郭 文 壇，王 艷，葉 方，張 春 枝

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

蠶絲主要是由外層的絲膠和內(nèi)層的絲素組成。絲膠覆于絲素的外圍，對(duì)絲素起到了保護(hù)和膠結(jié)的作用［1－2］。同時(shí)，過(guò)多的絲膠會(huì)影響蠶絲的手感和光澤。因此，蠶絲必須經(jīng)過(guò)脫膠才能用到織物服裝中。目前國(guó)內(nèi)外蠶絲脫膠方法多為堿煮法［3－4］，但因其工藝復(fù)雜煩瑣、成本高、效率低、產(chǎn)品質(zhì)量差和污染環(huán)境等因素影響了絲膠的開發(fā)與利用。

蛋白酶具有反應(yīng)條件溫和、高效專一、產(chǎn)量高和循環(huán)使用無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，引起了諸多學(xué)者的廣泛研究［5－6］，生物法脫膠已是現(xiàn)階段人們關(guān)注的重點(diǎn)［7］。張雨青［8］的研究證明了生物法脫膠具有一定的優(yōu)勢(shì)。張胡靜等［9］進(jìn)一步解釋了生物法脫膠在蠶絲加工過(guò)程中的重要性。利用生物法對(duì)蠶絲蛋白進(jìn)行水解，對(duì)食品和醫(yī)療保健品行業(yè)以及紡織工業(yè)具有深遠(yuǎn)的意義［10－11］。

本研究旨在從養(yǎng)殖柞蠶周邊的土壤中分離篩選出能夠生產(chǎn)蛋白水解酶的菌株并對(duì)其進(jìn)行菌種的初步鑒定以及發(fā)酵條件優(yōu)化，從而獲得一株具有較高競(jìng)爭(zhēng)力和使用開發(fā)價(jià)值的蛋白水解酶產(chǎn)生菌，以期實(shí)現(xiàn)柞蠶殼的生物脫膠，并對(duì)菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行初步的探索。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種來(lái)源

采集柞蠶生產(chǎn)基地周圍10cm 以下的土壤樣品，樣品密封備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，pH 7.0，121 ℃滅菌20min。

篩選培養(yǎng)基：酪蛋白1.0%，磷酸二氫鉀0.03%，七水合硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH7.0，121 ℃滅菌20min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，pH 7.0，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4.0%，蛋白胨5.0%，磷酸二氫鉀0.03%，氯化鈉0.5%，pH 7.0，121 ℃滅菌20min。

1.1.3 主要試劑

生物試劑：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物、酪蛋白，瓊脂，福林酚試劑。

葡萄糖、蔗糖、七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼砂、硼酸、三氯乙酸，均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 蛋白水解酶產(chǎn)生菌的初篩

將樣品接種于富集培養(yǎng)基上，進(jìn)行隔夜培養(yǎng)，再利用稀釋涂布法［12－13］將菌液涂布到篩選培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)48h，挑選出菌落周圍產(chǎn)生較大透明圈的菌株，并記錄各挑選菌株的菌落與透明圈的直徑。

1.2.2 蛋白水解酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將初篩步驟中挑選出來(lái)的菌株進(jìn)行種子液制備，然后再接種到100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃發(fā)酵72h后，取10mL發(fā)酵液進(jìn)行離心（5 000r／min，10min），上清液即為粗酶液。同時(shí)測(cè)定上清液的蛋白酶的活力。

1.2.3 菌種鑒定與生理生化特征

菌株的形態(tài)特征與生理生化特征鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

1.2.4 16SrDNA 序列分析與比對(duì)

16SrDNA 基因測(cè)序委托寶生物工程（大連）有限公司完成。測(cè)序序列與Ezbiocloud 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 蛋白酶活力的測(cè)定

采用中華人民共和國(guó)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《蛋白酶活力測(cè)定法》SB／T 10317—1999進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定。蛋白酶活力定義為在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.2.6 產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

通過(guò)篩選選定一株最優(yōu)菌株，對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究。通過(guò)改變培養(yǎng)基的相關(guān)組分即碳源、氮源和初始pH 來(lái)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，改變發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量等條件考察其對(duì)菌株產(chǎn)酶量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白水解酶產(chǎn)生菌的篩選

通過(guò)篩選培養(yǎng)基共篩選出5株周圍具有蛋白水解透明圈的菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后，分別測(cè)定菌株的蛋白酶活力，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種不同菌株發(fā)酵后菌落直徑比與蛋白酶活力Tab.1 The diameter ratio and enzyme activity of five different strains after fermentation

表1結(jié)果顯示，G1菌株的透明圈與菌落的直徑比和酶活力均為最大。因此，選擇G1 菌株作為出發(fā)菌株研究其產(chǎn)酶條件。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 生理生化特征

G1菌株的菌落形態(tài)特征及生理生化特征表明，G1菌株為革蘭氏染色陰性桿菌，菌落為黃色圓形，乳脂狀，表面光滑隆起，邊緣整齊，易挑取。菌落形態(tài)如圖1所示。該菌為好氧菌，耐氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%。同時(shí)該菌能利用淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、纖維二糖、半乳糖和山梨酸等多種碳源，同時(shí)能夠利用蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨和硝酸銨等氮源，能夠分解酪蛋白和明膠。

圖1 G1菌株在酪蛋白平板上的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strain G1on casein plate

2.2.2 16SrDNA 序列分析與比對(duì)

G1菌株的序列在數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析后得到與其16SrDNA 匹配相似性較高的序列分布，選取匹配相似性在98%以上的序列如表2 所示。結(jié)合該菌株的形態(tài)特征和生理生化特征分析結(jié)果，初步確定G1菌株為L(zhǎng)uteibacteranthropi。

表2 序列比對(duì)結(jié)果Tab.2 Results of sequence alignment

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 碳 源

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入4.0%葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖和麩皮4種碳源，其他發(fā)酵條件保持一致，37 ℃發(fā)酵72h，隨后測(cè)定發(fā)酵液的酶活，結(jié)果如圖2所示。圖2表明，當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí)，測(cè)得發(fā)酵液的酶活最高。分析結(jié)果認(rèn)為，葡萄糖作為單糖能夠直接被菌體吸收利用，發(fā)酵液的酶活表現(xiàn)最高，因此選定葡萄糖為G1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖2 碳源對(duì)G1菌株產(chǎn)酶的影響Fig.2 The effects of carbon resources on enzyme production by strain G1

2.3.2 氮 源

將G1菌株的種子液以3.0%接種量分別接種到以5.0%蛋白胨、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨和豆餅粉為氮源，4.0%葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵72h，測(cè)定發(fā)酵液的酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖3 氮源對(duì)G1菌株產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of nitrogen resources on enzyme production by strain G1

圖3結(jié)果表明，在碳源相同時(shí)，以5.0%蛋白胨為氮源時(shí)的酶活最高。因此選定蛋白胨為G1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

2.3.3 初始pH

將G1菌株分別接種在以4.0%葡萄糖為碳源、5.0%蛋白胨為氮源，pH 分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0和12.0的培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵72h。測(cè)定發(fā)酵液的酶活，結(jié)果如圖4所示。

圖4 起始pH 對(duì)G1菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of initial pH on enzyme production by strain G1

圖4結(jié)果表明，在保證發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源不變的前提下，培養(yǎng)基的初始pH 為8.0時(shí)，酶活達(dá)到最高。

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度

將G1 菌株接種于以4.0%葡萄糖為碳源，5.0%蛋白胨為氮源，初始pH 為8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于22，27，32，37，42，47，52，57，62，67 ℃下發(fā)酵72h，測(cè)定蛋白酶活力，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)G1菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 The effects of temperature on enzyme production by strain G1

由圖5可以看出，當(dāng)其他條件相同時(shí)，隨著溫度的升高，發(fā)酵液的酶活逐漸升高。當(dāng)溫度達(dá)到47 ℃時(shí)酶活達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)增加，酶活顯著下降?？梢?jiàn)，G1菌株能夠適應(yīng)較高的發(fā)酵溫度，47 ℃為G1菌株的最佳發(fā)酵溫度。

2.4.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果的影響

將G1 菌株接種于以4.0%葡萄糖為碳源，5.0%蛋白胨為氮源，初始pH 為8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為47 ℃，分別發(fā)酵24，48，72，96，120h，發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定蛋白酶活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)G1菌株產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of time on enzyme production by strain G1

圖6結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液的酶活逐漸增大，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到96h，蛋白酶活力達(dá)到最大值，隨著發(fā)酵時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，發(fā)酵液的酶活呈下降趨勢(shì)。因此選擇最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為96h。

2.4.3 接種量

將G1菌株的種子發(fā)酵液按1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%的接種量接種于以4.0%葡萄糖為碳源，5.0%蛋白胨為氮源，初始pH 為8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在47℃下培養(yǎng)96h，測(cè)定蛋白酶活力，結(jié)果如圖7所示。

圖7 接種量對(duì)G1菌株產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of G1inoculum volume on enzyme production

圖7結(jié)果表明，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的酶活力逐漸增加，當(dāng)接種量為4.0%時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最大；隨著接種量的不斷增加，發(fā)酵液的酶活力沒(méi)有繼續(xù)增加，反而呈下降趨勢(shì)。因此選擇4.0%為G1菌株的最佳接種量。

3 討 論

本研究從養(yǎng)殖柞蠶的生產(chǎn)基地周圍的土壤中篩選出一株能夠產(chǎn)生蛋白水解酶的菌株G1。在篩選過(guò)程中，利用以酪蛋白為唯一碳源和唯一氮源的篩選平板，能更具有針對(duì)性地篩選出產(chǎn)生蛋白水解酶的菌株。同時(shí)依據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特征以及16SrDNA 序列比對(duì)進(jìn)行分析，初步鑒定該菌株為L(zhǎng)uteibacteranthropi。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以4.0%葡萄糖為碳源、5.0%蛋白胨為氮源和初始pH 為8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，47 ℃下發(fā)酵96h，產(chǎn)酶量達(dá)到最大值，為1 520U／mL。

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