不同種類脂肪酸對巨噬細胞M1/M2極化的影響*

羅雯靜隋永恒連敏華靜#

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內科上海市消化疾病研究所(200001)

*基金項目：國家自然科學基金(No. 81170374, No. 81470842)

背景：巨噬細胞表型和功能改變在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)不同種類脂肪酸在NAFLD中發(fā)揮不同作用。目的：探討不同種類脂肪酸對巨噬細胞M1/M2極化的影響及其可能機制。方法：分別以脂多糖(LPS)、白細胞介素-4(IL-4)、飽和脂肪酸[棕櫚酸(PA)]、多不飽和脂肪酸[二十二碳六烯酸(DHA)]、LPS/IL-4聯(lián)合PA/DHA處理小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株，同時設立陰性對照組。采用real-time PCR檢測M1型巨噬細胞極化基因[誘生型一氧化氮合酶2(iNOS2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]和M2型巨噬細胞極化基因[精氨酸酶1(ARG1)、甘露糖受體C2(MRC2)]表達；采用蛋白質印跡法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和磷酸化核因子-κBp65(pNF-κBp65)表達。結果：與陰性對照組比較，LPS組iNOS2、TNF-α表達顯著升高(P<0.01；P<0.05)，IL-4組ARG1、MRC2表達顯著升高(P<0.01；P<0.05)，PA組iNOS2、TNF-α、ARG1表達顯著升高(P<0.05；P<0.01；P<0.05)，DHA組iNOS2表達顯著降低(P<0.01)。LPS+PA組和IL-4+PA組可進一步影響TNF-α、ARG1表達，但與LPS組、IL-4組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與LPS組比較，LPS+DHA組iNOS2、TNF-α表達顯著降低(P<0.05；P<0.05)；與IL-4組比較，IL-4+DHA組ARG1表達顯著降低(P<0.01)。與陰性對照組比較，PA組、DHA組PPARγ蛋白表達水平顯著升高，PA組pNF-κBp65蛋白表達水平顯著升高。結論：飽和脂肪酸能誘導巨噬細胞M1/M2混合型極化，而多不飽和脂肪酸則抑制巨噬細胞M1型極化。不同種類脂肪酸可能通過PPARγ/NF-κB相關信號通路參與巨噬細胞M1/M2極化的轉化。

關鍵詞脂肪酸類；巨噬細胞；過氧化物酶體增殖物激活受體；NF-κB；非酒精性脂肪性肝病

Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是與胰島素抵抗密切相關的遺傳-環(huán)境-代謝應激性臨床病理綜合征。近年研究發(fā)現(xiàn)，不同種類脂肪酸在NAFLD中具有不同作用，飽和脂肪酸介導的肝內炎癥-免疫紊亂在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]，而多不飽和脂肪酸可減少肝內脂肪沉積，對NAFLD具有一定治療效應[2-3]。巨噬細胞是機體免疫防御的重要組成成分，具有高度的異質性和可塑性，在體內外不同微環(huán)境作用下可分化為M1型巨噬細胞即經(jīng)典活化的巨噬細胞(classically activated macrophages, CAM)和M2型巨噬細胞即替代活化的巨噬細胞(alternative activated macrophages, AAM)[4]。研究[5]指出，巨噬細胞表型和功能改變在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本研究旨在探討不同種類脂肪酸對巨噬細胞M1/M2極化的影響及其可能機制。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株購自中國科學院細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、棕櫚酸(palmitic acid, PA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)購自Sigma公司；白細胞介素-4(IL-4)購自PeproTech公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自Takara公司；PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體、兔抗鼠磷酸化核因子-κBp65(pNF-κBp65)抗體購自Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)：RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中(37 ℃、5% CO2)，培養(yǎng)至第3代后調整細胞濃度至1×105/mL，接種于6孔板和12孔板，培養(yǎng)24 h使細胞密度達到80%。

2. 細胞處理：RAW264.7細胞培養(yǎng)24 h后換液，分別以含LPS(100 ng/mL)、IL-4(5 ng/mL)、PA(0.5 mmol/L)、DHA(50 μmol/L)、LPS+PA(100 ng/mL+0.5 mmol/L)、LPS+DHA(100 ng/mL+50 μmol/L)、IL-4+PA(5 ng/mL+0.5 mmol/L)、IL-4+DHA(5 ng/mL+50 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，陰性對照組RAW264.7細胞以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內分別培養(yǎng)6 h和24 h，洗去培養(yǎng)液，收集細胞待測。

3. Real-time PCR法：取上述各處理組培養(yǎng)6 h的細胞，以Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，行real-time PCR檢測M1型巨噬細胞極化基因表達水平，包括誘生型一氧化氮合酶2(inducible nitric oxide synthase 2, iNOS2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α , TNF-α)；M2型巨噬細胞極化基因表達水平，包括精氨酸酶1(arginase 1, ARG1)、甘露糖受體C2(mannose receptor C type 2, MRC2)。iNOS2引物上游：5’-GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG-3’，下游：5’-CTC CTG CCC ACT GAG TTC GTC-3’；TNF-α引物上游：5’-TCT TCT CAT TCC TGC TTG TGG-3’，下游：5’-GGT CTG GGC CAT AGA ACT GA-3’； ARG1引物上游：5’-CTC CAA GCC AAA GTC CTT AGA G-3’，下游：5’-AGG AGC TGT CAT TAG GGA CAT C-3’；MRC2引物上游：5’-TAC AGC TCC ACG CTA TGG ATT-3’，下游：5’-CAC TCT CCC AGT TGA GGT ACT-3’；β-actin引物上游：5’-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3’，下游：5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。以2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

4. 蛋白質印跡法：取經(jīng)LPS、IL-4、PA、DHA處理24 h以及相同培養(yǎng)時間的陰性對照組細胞，以細胞裂解液抽提細胞總蛋白。取蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，濕法電轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔抗鼠PPARγ抗體(1∶500)、兔抗鼠pNF-κBp65抗體(1∶500)、兔抗鼠GAPDH抗體(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，室溫復溫30 min，以TBS-T清洗后，加入HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，以ECL發(fā)光劑顯色，置暗盒X線曝光，常規(guī)顯影、定影。

三、統(tǒng)計學分析

結果

一、脂肪酸對M1/M2型巨噬細胞極化基因表達的影響

Real-time PCR檢測結果顯示，與陰性對照組比較，LPS組iNOS2、TNF-α表達顯著升高(P<0.01；P<0.05)，IL-4組ARG1、MRC2表達顯著升高(P<0.01；P<0.05)，PA組iNOS2、TNF-α、ARG1表達顯著升高(P<0.05；P<0.01；P<0.05)，DHA組iNOS2表達顯著降低(P<0.01)(圖1)。

二、脂肪酸聯(lián)合LPS/IL-4對M1/M2型巨噬細胞極化基因表達的影響

Real-time PCR檢測結果顯示，與LPS組、IL-4組比較，LPS+PA組和IL-4+PA組可進一步影響TNF-α、ARG1表達，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與LPS組比較，LPS+DHA組iNOS2、TNF-α表達顯著降低(P<0.05；P<0.05)；與IL-4組比較，IL-4+DHA組ARG1表達顯著降低(P<0.01)(圖2)。

三、脂肪酸對巨噬細胞PPARγ、pNF-κBp65蛋白表達的影響

蛋白質印跡法檢測結果顯示，與陰性對照組比較，LPS組、PA組、DHA組PPARγ蛋白表達水平有所升高，尤以PA組、DHA組為著；LPS組、PA組pNF-κBp65蛋白表達水平有所升高，尤以PA組為著；IL-4組、DHA組pNF-κBp65蛋白表達水平無明顯變化(圖3)。

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

與LPS/IL-4組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3不同種類脂肪酸對巨噬細胞PPARγ、pNF-κBp65蛋白表達的影響(蛋白質印跡法)

討論

巨噬細胞是機體免疫防御機制中的重要成分，在天然免疫和適應性免疫中具有重要調節(jié)作用。巨噬細胞可針對不同刺激信號作出應答，并分化成為具有不同功能的表型細胞即極化，其極化類型主要包括經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型巨噬細胞由LPS、干擾素-γ(IFN-γ)、TNF等誘導活化，其活化標志包括iNOS2、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、TNF-α、IL-6等，與炎癥反應的啟動和維持有關；M2型巨噬細胞由IL-4、IL-13、IL-33、IL-21等誘導活化，其活化標志包括ARG1、MRC2、IL-10、Pdcd1lg2、CD163等，與炎癥反應緩解、組織重塑和免疫調節(jié)有關[4]。近年研究指出，肥胖動物脂肪組織中M1型巨噬細胞浸潤增加，與脂肪細胞功能障礙、胰島素抵抗密切相關；而體瘦動物脂肪組織中的巨噬細胞以M2型為主，且高脂飲食致其肥胖后可引起M2型巨噬細胞向M1型轉變[6-7]。此外，研究[8-9]顯示小鼠肝內M1型巨噬細胞-Kupffer細胞極化可導致非酒精性脂肪性肝炎(NASH)程度加重，而消除Kupffer細胞則可預防肝臟脂肪變性和胰島素抵抗的進展。上述結果提示，在肥胖、NAFLD的發(fā)生、發(fā)展過程中，脂肪組織、肝臟微環(huán)境的改變可能對巨噬細胞/Kupffer細胞極化產(chǎn)生重要影響。

不同種類的脂肪酸具有不同炎癥-免疫調節(jié)功能。本研究組既往研究[10]發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸與胰島素抵抗、NAFLD進展相關，而多不飽和脂肪酸則對機體具有保護作用。本研究在此基礎上進一步探討不同種類脂肪酸對巨噬細胞極化的影響，結果顯示飽和脂肪酸PA可誘導巨噬細胞M1/M2混合型極化，以M1型極化為著，而多不飽和脂肪酸DHA則能顯著降低M1型巨噬細胞極化基因表達，并抑制LPS誘導的M1型巨噬細胞極化。本研究組近期研究[11]發(fā)現(xiàn)，體內外高脂環(huán)境(飽和脂肪酸為主)可誘導Kupffer細胞活化。由此推測，飽和脂肪酸可能通過誘導M1型巨噬細胞極化參與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展，而多不飽和脂肪酸則通過抑制甚至逆轉M1型巨噬細胞極化阻止NAFLD進展。

研究顯示，飽和脂肪酸可通過Toll樣受體4(TLR4)信號通路調節(jié)NF-κB等轉錄因子介導的炎癥反應發(fā)生[12]。NF-κB是M1型巨噬細胞活化的關鍵轉錄因子，當NF-κB的作用受到抑制時，巨噬細胞可從M1型向M2型轉化[13]。PPARγ亦參與巨噬細胞極化，與M2型巨噬細胞的誘導和維持有關。Odegaard等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ基因缺失小鼠的脂肪組織中缺乏M2型巨噬細胞，可致脂質代謝異常和胰島素抵抗。PPARγ調節(jié)M2型巨噬細胞極化的機制尚未完全闡明。研究[15]指出，PPARγ可通過反向抑制作用干擾NF-κB信號通路，降低LPS誘導的巨噬細胞炎性信號途徑活化，這可能是其發(fā)揮抗炎和免疫調節(jié)作用的關鍵機制。本研究發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸PA可顯著上調PPARγ和pNF-κBp65蛋白表達水平，而多不飽和脂肪酸DHA可增加PPARγ蛋白表達，對pNF-κBp65表達無影響。上述結果提示，飽和脂肪酸可能作為非微生物性危險信號啟動巨噬細胞NF-κB炎性信號途徑，并引起具有抗炎作用的PPARγ反饋性表達增加，因此巨噬細胞表現(xiàn)為M1/M2型混合型極化以抑制過度的炎癥反應，而多不飽和脂肪酸作為PPARγ的重要天然配體誘導PPARγ表達增加，盡管未見其能顯著誘導M2型巨噬細胞極化，但對M1型極化具有顯著抑制作用，可能與上調PPARγ表達以干擾或調節(jié)NF-κB信號通路有關。

綜上所述，不同種類飲食脂肪酸對巨噬細胞極化具有不同影響，飽和脂肪酸能誘導巨噬細胞M1/M2混合型極化，而多不飽和脂肪酸則抑制巨噬細胞M1型極化。不同種類脂肪酸可能通過PPARγ/NF-κB相關信號通路參與巨噬細胞M1/M2極化的轉化。

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(2014-09-02收稿)

Effects of Different Fatty Acids on Macrophage M1/M2 Polarization

LUOWenjing,SUIYongheng,LIANMin,HUAJing.DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,Shanghai(200001)

Correspondence to: HUA Jing, Email: hua-jing88@hotmail.com

Background: The alterations of macrophage phenotype and function play an important role in the development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Recent studies have shown that different types of fatty acids have different effects on NAFLD. Aims: To investigate the effects of different fatty acids on macrophage M1/M2 polarization and the possible mechanisms. Methods: Murine RAW264.7 macrophages were treated with lipopolysaccharide (LPS), interleukin-4 (IL-4), saturated fatty acid [palmitic acid (PA)], polyunsaturated fatty acid [docosahexaenoic acid (DHA)] as well as LPS/IL-4 combined with PA/DHA, respectively, and a negative control group was established. Expressions of M1 phenotype markers [inducible nitric oxide synthase 2 (iNOS2) and tumor necrosis factor-α (TNF-α)] and M2 phenotype markers [arginase 1 (ARG1) and mannose receptor C type 2 (MRC2)] were determined by real-time PCR. Expressions of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) and phosphorylated nuclear factor-κBp65 (pNF-κBp65) were determined by Western blotting. Results: Compared with negative control group, expressions of iNOS2 and TNF-α were significantly increased in LPS group (P<0.01;P<0.05), expressions of ARG1 and MRC2 were significantly increased in IL-4 group (P<0.01;P<0.05), expressions of iNOS2, TNF-α and ARG1 were significantly increased in PA group (P<0.05;P<0.01;P<0.05), however, expression of iNOS2 was significantly decreased in DHA group (P<0.01). LPS+PA and IL-4+PA could further affect expressions of TNF-α and ARG1, but no significant difference was seen between LPS+PA, IL-4+PA groups and LPS, IL-4 groups (P>0.05). Compared with LPS group, expressions of iNOS2 and TNF-α were significantly decreased in LPS+DHA group (P<0.05;P<0.05). Expression of ARG1 was significantly decreased in IL-4+DHA group when compared with IL-4 group (P<0.01). Compared with negative control group, expression of PPARγ was significantly increased in PA and DHA groups, and expression of pNF-κBp65 was significantly increased in PA group. Conclusions: Saturated fatty acid induces macrophage M1/M2 mixed polarization, while polyunsaturated fatty acid inhibits macrophage M1 polarization. Different types of fatty acids are involved in the transition of macrophage M1/M2 polarization which may mediate by PPARγ/NF-κB signaling pathways.

Key wordsFatty Acids;Macrophages;Peroxisome Proliferator-Activated Receptors;NF-kappa B;

通信作者#本文，Email: hua-jing88@hotmail.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.01.007