表達硫氧還蛋白1的幽門螺桿菌對人胃上皮細胞株GES-1生長的影響

劉琳娜1丁士剛2#石巖巖2賈淑娟1

北京大學首鋼醫(yī)院消化科1(100041)北京大學第三醫(yī)院消化科2

*本課題由國家自然科學基金(30770980)資助

背景：幽門螺桿菌(Hp)感染在胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，細菌毒力因子是導致不同胃疾病的重要因素。目的：研究高、低表達硫氧還蛋白1(Trx1)的Hp對人胃上皮細胞株GES-1生長的作用。方法：按1∶50、1∶100、1∶200的細胞/細菌比例分別加入GES-1細胞和高、低表達Trx1的Hp菌株共培養(yǎng)，并設不加菌株的空白細胞作為對照組，分別于培養(yǎng)24 h和48 h時采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，MTT法檢測細胞存活率。收集1∶100濃度組和對照組GES-1細胞，采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期。結(jié)果：高、低表達Trx1的Hp對GES-1細胞有損傷作用，細胞存活率降低，且呈時間和濃度依賴性，在Trx1高表達組中尤為明顯。流式細胞術(shù)顯示Trx1高表達組GES-1細胞進入S期的比例在24 h和48 h均明顯高于Trx1低表達組。結(jié)論：高、低表達Trx1的Hp對GES-1細胞生長具有抑制作用，高表達Trx1的Hp具有更強的致病性，與致胃癌作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞幽門螺桿菌；硫氧還蛋白質(zhì)類；GES-1；細胞增殖；細胞周期

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)感染是人類最常見的慢性細菌感染之一，感染后臨床結(jié)局的不同可能與細菌毒力因子和宿主感染后的反應不同有關(guān)[1]。最新研究顯示，高致病性Hp菌株的菌體成分和毒力因子與低致病性菌株明顯不同，這些成分和毒力因子與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。

硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)于1964年首先由Laurent等[4]在大腸桿菌中分離，Windle等[5]首先分析了Hp的Trx，Trx系統(tǒng)是Hp惟一的抗氧化系統(tǒng)，含有兩個亞型，即Trx1和Trx2。Trx1可作為AhpC的電子供體發(fā)揮作用，而Trx2則無此作用[6]。張靜等[7]發(fā)現(xiàn)Trx在胃癌相關(guān)菌株中呈高表達，推測其可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。石巖巖等[8]采用實時定量熒光PCR法檢測不同胃疾病Hp的Trx1 mRNA表達量，結(jié)果顯示Trx1高表達的Hp與胃癌密切相關(guān)，可作為致胃癌的毒力因子發(fā)揮作用。本研究旨在探討高、低表達Trx1的 Hp對GES-1細胞生長的影響。

材料與方法

一、材料

1. Hp菌株：本研究所用高、低表達Trx1的Hp菌株(由北京大學第三醫(yī)院消化科實驗室培養(yǎng)并測定)來源于前期工作中采用PCR法比較不同胃疾病來源的Trx1 mRNA，并確定了其高、低表達量的界限，10%區(qū)間值為8.86，90%區(qū)間值為28.05[8]。

2. 細胞株：GES-1細胞株購自北京康為世紀生物科技有限公司。

3. 主要試劑：胎牛血清購自Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，哥倫比亞瓊脂基礎培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司，二甲基亞砜(DMSO)和碘化丙啶(PI)購自Sigma公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

4. 主要儀器：倒置相差顯微鏡(Leica DMIL 090-135.001)、流式細胞儀、酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Scientific)。

二、方法

1. 細菌培養(yǎng)：取-80 ℃保存的高、低表達Trx1的Hp菌株，室溫下解凍，取菌株懸液接種于哥倫比亞固體培養(yǎng)基(含新鮮全羊血10%)，并置于37 ℃微需氧環(huán)境(5% O2，10% CO2，85% N2)中，72 h后細菌生長良好，收集細菌，采用分光光度計在波長660 nm 處測定細菌濃度。

2. 細胞培養(yǎng)：將GES-1細胞置于細胞培養(yǎng)箱，于37 ℃ 50 mL/L CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，每周更換3次營養(yǎng)液，并于細胞生長約80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化并以1∶3傳代。

3. 細菌、細胞共培養(yǎng)：收集對數(shù)生長期GES-1細胞，分別接種于6孔板(1×105/孔)和96孔板(1×104/孔，復3孔)，實驗組細胞按1∶50、1∶100、1∶200 的細胞/細菌比例加入菌株，另設不加菌株的空白細胞作為對照組，于37 ℃ 50 mL/L CO2飽和濕度環(huán)境中共同孵育。

4. 細胞形態(tài)學觀察：共培養(yǎng)24、48 h時，通過倒置相差顯微鏡觀察GES-1細胞的形態(tài)變化。

5. 細胞存活率檢測：采用MTT法。細胞經(jīng)胰酶消化制成單細胞懸液，按2×103/孔的密度接種于96孔板，設3個復孔，加入20 μL MTT 4 h，DMSO 10 min，在波長550 nm處測定吸光度(A)值，重復3次，存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

6. 細胞周期檢測：分別于共培養(yǎng)24、48 h時收集1∶100濃度組和對照組的細胞原培養(yǎng)液，制成細胞懸液，1 000×g離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌1次，然后重懸于-20 ℃預冷的75%乙醇中，-20 ℃保存，測量時調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL細胞懸液，PBS洗滌3次，細胞重懸于1 mL PI染液中，30 min后上流式細胞儀檢測。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié)果

一、GES-1細胞形態(tài)變化

倒置相差顯微鏡下見對照組細胞壁光滑，細胞飽滿，狀態(tài)良好，細胞呈長梭型，均一貼壁生長，培養(yǎng)液清亮。實驗組細胞狀態(tài)隨Hp濃度增高以及觀察時間延長而出現(xiàn)細胞壁欠光滑，細胞不飽滿，貼壁細胞數(shù)量減少，細胞變圓，懸浮細胞增多，培養(yǎng)液變渾濁，其中Trx1高表達組的GES-1細胞受損狀態(tài)較Trx1低表達組嚴重，且在48 h時更為明顯(圖1)。

二、高、低表達Trx1的Hp對細胞的影響

GES-1細胞的增殖活性隨時間延長和Hp濃度的增加逐漸受到抑制，呈時間和濃度依賴性。與對照組相比，隨著Hp濃度的增高和觀察時間延長，實驗組細胞的存活率逐漸降低，其中Trx1高表達組的細胞存活率低于相同Hp濃度的Trx1低表達組(表1)。

三、細胞周期

與對照組相比，實驗組GES-1細胞進入S期的比例升高，且48 h時細胞進入S期的比例明顯高于24 h，Trx1高表達組GES-1細胞進入S期的比例亦明顯高于Trx1低表達組(表2)。

圖1　Trx1高、低表達的不同Hp濃度組GES-1細胞損傷狀態(tài)(倒置相差顯微鏡，×100)

組 別1∶50Trx1高表達組Trx1低表達組1∶100Trx1高表達組Trx1低表達組1∶200Trx1高表達組Trx1低表達組24h 對照組0.556±0.0420.556±0.0420.556±0.0420.556±0.0420.556±0.0420.556±0.042 實驗組0.343±0.026*#0.402±0.029*0.286±0.036*#0.326±0.040*0.257±0.016*0.277±0.013*48h 對照組0.540±0.0120.540±0.0120.540±0.0120.540±0.0120.540±0.0120.540±0.012 實驗組0.204±0.035*#0.343±0.040*0.192±0.059*#0.222±0.001*0.141±0.029*0.208±0.029*

*與對照組比較，P<0.05；#與相同Hp濃度的Trx1低表達組比較，P<0.05

表2　GES-1細胞周期變化(%)

*與對照組比較，P<0.05；#與Trx1低表達組比較，P<0.05

討論

在正常情況下，胃黏膜細胞增殖與凋亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)以保持胃黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，大量研究發(fā)現(xiàn)Hp感染可使這一平衡遭到破壞，促進胃癌的發(fā)生，但Hp感染引起上述變化的機制仍未闡明[9]。西方國家的研究顯示，含CagA和VacA的Hp細菌毒力強，與引起潰瘍、胃癌等發(fā)生密切相關(guān)，在致病過程中起有關(guān)鍵作用；但我國等東亞國家的研究[10-12]結(jié)果顯示，超過90%的東亞人群感染的Hp含有上述因子，可能存在與西方不同的致病毒力；但目前仍未取得令人滿意的結(jié)果。

Trx1為分泌蛋白，當受到化學、生物、環(huán)境等應激刺激時，可能通過Ⅳ分泌系統(tǒng)等分泌。在Hp定植宿主的過程中，Trx1可通過催化還原反應減輕宿主對Hp的反應，誘導宿主局部黏膜組織黏蛋白結(jié)構(gòu)破壞，使Hp易于定植，并且還有保護Hp免受宿主胃酸損害等作用。Trx1還可對精氨酸酶進行翻譯后刺激，使其活性增加，而精氨酸酶可抑制宿主氮氧化物的產(chǎn)生，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

何紅梅等[13]采用胃癌高發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)的差異基因型Hp與GES-1細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示胃癌高發(fā)區(qū)差異基因型對GES-1細胞具有更強的損傷作用，其作用機制可能是增加8-羥基脫氧鳥苷的表達而引起細胞惡性轉(zhuǎn)化。郭濤等[14]的研究顯示，Hp可通過上調(diào)Fas受體表達直接介導胃上皮細胞凋亡，Hp相關(guān)細胞因子白細胞介素-8可能通過上調(diào)Fas受體表達增強Hp誘導的GES-1細胞凋亡。何興祥等[15]采用Hp慢性感染胃上皮細胞，結(jié)果顯示可誘導胃上皮細胞產(chǎn)生凋亡耐受，并可增加胃上皮細胞癌變的危險性。

本研究采用高、低表達Trx1的Hp與GES-1細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示與對照組相比， Trx1 高表達和低表達組細胞壁欠光滑，細胞不飽滿，貼壁細胞數(shù)量減少，細胞變圓，懸浮細胞增多，培養(yǎng)液變渾濁，Trx1高表達組對細胞的損傷作用更明顯，且這種作用與Hp濃度、共育時間呈正相關(guān)。MTT結(jié)果顯示Trx1高表達組GES-1細胞生長明顯受抑制，細胞存活率下降，與低表達組相比，細胞:細菌濃度比為1∶50和1∶100時，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞周期檢測顯示Trx1高表達組的GES-1細胞周期分布受到明顯影響，處于S期的細胞比例增多，與觀察時間呈正相關(guān)，與低表達組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且伴有明顯的亞二倍體出現(xiàn)，結(jié)合MTT結(jié)果提示細胞阻滯于S期，凋亡趨勢明顯。由此推測Trx1可能為毒力因子，其通過使GES-1細胞阻滯于S期，抑制細胞增殖活力，可能導致DNA的合成以及表達發(fā)生變化，使正常胃上皮細胞增殖與凋亡的平衡發(fā)生紊亂。說明Trx1可能作為一種毒力因子，對細胞有損傷作用，且Trx1表達越高，對細胞的損傷作用更明顯。此外，Trx1對胃上皮細胞的損傷作用可能使細胞產(chǎn)生氧化應激，進而刺激細胞代償性增生，使細胞DNA合成增加，進入S期的比例升高，這種增殖活性受到抑制而引起的代償性增生反應過程，有可能存在癌變的危險，可能是Trx1致胃癌發(fā)生的機制之一。

參考文獻

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(2014-07-17收稿；2014-08-23修回)

·共識與指南·

Effect ofHelicobacterpyloriwith Thioredoxin-1 Expression on Growth of Human Gastric Epithelial Cell Line GES-1LIULinna1,DINGShigang2,SHIYanyan2,JIAShujuan1.1DepartmentofGastroenterology,PekingUniversityShougangHospital,Beijing(100041);2DepartmentofGastroenterology,PekingUniversityThirdHospital,Beijing

Correspondence to: DING Shigang, Email: dingshigang222@163.com

Background:Helicobacterpylori(Hp) infection plays an important role in the process of development of gastric cancer. Bacterial virulence factor is very important in the causation of various gastric diseases. Aims: To investigate the effect of Hp with thioredoxin-1 (Trx1) expression on growth of human gastric epithelial cell line GES-1. Methods: GES-1 cells and Hp with high or low Trx1 expression were co-cultured with different ratio of cell to Hp (1∶50, 1∶100, 1∶200) for 24 and 48 hours, respectively; cells cultured without Hp were served as blank controls. Morphological change of GES-1 cells was observed by inverted phase contrast microscope, and cell survival rate was assessed by MTT assay. Cell cycle was measured by flow cytometry in GES-1 cells with 1∶100 concentration ratio and blank control groups. Results: The results of inverted phase contrast microscope and MTT assay showed that Hp with high or low Trx1 expression could induce injury of GES-1 cells and decrease cell survival rate in a time- and concentration-dependent manner, especially in high Trx1 expression group. Flow cytometry showed that the percentage of GES-1 cells in S phase in high Trx1 expression group was significantly higher than that in low Trx1 expression group at both 24thand 48thhour. Conclusions: Hp with high or low Trx1 expression can inhibit the growth of GES-1 cells, the pathogenicity is higher for Hp with high Trx1 expression, and is related to the development of gastric cancer.

Key wordsHelicobacter pylori;Thioredoxins;GES-1;Cell Proliferation;Cell Cycle

通信作者#本文，Email: dingshigang222@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.02.007