李龍珠，劉家軍，李賢玉，吳勝英*，郭俐宏

丹紅注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

李龍珠1a，劉家軍1b，李賢玉2，吳勝英2*，郭俐宏3

目的 研究丹紅注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法 90只大鼠中，選擇12只為假手術(shù)組，另78只經(jīng)右側(cè)翼腭動(dòng)脈線栓willis環(huán)阻塞60 min后再灌注60 min，反復(fù)3次，建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型。術(shù)后7 d選擇其中36只造模成功大鼠，隨機(jī)分為模型組、丹紅A組、丹紅B組。四組大鼠均采用尾靜脈注射給藥治療，并于治療前及治療14 d后分別檢測(cè)各組動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白質(zhì)及VEGF mRNA、缺氧誘導(dǎo)因子-1a (HIF-1a)、HIF-1a mRNA、受體胎肝激酶1(FLK-1)、FLK-1 mRNA，腦組織TTC染色并測(cè)定腦梗死范圍。結(jié)果 治療14 d后，丹紅組VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明顯增高；TTC組織學(xué)檢查顯示，部分腦組織神經(jīng)細(xì)胞溶合且排列紊亂，但腦梗死范圍明顯縮小。與模型組比較，各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹紅A組、B組各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 丹紅注射液可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注后血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)程度，其作用機(jī)制可能與其促進(jìn)VEGF分泌、拮抗Ca2+內(nèi)流、松弛腦血管平滑肌、增加血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)缺血部位血管新生有關(guān)。

局灶性腦缺血再灌注損傷；丹紅注射液；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子

0 引言

急性腦梗死(Acute cerebral infarction，ACI)又稱急性缺血性腦卒中，其起病急驟，病死率及致殘率達(dá)50%以上，是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重威脅人類健康的心腦血管疾病。臨床表現(xiàn)多以局灶性腦缺血梗死所致腦血管急性血流障礙及急性腦功能缺損為主[1]。流行病學(xué)資料顯示，每年新發(fā)病例200萬(wàn)，死亡率達(dá)30%～50%[2]。近年來(lái)，丹紅注射液常用于治療此類心腦血管疾病，臨床效果可靠。目前，其對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷致血管內(nèi)皮再生的影響及其機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，經(jīng)尾靜脈注射丹紅注射液，系統(tǒng)觀察丹紅注射液對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠VEGF表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠90只，鼠齡6～8周，體重(200±20) g，雌雄兼用，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(鄂)2014-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證編號(hào)：SYXK(鄂)2014-0031。

1.2 藥品試劑及儀器 BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司)。精密電子天平(上海精密電子天平醫(yī)療儀器公司，F(xiàn)A-1004)。丹紅注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20026866)；VEGF、FLK-1試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，HIF-1 (北京博奧生生物技術(shù)公司)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。自制栓線(將釣魚線剪成長(zhǎng)約50 mm，并在18 mm處作標(biāo)記，酒精消毒后置于生理鹽水中備用)。

1.3 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)[3]，選擇78只大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并找到翼腭動(dòng)脈起始部置一微動(dòng)脈夾，同時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈主干近端。在頸外動(dòng)脈剪一V型小口，將制備好的栓線插入，此時(shí)將頸外動(dòng)脈殘端處絲線的松結(jié)拉緊，除去頸內(nèi)動(dòng)脈的微動(dòng)脈夾，繼續(xù)將絲線沿頸內(nèi)動(dòng)脈插入18 mm或有阻力感為止，保持60 min后即可抽出絲線并除去微動(dòng)脈夾再通60 min，反復(fù)3次。術(shù)后以左側(cè)前肢內(nèi)收、提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪、行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為入選標(biāo)準(zhǔn)。本次動(dòng)物模型制備術(shù)后有51只大鼠存活且符合局灶性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型入選標(biāo)準(zhǔn)，模型成功率達(dá)65% (51/78)。選擇其中36只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均分為模型組及丹紅A組、B組，另選12只為假手術(shù)組(假手術(shù)組手術(shù)同上但不插入栓線)進(jìn)行對(duì)照。采用經(jīng)尾靜脈注射給藥治療的方法，丹紅大劑量組給予丹紅注射液4 mL/kg，小劑量組減半(2 mL/kg)，假手術(shù)組及模型組注射等量生理鹽水，四組動(dòng)物連續(xù)注射治療14 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 參照文獻(xiàn)[4]，在經(jīng)尾靜脈注射丹紅注射液治療前，四組大鼠各選6只斷頭處死，迅速分離出腦組織后放入液態(tài)氮中暫存，2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至-70 ℃低溫冰箱保存以備VEGF蛋白分析。治療14 d后，同上步驟取各組大鼠腦組織，研磨并2 000轉(zhuǎn)離心，嚴(yán)格按SP試劑盒說(shuō)明操作，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)腦組織治療前后各組腦組織標(biāo)本中VEGF、VEGF mRNA、HIF-la、HIF-la mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA表達(dá)。

1.5 大鼠腦梗死范圍 在治療14 d后斷頭處死4組大鼠，并迅速分離腦組織后濾紙吸干稱重，-20 ℃冰凍20 min，冠狀面均勻切成2 mm厚腦片，并迅速放入1% TTC溶液中，37 ℃避光染色30 min，4%多聚甲醛固定，此時(shí)梗死區(qū)著色加深，剝離著色梗死部位，用精密電子天平精確稱量，計(jì)算腦梗死范圍，腦梗死范圍(%)=梗死部位質(zhì)量/腦總質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 丹紅注射液對(duì)局灶性腦缺血大鼠VEGF等指標(biāo)的影響 治療后14 d，模型組VEGF蛋白質(zhì)、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.37～75.86，q=8.30～121.21，P<0.05)，提示局灶性腦缺血造模成功。缺血、缺氧是促進(jìn)VEGF分泌的最主要因素，此時(shí)血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重。丹紅A、B組VEGF蛋白質(zhì)、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)，與本組用藥前及模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.02～72.33，q=8.97～102.54，P<0.05)，但A、B組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 丹紅注射液對(duì)腦梗死范圍的影響 丹紅A、B組腦梗死范圍分別為12.36%±1.58%、12.60%±1.67%，明顯低于模型組(31.65%±2.72%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=7.58～87.98，P<0.05)，A、B組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 組織學(xué)檢查 見(jiàn)圖1。腦組織TTC圖片顯示，假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，著色均勻，無(wú)壞死現(xiàn)象；模型組梗死區(qū)著色加深，腦組織神經(jīng)細(xì)胞溶合排列紊亂，出現(xiàn)明顯壞死現(xiàn)象；丹紅A、B組TTC染色相似，梗死區(qū)著色均加深，梗死區(qū)明顯減少，有部分腦組織神經(jīng)細(xì)胞溶合且排列紊亂，但少于模型組。

表1 丹紅注射液對(duì)局灶性腦缺血大鼠血管內(nèi)皮VEGF各項(xiàng)指標(biāo)的影響

注：與治療前比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，&P<0.05

圖1 不同組別大鼠腦缺血梗死區(qū)病理圖片

3 討論

丹紅注射液是由丹參和紅花兩味中藥采用現(xiàn)代特殊工藝科學(xué)配方提取的復(fù)方注射液。丹參味辛性涼，“治心腦腹痛”(《吳普本草》)；紅花味辛性溫，“善通利經(jīng)脈”(《藥品化義》)[5]。丹紅注射液具有活血化瘀通經(jīng)、祛瘀止痛之功效[6]，能有效降低血液粘稠度，改善微循環(huán)，擴(kuò)張血管，防治缺血再灌注損傷，進(jìn)而改善心、腦供血不足，營(yíng)養(yǎng)腦組織[7-8]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病的治療[9]。

VEGF是一種高度特異性的促血管生長(zhǎng)因子，參與動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)，VEGF的高低常作為血管內(nèi)皮功能及側(cè)支循環(huán)建立情況的重要指標(biāo)[10]。正常情況下，氧自由基的生成與清除維持著動(dòng)態(tài)平衡，血管內(nèi)皮保持其完整性。在急性腦梗死時(shí)，由于腦血管急性血流障礙，腦組織局部缺血缺氧，細(xì)胞Na+-K+-ATP酶大量釋放，Ca2+內(nèi)流并造成鈣超載，鈣超載可使線粒體受到破壞而導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，此時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，且機(jī)體清除氧自由基能力下降，血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損[11]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有拮抗Ca2+內(nèi)流、改善ATP酶活性、松弛血管平滑肌改善微循環(huán)、提高組織耐缺氧的作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，治療14 d后，丹紅注射液大小劑量組VEGF、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1及 FLK-1 mRNA表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，說(shuō)明丹紅注射液亦具有促進(jìn)VEGF分泌、誘導(dǎo)血管再生、促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能[13]。推測(cè)其原因：丹紅注射液促進(jìn)Ca2+-ATP酶活性恢復(fù)，增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶活力，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并通過(guò)Na+-K+-ATP酶調(diào)節(jié)鈉氫交換抑制鈉鈣交換，阻止Ca2+內(nèi)流，改善心肌組織能量代謝[14]，起到活血化瘀、改善微循環(huán)、增加腦組織供氧的作用。急性缺血性腦卒中的臨床癥狀和預(yù)后有賴于動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)重建，因此，積極尋找具有促進(jìn)缺血血管新生的臨床常用藥物對(duì)缺血性疾病的治療具有重大意義。側(cè)支循環(huán)的形成和開(kāi)放能夠減輕心腦組織缺血缺氧，防止腦組織細(xì)胞壞死而改善臨床癥狀。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性促有絲分裂原[15]，可促進(jìn)心腦等缺血組織的血管生成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)血管重塑并建立有效的側(cè)支循環(huán)[16]。

本研究證實(shí)丹紅注射液具有增加血管內(nèi)皮VEGF分泌的作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可能具有趨化反應(yīng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，參與維持成熟血管的完整性，促進(jìn)腦血管損傷后血管再生內(nèi)皮化，進(jìn)而促使腦血管重塑的作用。但缺血再灌注損傷機(jī)制是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜的病理改變過(guò)程，丹紅注射液如何在各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)和干預(yù)作用并阻斷其發(fā)生，還有待于深入研究。

綜上所述，丹紅注射液能夠增加缺血腦組織VEGF的表達(dá)，縮小腦梗死范圍，促進(jìn)缺血部位新生血管的生成，對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

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Effect of danhong injection on vascular endothelial growth factor in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury

LI Long-zhu1a,LIU Jia-jun1b,LI Xian-yu2,WU Sheng-ying2*,GUO Li-hong3

(1.a.Department of Gynaecology and Obstetrics,b.Department of Gastroenterology,Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442000,China;2.Department of Pathophysiology,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;3.Department of Acupuncture,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To study the effects of danhong injection on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.Methods Twelve rats were selected as sham operated group(control group),78 rats received right pterygopalatine artery willis ring obstruction for 60 min and reperfusion for 60 min,the operation repeated for 3 times to establish the model of rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.Thirty-six successful model rats at 7 d after IR were randomly divided into model group,danhong A group and danhong B group.Rats in the 4 groups were medicated via tail vein injection.The protein content and mRNA expression of VEGF,hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a) and receptor in fetal liver kinase 1 (FLK-1) were measured before treatment and at 14 d after treatment.The size of cerebral infarction was determined by brain tissue TTC staining.Results Compared with model group,the protein content and mRNA expression of VEGF,HIF-1a and FLK-1 in danhong groups were significantly higher at 14 d after treatment (P<0.05),the size of cerebral infarction reduced significantly (P<0.05).There was no significant difference in the above indexes between the two danhong groups (P>0.05).Conclusion Danhong injection can reduce the vascular endothelial cell inflammatory reaction in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.The mechanism may be related to the promotion of VEGF secretary,antagonism of Ca2+inner flow,relaxation of vascular smooth muscle and increasing vascular permeability etc.

Focal cerebral ischemia reperfusion injury;Danhong injection;Vascular endothelial growth factor

2014-11-21

1.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院a.婦產(chǎn)科，b.消化科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院病理生理室，湖北 十堰 442000；3.十堰市太和醫(yī)院(附屬湖北醫(yī)藥學(xué)院)針灸科，湖北 十堰 442000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201508005