吳 星，王 紅 英，錢 斯 日 古 楞，劉 丹

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

養(yǎng)殖水體污染是目前普遍現(xiàn)象，特點(diǎn)是污染物主要由高密度養(yǎng)殖模式下的大量殘餌、代謝物構(gòu)成，直接危害魚蝦等養(yǎng)殖對(duì)象，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致水體缺氧，引起暴發(fā)性疾病。為防治各種病害常需施用藥物，包括消毒劑、殺蟲劑、抗生素等［1－2］。使用藥物不僅加重破壞了養(yǎng)殖水體的自然微生態(tài)區(qū)系，同時(shí)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物和有益微生物產(chǎn)生更大的副作用，影響它們的正常生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，而藥物的殘留也會(huì)對(duì)人類的健康造成一定的危害［3－4］。水體中的微生物對(duì)水體中有害物質(zhì)的分解沒有副作用，可以有效減少抗生素的用量，因此越來越多的微生物菌種被用于水體凈化［5］。本實(shí)驗(yàn)以革蘭氏陰性和革蘭氏陽性兩類菌作為指示菌，篩選出對(duì)指示菌有生長(zhǎng)抑制作用的菌體，用于抑制水體有害微生物，從而減少養(yǎng)殖生物抗生素的用量。本實(shí)驗(yàn)在前人研究［6－8］的基礎(chǔ)上進(jìn)一步的研究養(yǎng)殖水體中微生物的凈化作用，篩選養(yǎng)殖水體中凈化效果好的微生物。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種來源和水體凈化用水

大連市莊河三鵬淡水養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖水。

1.1.2 菌 種

北京棒狀桿菌（AS1299）、藤黃八疊球菌（HY78）、大 腸 桿 菌（ATCC25922）、產(chǎn) 氣 桿 菌（AS1489），均由大連工業(yè)大學(xué)提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基；分離培養(yǎng)基：添加2%瓊脂粉的LB培養(yǎng)基。

1.2 菌體的篩選

1.2.1 菌體的富集

取采樣水體于滅過菌的三角瓶中，按照15%的量加入LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120r／min振蕩培養(yǎng)48h左右。

1.2.2 菌體分離純化

取富集培養(yǎng)液10－1、10－2稀釋，涂布于分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48h，出現(xiàn)單菌落，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)以及鏡檢結(jié)果挑取單菌落繼續(xù)劃線分離直至純化，于冰箱保存。

1.2.3 凈化水體菌株的初篩

通過對(duì)革蘭氏陰性、革蘭氏陽性菌抑制效果對(duì)菌體進(jìn)行初篩。

1.2.3.1 菌體的活化

將初篩得到的菌體及4種指示菌分別挑取數(shù)環(huán)于LB液體培養(yǎng)基，于搖床120r／min，30 ℃培養(yǎng)24h。

1.2.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)及復(fù)篩

將活化后的指示菌經(jīng)過稀釋涂于平板，每種指示菌2次重復(fù)并放置牛津杯備用。

1.2.4 菌株的復(fù)篩

篩選得到的菌種發(fā)酵培養(yǎng)24h，離心取上清液200μL至牛津杯中，每個(gè)菌種2次重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)24h，觀察4種指示菌的抑菌效能，篩選出具有抑菌作用的細(xì)菌［9－10］。

1.3 養(yǎng)殖水體的凈化

從抑菌實(shí)驗(yàn)中選取抑菌圈直徑大于等于20mm的5種菌體，于30 ℃分別發(fā)酵培養(yǎng)24h，離心去上清，按2 mL 菌液的沉淀物投入到100mL養(yǎng)殖水體的比例，將5種菌體分別投入到相同環(huán)境的養(yǎng)殖水體中，養(yǎng)殖水室溫下（5 ℃）敞口靜置24，36，48，60，72h后，分別對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行離心，取上清液測(cè)定養(yǎng)殖水體的化學(xué)需氧量、氨氮含量、亞硝酸鹽氮含量，觀察水體凈化情況。

1.3.1 化學(xué)需氧量

采用酸性高錳酸鉀法測(cè)定化學(xué)需氧量，酸性溶液中高錳酸鉀可將具有還原性的物質(zhì)氧化，然后剩余高錳酸鉀用草酸鈉還原，根據(jù)消耗的高錳酸鉀量折合成氧進(jìn)行計(jì)算［11－12］。

1.3.2 氨氮含量

次溴酸鹽氧化法測(cè)定淡水氨氮含量［13］。NH4－N標(biāo)準(zhǔn)使用液（5 mg／L）作氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線［14－15］，測(cè)得氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y＝8.641 8x＋0.021 4。

1.3.3 亞硝酸鹽氮

磷酸介質(zhì)中，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酰胺反應(yīng)生成重氮鹽，再與N－（1－萘基）－乙二胺偶聯(lián)生成紅色染料，用比色法可測(cè)定NaNO2的含量［16］。測(cè)定亞硝酸鹽氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，亞硝酸鹽氮標(biāo)注曲線公式為：y＝0.071 9x＋0.117 5。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體的富集與純化

經(jīng)過菌體富集與初篩，分離得到14種菌種。編號(hào)分別為芽孢1、芽孢2、芽孢3、芽孢4、芽孢5、芽孢6、芽孢7、芽孢8，桿菌1、桿菌2、桿菌3、桿菌4，球菌1、球菌2。

2.2 凈化菌體的復(fù)篩

通過牛津杯法觀察初篩菌株對(duì)指示菌的抑菌效果，得到10種菌對(duì)指示菌有抑制作用，分別是芽孢1、芽孢2、芽孢3、芽孢4、芽孢5、芽孢6、芽孢7、芽孢8，桿菌1、桿菌4。測(cè)量抑菌圈大小，觀察抑菌效果，結(jié)果見表1。

表1 菌株對(duì)指示菌的抑菌效果Tab.1 Bacteriostasis of strains to indicator bacteria

由表1可見，桿菌2、桿菌3、球菌1、球菌2 4種菌對(duì)指示菌都沒有抑制作用；對(duì)指示菌有抑制效果的10種菌體中，芽孢1、芽孢6對(duì)1299有抑菌作用，芽孢1為中度敏感，芽孢6為高度敏感；芽孢3、芽孢4、芽孢5、芽孢6、桿菌1 5種菌對(duì)產(chǎn)氣菌有抑菌作用，且均為中度敏感；芽孢7、芽孢8對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生抑制，為低度敏感；芽孢1、芽孢2、芽孢6、芽孢8、桿菌4 5種菌對(duì)八疊菌產(chǎn)生了抑菌效果，芽孢1、芽孢6、桿菌4為中度敏感，芽孢2、芽孢8為高度敏感。

2.3 養(yǎng)殖水體的凈化結(jié)果

2.3.1 化學(xué)需氧量的降低

5種菌體對(duì)養(yǎng)殖水體化學(xué)需氧量的降低效果見圖1。由圖1可知，在培養(yǎng)的72h里養(yǎng)殖水中的還原物質(zhì)增多，化學(xué)需氧量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，5種菌種對(duì)化學(xué)需氧量的降低效果較接近，其中桿菌1 的效果最好，72 h 內(nèi)的平均降低量達(dá)到26.80%。芽孢2、芽孢6、芽孢8的效果較為接近，分別為6.34%，8.53%，10.12%，芽孢4 的效果最差，僅降低了6.34%。劉芳等［17］在利用光合細(xì)菌凈化水質(zhì)中COD 降低了24.8%，本實(shí)驗(yàn)篩選的桿菌1的效果高于劉芳等篩選的HZ－5，可見不同的菌種、光照條件、溫度等條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有一定影響。曾地剛等［18］在利用枯草芽孢桿菌對(duì)水質(zhì)凈化研究中，水體COD 降低了16.9%，可見菌株的篩選很重要，菌體的投放量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定影響。

圖1 篩選的菌體對(duì)化學(xué)需氧量的影響Fig.1 Effect of bacteria on COD of culture water

2.3.2 氨氮的去除效果

5種菌體對(duì)養(yǎng)殖水體氨氮的去除效果見圖2。由圖2可知，在培養(yǎng)的72h內(nèi)，養(yǎng)殖水中氨氮含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，5種菌體對(duì)氨氮的去除能力有明顯差異，其中桿菌1對(duì)氨氮的去除效果最好，平均去除率達(dá)到92.70%，明顯高于其他4種菌體，其次是芽孢2和芽孢8，去除率分別為77.47%和76.71%。這兩種菌體對(duì)氨氮的去除能力接近，芽孢4對(duì)氨氮的去除效果最差，為9.44%。陳秋紅等［6］在利用微生物凈化水之中，氨氮含量最高降低了57.9%，可見菌種的差異、溫度的不同、不同污染程度的養(yǎng)殖水對(duì)凈化結(jié)果都有影響。高宇等［7］在利用芽孢桿菌凈化水體中，對(duì)菌種的投放量進(jìn)行了探索，水體氨氮含量最高降低91.3%，可見菌體的差異和菌體量對(duì)氨氮的去除效果影響較大。

圖2 篩選的菌體對(duì)氨氮的影響Fig.2 Effect of bacteria on ammonia nitrogen of culture water

2.3.3 亞硝酸鹽氮的去除效果

5種菌體對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的去除效果見圖3。由圖3可知，在連續(xù)測(cè)定的72h內(nèi)，測(cè)量組和空白組的亞硝酸鹽氮的含量呈上升趨勢(shì)，72h里芽孢4對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的去除效果最好，平均去除率達(dá)到72.67%；桿菌1對(duì)亞硝酸鹽的去除效果也相對(duì)較好，達(dá)到53.33%；芽孢6在24h后的去除效果較好，48h后亞硝酸鹽的含量相對(duì)于24h明顯增加，平均去除率為29.78%；芽孢2、芽孢8的去除效果較差，分別為15.57%和36.36%。

圖3 篩選的菌體對(duì)亞硝酸鹽氮的影響Fig.3 Effect of bacteria on nitrite nitrogen of culture water

高海英等［8］篩選出的不同芽孢桿菌對(duì)淡水亞硝酸鹽氮的去除效果不同，去除率在11.54%～72.10%。本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株去除率最高達(dá)到72.6%，可見菌種的差異對(duì)亞硝酸鹽氮的去除效果影響較大。高宇等［20］在利用芽孢桿菌凈化水體時(shí)，菌種的投放量在2%～8%，氨氮去除率依次遞增，最高達(dá)到90.3%，明顯高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見菌種的差異和投放量的不同對(duì)水體亞硝酸鹽氮的去除效果有較大影響。

3 結(jié) 論

養(yǎng)殖水體中有很多對(duì)水體有凈化作用的微生物，經(jīng)過微生物的分離純化，再經(jīng)過抑菌實(shí)驗(yàn)的初篩，得到10種菌體對(duì)指示菌有抑制效果，最后從初篩結(jié)果中挑取抑菌效果較好的5種菌體，測(cè)定其對(duì)養(yǎng)殖水體化學(xué)需氧量、氨氮、亞硝酸鹽氮的去除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 種菌體對(duì)水質(zhì)的凈化都有一定的效果，其中對(duì)化學(xué)需氧量和氨氮含量指標(biāo)的去除效果最好的是桿菌1，去除率分別達(dá)到26.80%和92.70%，其次是芽孢2 和芽孢8。對(duì)亞硝酸鹽氮的去除效果最好的是芽孢4，去除率為72.67%，其次是桿菌1，去除率為53.33%。

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