吳煥成，梁海乾,孫洪濤

·論著·

外泌體減輕β淀粉樣蛋白治療阿爾茨海默病模型鼠的初步研究

吳煥成1,2，梁海乾1,孫洪濤1

目的 研究N2a細胞分泌的外泌體對阿爾茨海默病(AD)模型小鼠β淀粉樣蛋白(Aβ)濃度及斑塊聚集的抑制作用，以期為臨床治療AD提供一種新的途徑。方法 將多步離心提取的外泌體持續(xù)注入表達β淀粉樣前體蛋白(APP)的小鼠腦內(nèi)，一段時間后檢測Aβ濃度、Aβ老年斑塊的形成以及APP小鼠的突觸活性。結(jié)果 經(jīng)過持續(xù)外泌體注射的APP小鼠，Aβ濃度顯著降低(P<0.05)，Aβ斑塊的形成也顯著降低(P<0.05)，而突觸靈活性顯著提高(P<0.05)。結(jié)論 N2a細胞分泌的外泌體對APP小鼠Aβ的表達有顯著抑制作用。

外泌體;β淀粉樣蛋白;阿爾茨海默氏病

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以記憶力降低、認知功能障礙、喪失生活自理能力和社會活動能力為特征的老年性疾病[1]。主要由于β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)在腦中積聚形成老年斑塊而導致[2]。任何導致Aβ生成增加或Aβ清除減少的的因素均會導致Aβ在腦中代謝障礙從而導致AD[3]。外泌體(Exosome)是由多種細胞分泌的直徑40～100 nm的膜性囊泡，神經(jīng)細胞液可分泌這種囊泡[4]。外泌體具有抗原提呈、細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運等作用。有研究報道，外泌體與β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)的代謝等有關(guān)[5]。同時，有研究證實，在細胞水平上，外泌體能夠與Aβ結(jié)合并促進Aβ纖維化的形成[6]。本實驗在已有研究的基礎(chǔ)上，對外泌體能否在動物模型上發(fā)揮治療性作用進行驗證，從而指導臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 細胞與外泌體 神經(jīng)細胞N2a細胞在10%胎牛血清中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后收集細胞上清提取外泌體。外泌體的提取參照文獻[7]方法，即在提取外泌體的前1 d，換細胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，以去除血清中外泌體對細胞外泌體的影響。然后離心無血清培養(yǎng)基。具體為3 000 g 10 min、4 000 g 10 min、10 000 g 30 min、100 000 g 1 h離心，棄上清，并用PBS重懸離心沉淀。

1.2 實驗動物 C57BL/6小鼠30只，雄性，10～12周齡，體重100～150 g，購自中國科學院天津?qū)嶒瀯游镏行?，由天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。在實驗前飼養(yǎng)動物1周，使動物適應(yīng)實驗室環(huán)境。隨后按照文獻中提供的方法制備表達APP蛋白的轉(zhuǎn)基因雜合小鼠作為實驗動物。

2 評價指標

2.1 外泌體的鑒定 用TBS溶液重懸外泌體，并使外泌體與覆蓋有膠棉的網(wǎng)格結(jié)合，應(yīng)用2%磷鎢酸對外泌體進行染色，并在HD-2000電鏡下進行外泌體鑒定。外泌體直徑集中在100 nm左右。TBS重懸外泌體，濃度保持在100 μg/mL,動態(tài)光散射檢測外泌體直徑大小。Western blot鑒定經(jīng)過多步離心提取的外泌體，用在外泌體上表達的蛋白Alix、Flot-1、GM1等作為marker蛋白進行鑒定。

2.2 外泌體治療APP小鼠Aβ濃度的測定 用微型泵對13個月齡大小的APP小鼠海馬(區(qū)域、側(cè)腦室持續(xù)注射外泌體(2.67×1012/mL PBS懸浮液，0.25 μL/h)14 d，對照組注射相同體積的PBS。14 d后，處死小鼠，取小鼠腦組織冰凍保存。用ELISA雙抗體夾心法檢測同側(cè)腦室、對側(cè)腦室、海馬區(qū)Aβ的濃度，同時借鑒Mucke等[8]的方法，經(jīng)過突觸抗體D35E4孵育后，用FV10i顯微鏡檢測突觸靈活性。以確定兩種不同部位外泌體注射的療效，從而為后續(xù)治療注射部位的選擇提供依據(jù)。

2.3 外泌體治療APP小鼠Aβ老年斑塊的測定 對13個月齡大小的APP小鼠海馬區(qū)持續(xù)注射外泌體14 d，用硫黃素THs對APP小鼠腦組織進行染色，電鏡觀察硫黃素斑塊的大小、數(shù)量即代表Aβ老年斑塊的大小及數(shù)量。

3 結(jié)果

3.1 外泌體鑒定 對通過多步離心法提取的N2a細胞的外泌體進行鑒定。外泌體直徑主要集中在40～100 nm(圖1A、1B)，外泌體上表達蛋白Alix、Flot等蛋白，但不表達Aβ蛋白(圖1C)。

圖1 外泌體鑒定結(jié)果

3.2 三種不同亞型Aβ濃度及突觸靈活性測定 分別對APP小鼠的一側(cè)腦室及海馬區(qū)注射N2a細胞來源的外泌體。一側(cè)腦室注射PBS，一側(cè)腦室注射外泌體。結(jié)果顯示，注射外泌體的組織中三種不同亞型Aβ濃度顯著低于注射PBS的組織。見表1。一側(cè)海馬區(qū)注射PBS，一側(cè)海馬區(qū)注射外泌體。結(jié)果顯示，注射PBS的小鼠，同側(cè)、對側(cè)海馬區(qū)的Aβ含量基本沒有差異，而注射外泌體的小鼠，其同側(cè)海馬區(qū)Aβ濃度比對側(cè)海馬區(qū)顯著減少。同時，測得突觸靈活性(面積比)同側(cè)比對側(cè)顯著提高。見表2。

表1 側(cè)腦室注射外泌體后Aβ含量測定(pmol/g)

注：與PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.3 Aβ老年斑塊含量測定 上述結(jié)果表明，海馬區(qū)注射外泌體的效果要優(yōu)于側(cè)腦室注射，因此，本實驗選擇APP小鼠于海馬區(qū)持續(xù)注射外泌體，隨后選取組織進行硫黃素(THs)染色實驗，測得外泌體能夠顯著抑制Aβ老年斑的聚集形成。見表3。由表3可見，隨著外泌體的濃度增高，其抑制作用增強。

表2 海馬區(qū)注射外泌體后Aβ含量及突觸靈活性測定(pmol/g)

注：與PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01

表3 海馬區(qū)注射不同劑量外泌體的APP小鼠Aβ斑塊聚集情況

注：與PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

AD是以進行性認知障礙及記憶減退為主要特征的神經(jīng)退行性病變,其病理損害是不可逆的[9]，目前關(guān)于AD的發(fā)病機制主要有“膽堿能學說”及“β淀粉樣變性學說”。目前普遍認同的AD的主要發(fā)病機制是具有神經(jīng)毒性的Aβ在大腦實質(zhì)沉積，啟動級聯(lián)病理反應(yīng)，從而導致廣泛的神經(jīng)元丟失，形成神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)(NFT)，破壞神經(jīng)元的正常功能而導致記憶及認知功能障礙，出現(xiàn)癡呆癥狀。Aβ沉積形成的Aβ老年斑塊是導致AD的主要病理學特征。APP為Aβ的前體蛋白，可穿過神經(jīng)細胞膜，對于神經(jīng)元的生長、存活和受傷后的修復非常重要[10]。APP可以被α、β、γ三種分泌酶水解。APP由770個氨基酸殘基組成，如果在687位點由α-分泌酶水解，再由γ-分泌酶在711/713位點水解，則不會產(chǎn)生淀粉樣肽Aβ；若先在671位點由β-分泌酶水解，再由γ-分泌酶在711/713位點水解，則會產(chǎn)生Aβ40、Aβ42、Aβ38三種肽的亞型。Aβ40是Aβ的主要形式，而Aβ42是主要致病形式[11-12]。外泌體是多種細胞分泌的具有細胞間信息傳遞、抗原提呈、藥物運輸?shù)茸饔玫哪倚越Y(jié)構(gòu),具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，是由多囊泡體與細胞膜融合后向細胞外分泌的囊泡[13]，廣泛存在于體液中,且能夠被多種活細胞分泌，如血細胞、神經(jīng)細胞、腸上皮細胞、腫瘤細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞[14]。外泌體能夠反映其來源細胞的功能。

有研究證實，在體外細胞水平上，Aβ可以和加入細胞中的N2a神經(jīng)細胞來源的外泌體結(jié)合，從而抑制Aβ的表達，N2a細胞來源的外泌體富集一種鞘脂糖(Glycosphingolipids，GSLs)，介導其與Aβ的結(jié)合，從而降低Aβ的含量。因此，筆者通過多步離心提取神經(jīng)細胞N2a細胞的外泌體，連續(xù)注入APP小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該外泌體具有降低腦組織中Aβ濃度、抑制Aβ老年斑塊聚集及增強突觸靈活性的作用。但是關(guān)于GSLs富集的外泌體清除Aβ的機制尚不清楚。關(guān)于GSLs與AD的發(fā)病尚存在爭議。有文獻報道，GSLs代謝障礙屬于溶酶體代謝障礙的一種，GSLs在腦中積聚過多可能會導致AD的發(fā)生[15]。因此，關(guān)于外泌體治療AD的策略還需進一步研究。

細胞水平的研究證實，N2a細胞來源的外泌體能夠促進Aβ的纖維化。而本研究發(fā)現(xiàn)，對APP小鼠持續(xù)注射N2a細胞來源的外泌體能夠減輕Aβ老年斑的形成。提示外泌體結(jié)合Aβ之后能在腦內(nèi)被迅速清除，可能是外泌體能夠阻止Aβ纖維化的形成，也可能是Aβ纖維化形成之后與外泌體結(jié)合，被腦組織中的小膠質(zhì)細胞清除。小膠質(zhì)細胞能夠吞噬腦組織中需要被清除、代謝的廢物，從而保持其代謝平衡。有研究證實，大部分外泌體能夠被小膠質(zhì)細胞吞噬清除[16]。但是Aβ被清除的具體機制尚不清楚。在以后的研究中，可以側(cè)重于Aβ治療AD的各個環(huán)節(jié)的機制，為真正應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

[1] 史寶和,李玉鋒,李成洋,等.石杉堿甲治療輕中度阿爾茨海默病的臨床研究[J].實用藥物與臨床,2013,16(1):37-38.

[2] 王燕,杜瑤,杜芳騰,等.β-淀粉樣蛋白清除障礙與阿爾茨海默病[J].中國老年學雜志,2014,34(9):2582-2585.

[3] Mawuenyega KG,Sigurdson W,Ovod V,et al.Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer′s disease[J].Science,2010,330(6012):1774.

[4] 劉艷華,王小中.外泌體在疾病診療中的研究進展[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2014,32(3):267-271.

[5] Rajendran L,Honsho M,Zahn TR,et al.Alzheimer′s diseaseβ-amyloid peptides are released in association with exosomes[J].PNAS,2006,103(30):11172-11177.

[6] Yuyama K,Sun H,Mitsutake S,et al.Sphingolipid modulated exosome secretion promotes clearance of amyloid-by microglia[J].J Biol Chem,2012,287(14):10977-10989.

[7] Théry C,Amigorena S,Raposo G,et al.Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc Cell Biol,2006,Chapter 3:Unit 3.22.

[8] Mucke L,Masliah E,Yu GQ,et al.High-level neuronal expression of 1-42 in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: synaptotoxicity without plaque formation[J].Neurosci,2000,20(11):4050-4058.

[9] 司君增,魏麗萍,吳孟海,等.丁苯酞軟膠囊聯(lián)合鹽酸多奈哌齊治療輕度認知功能障礙的效果觀察[J].實用藥物與臨床,2014,17(9):1144-1146.

[10]Priller C,Bauer T,Mitteregger G,et al.Synapse formation and function is modulated by the amyloid precursor protein[J].J Neurosci,2006,26(27):7212-7221.

[11]王華成,羅金剛,劉學軍,等.阿爾茨海默病血清A1342檢測方法的建立及其臨床意義[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2012,35(1):42-46.

[12]韓麗珠，王文靜，褚忠海，等.輕度認知障礙患者腦脊液中β淀粉樣蛋白42及磷酸化Tau蛋白的水平檢測及意義[J].實用醫(yī)學雜志，2014，30(19):3079-3081.

[13]盧婉,楊人強,王伶,等.外泌體的研究進展[J].生命的化學,2013,33(4):438-442.

[14]Van Vollenhoven RF,Fleischmann R,Cohen S,et al.Tofacitinib oradalimumab versus placebo in rheumatoid arthritis[J].N Engl J Med,2012,367(6):508-519.

[15]Wynn D,Kaufinan M,Montalban X,et al.Daclizumab in active relapsing multiple sclerosis (CHOICE study): a phase 2,randomised,double-blind,placebo-controlled,add-on trial with interferon beta[J].Lancet Neurol,2011,9(4):381-390.

[16]Fitzner D,Schnaars M，Van Rossum D,et al.Selective transfer of exosomes from oligodendrocytes to microglia by macropinocytosis[J].Cell Sci,2011,124(3):447-458.

Preliminary study on the exosome treatment for Alzheimer′s disease model rat by reducing β-amyloid

WU Huan-cheng1,2,LIANG Hai-qian1,SUN Hong-tao1

(1.Brain Hospital Affiliated Hospital of the Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China;2.Graduate School of Medical University of Tianjin,Tianjin 300070,China)

Objective To study the effect of exosomes secreted by N2a cells on the concentration of β-amyloid and the accumulation of plaque in Alzheimer′s mice.Methods The multi-step centrifugal extracted exosomes was continuously injected into the brain of AD mice,and the concentration of Aβ,formation of Aβ plaques and synaptic activity in APP mice were detected. Results After continuous injection of exosomes in AD mice,the concentration of Aβ and the formation of Aβ plaques were significantly lower (P<0.05) than those of control group,while the flexibility of synapse in AD mice significantly increased (P<0.05) than that of control group. Conclusion Exosomes secreted by N2a cells could significantly inhibitethe expression of Aβ in AD mice.

Exosome;β-amyloid;Alzheimer′s disease

2014-12-04

1.武警后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院,天津 300162；2.天津醫(yī)科大學研究生院,天津 300070

10.14053/j.cnki.ppcr.201508002