、螺內(nèi)酯(Spirolactone,Spi)購于Sigma；Y-27632(RB)，兔抗人E-cadherin抗體，鼠抗人α-SMA抗體，鼠抗人GAPDH抗體購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；鼠抗人磷酸化MTYPT-1抗體(Santa Cruz)。RIPA全蛋白裂解液購自碧云天公司，磷酸化/去磷酸化保護劑購自凱基公司。TRIzol購自美國Invitrogen公司，E-cadherin、α-SMA及GAPTH引物由美國Invitrogen公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量試劑盒購自日本 TAKARA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞處理 將5～6代的HK2傳代于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞融合率達70%，換無血清DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,加入終濃度為10-7M的ALD，檢測不同時間點(0、12、24、48 h)HK2細胞α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表達。

1.2.2 細胞分組 對照組(C組)：無血清 DMEM/F-12 培養(yǎng)液。ALD組：ALD 終濃度10-7M。Spi組：在ALD干預(yù)前，螺內(nèi)酯預(yù)孵6 h，終濃度10-7M。Y-27632組：在ALD干預(yù)前，Y-27632預(yù)孵1 h，終濃度10-6M。各組均設(shè)3復(fù)孔。

1.2.3 Western blot法檢測E-cadherin、α-SMA、磷酸化MYPT-1 具體如下：蛋白提取全程冰上操作，PBS沖洗6孔板3～4遍，為檢測E-cadherin、α-SMA、直接加入裂解液50 μL/孔[裂解液配制：碧云天RIPA全蛋白裂解液1 mL中加入磷酸酯酶抑制劑(PMSF)10 μL]。為檢測磷酸化MYPT-1蛋白，直接加入裂解液50 μL/孔(裂解液配制：碧云天RIPA全蛋白裂解液1 mL中加入磷酸化/去磷酸化磷酸酶保護劑10 μL)。之后冰上裂解15 min，刮取裂解物并收集，4°離心25 min，取上清液，收集上清液，考馬斯亮藍法測蛋白濃度，然后應(yīng)用1倍sample buffer進行蛋白變性，取400 μg蛋白上樣行SDS凝膠電泳。硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜后，膜置入TBS緩沖液中1 min，之后用含10%脫脂奶粉的TBS液封閉非特異抗體90 min，取出PVDF膜，用0.l%TBS-tween緩沖液,洗3次，每次5 min，然后分別加入TPBs-tween緩沖液稀釋的兔抗人E-cadherin抗體(1∶200)、鼠抗人α-SMA抗體(1∶200)、鼠抗人磷酸化MYPT-1抗體(1∶400)室溫孵育過夜9 h左右，用0.1%TPBS-tween緩沖液洗3次，每次5 min，然后分別加入用TPBS-tween緩沖液稀釋的辣根酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000)、兔抗鼠二抗(1∶2 000)抗體，室溫孵育2 h后用0.1%TPBS-tween緩沖液洗3次，每次10 min，然后加入ECL或ECLPluS暗室曝光，直到得到清晰條帶為止。

用 NIH1.61圖像分析軟件分別測定目的蛋白條帶密度并進行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參照，用目的蛋白與GAPDH條帶密度的比值表示每個樣本的相對蛋白表達水平。

1.2.4 real-time PCR法檢測E-cadherin、α-SMA mRNA 表達水平 美國Medline國立圖書館基因庫檢索基因，PCR引物設(shè)計在primer 5.0引物設(shè)計輔助軟件上進行，美國Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。提取腎組織總RNA,取2 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后采用 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)基因表達測定試劑盒在ABI

Prism 7 000序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA)進行real-time PCR 分析。變性95 ℃ 30 s，擴增95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，分別計算目的基因與GAPDH 的比值。各靶基因引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 ALD作用不同時間對E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達的影響 研究表明，ALD濃度為10-7M，更接近CKD 3期患者的ALD濃度。所以選擇10-7mol/L ALD作為工作濃度。分別給予不同的時間干預(yù)(0、12、24、48 h)。HK2細胞在ALD作用下，隨作用時間的延長，E-cadherin蛋白及mRNA表達明顯減少，α-SMA蛋白及mRNA表達明顯增加(見圖1)，提示呈時間依賴性。本實驗選擇作用時間48 h。

圖1 不同時間點10-7M ALD作用下E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA的表達

2.2 不同組間E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達 與對照組比較，10-7M ALD作用下，E-cadherin蛋白及mRNA表達明顯減少，α-SMA蛋白及mRNA表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明醛固酮誘導(dǎo)HK2細胞發(fā)生EMT；與醛固酮組比較，螺內(nèi)酯及Y-27632組均能顯著減少E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 不同組間磷酸化MYPT-1蛋白的表達 MYPT-1是Rho激酶的作用底物，其磷酸化水平代表Rho激酶的活性。與對照組比較，ALD組磷酸化MYPT-1表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與醛固酮組比較，螺內(nèi)酯及Y-27632組細胞磷酸化MYPT-1表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

ALD是調(diào)節(jié)機體水鹽代謝的主要皮質(zhì)激素，既往認為其生物學(xué)作用主要為促進腎臟遠曲小管和集合管重吸收鈉和水，排出鉀。但許多研究表明醛固酮與腎臟纖維化關(guān)系密切,近年來發(fā)現(xiàn)，慢性腎臟病患者腎臟局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)異?；罨?，ACEI/ARB長期治療可在一定程度上延緩腎功能的進展。但是在某些患者會出現(xiàn)“ALD逃逸”現(xiàn)象，影響ACEI/ARB療效。而應(yīng)用MR拮抗劑螺內(nèi)酯或依普利酮能進一步減少蛋白尿，保護腎小管間質(zhì)，延緩腎功能進展，由此表明ALD是一個獨立的CKD進展的危險因素[8]。

圖2 不同組間E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達

圖3 不同組間磷酸化MYPT-1蛋白的表達

本實驗結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)人HK2細胞，在濃度10-7M的ALD作用下，隨著作用時間的延長，腎小管上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA和蛋白表達均明顯減少，而肌成纖維細胞標(biāo)志物α-SMA mRNA和蛋白表達明顯增高，且呈時間依賴，說明ALD能在體外誘導(dǎo)HK2細胞發(fā)生EMT。此結(jié)果與既往的研究結(jié)果一致[9-10]，同時也進一步證明了之前的在體研究應(yīng)用ALD灌注大鼠，大鼠的腎小管上皮細胞大量表達α-SMA，導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的研究結(jié)果。而應(yīng)用MR拮抗劑 Spi，能明顯抑制ALD作用后HK2細胞E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達的變化，說明ALD誘導(dǎo)EMT可能通過與HK2細胞上的鹽皮質(zhì)激素受體起作用?？赡艿臋C制為ALD與胞質(zhì)內(nèi)的MR 結(jié)成“ALD-受體”復(fù)合物，并移入胞核與反應(yīng)元件結(jié)合，激活或抑制目的基因轉(zhuǎn)錄，減少上皮細胞極性標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達，上調(diào)轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白α-SMA的表達，促進EMT的發(fā)生。Spi作為 MR拮抗劑可與MR競爭結(jié)合，減少α-SMA的表達，上調(diào)E-cadherin 的表達，抑制EMT的發(fā)生，起到腎臟保護作用，但其確切的機制有待進一步探討。

Rho/Rho激酶通路存在于大多數(shù)細胞中，是參與細胞有絲分裂、粘附、細胞骨架調(diào)整、細胞收縮、腫瘤細胞浸潤等一系列細胞生命現(xiàn)象的重要酶。Rho激酶的經(jīng)典底物是MYPT-1，也是最早發(fā)現(xiàn)的天然底物。Rho激酶活化后，催化其肌球蛋白結(jié)合亞單位(MYPT-1)磷酸化，使肌球蛋白磷酸酶失活;失活的肌球蛋白磷酸酶不能將肌球蛋白輕鏈去磷酸化，使得胞漿內(nèi)磷酸化的肌球蛋白輕鏈水平上升，肌動、肌球蛋白交聯(lián)增加，促進應(yīng)力纖維和粘附斑的形成，調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架F-actin聚合。F-actin是參與細胞運動的主要蛋白質(zhì)分子，因而也認為Rho激酶是調(diào)節(jié)細胞運動的重要激酶之一。很可能Rho激酶激活通過改變HK2細胞骨架蛋白F-actin 的重排，因而獲得肌成纖維細胞的表型而促進 EMT的發(fā)生[11]。目前無論糖尿病腎病或腎小管間質(zhì)纖維化的動物模型都顯示，Rho/Rho激酶通路激活參與腎小管間質(zhì)纖維化[12-13]，而且細胞學(xué)研究也證明，Rho激酶不僅介導(dǎo)系膜細胞發(fā)生EMT，而且也介導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生EMT[10,14]。因此Rho/Rho激酶可能是導(dǎo)致EMT并最終至臟器纖維化的重要通路。筆者之前研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠持續(xù)泵入ALD后，大鼠腎小管上皮細胞表達α-SMA增多，同時伴有Rho激酶的激活。本研究亦發(fā)現(xiàn)，在ALD誘導(dǎo)HK2細胞發(fā)生EMT的同時，伴有Rho激酶活性的標(biāo)志物磷酸化MYPT-1蛋白表達增多。Spi及Rho激酶抑制劑Y-27632能減少磷酸化MYPT-1表達，同時HK2細胞EMT改變減輕。這提示Rho激酶激活參與ALD誘導(dǎo)的HK2細胞的EMT，與Wei等[10]結(jié)果一致，也進一步證實了先期研究Rho/Rho激酶參與介導(dǎo)醛固酮腎臟損傷的研究成果，但是也有報道，ALD很可能通過激活HK2細胞線粒體的氧化反應(yīng)參與HK2細胞EMT[9-10]。因此，進一步研究希望通過轉(zhuǎn)染Rho激酶siRNA 敲除或減少HK2細胞Rho激酶表達，觀察ALD能否誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT，為ALD誘導(dǎo)HK2細胞發(fā)生EMT的機制研究提供新的靶點和依據(jù)。

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Rho-kinase involved in the EMT induced by aldosterone in human proximal tubular epithelial cells

SUN Guang-ping1，ZHU Kai2，LI De-tian1*

(1.Department of Nephrology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China ;2.Department of Nephrology,General Hospital of Fushun Minining Bureau,Fushun 113000,China)

Objective To investigate whether aldosterone (ALD) can induce EMT in the human proximal tubular epithelial cell- HK2cells and the role of Rho-kinase in the process.Methods HK2cells were simultaneously cultured with serum-free DMEM/F-12 for 24 h.Then the cells were divided into the following four groups: control group(only DMEM/F-12),ALD group (ALD 10-7M),ALD+spironolactone group (ALD 10-7M and preincubation with spironolactone 10-7M) and ALD+Y27632 group (ALD 10-7M and preincubation with Y-27632 10-6M).The protein and mRNA expressions of E-cadherin and α-SMA,both with the phosphoralation of MYPT-1 were compared among the groups by real-time PCR and/or Western blot.Results Stimulation with aldosterone significantly decreased the expressions of E-cadherin protein and mRNA and increased the expressions of α-SMA protein and mRNA,which suggested EMT in the HK2cells.The phosphorated-MYPT-1 protein,marker of Rho-kinase activity simultaneously increased markedly.Preincubation with spironolactone(10-7M) or a Rho-kinase inhibitor Y-27632 (10-6M)attenuated the aldosterone-induced increase in MYPT-1 phosphorylation,accompanied by attenuation of EMT.Conclusion Activation of Rho-kinase is involved in the EMT of HK2cells induced by ALD stimulation.

Aldosterone;EMT;Rho-kinase;HK2cells

2014-11-31

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽

110004；2.撫順礦務(wù)局總醫(yī)院腎內(nèi)科，撫順 113000

遼寧省博士啟動基金(20101143)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508009

*通信作者