糞便抗原檢測(cè)臨床診斷幽門(mén)螺桿菌感染的可靠性研究

王佐妤*謝立群劉彩紅趙紅艷

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(300162)

*Email: zuoyuwang@126.com

幽門(mén)螺桿菌(Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病菌，并與胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。我國(guó)屬于Hp感染高發(fā)國(guó)家，流行病學(xué)調(diào)查顯示Hp現(xiàn)癥感染率為42%~64%，平均55%[1]。1987年，Graham等[2]首次報(bào)道了13C-尿素呼氣試驗(yàn)(13C-urea breath test,13C-UBT)這一非侵入性的Hp檢測(cè)方法，其敏感性和特異性均在90%以上，現(xiàn)已成為臨床診斷Hp感染的金標(biāo)準(zhǔn)。然而13C-UBT成本較高且檢查前需禁食并停用抑酸藥至少2周，使其臨床應(yīng)用受到一定限制。近年國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)使用經(jīng)驗(yàn)證的單克隆抗體法檢測(cè)Hp糞便抗原(Hp stool antigen, HpSA)對(duì)診斷Hp感染具有較高的敏感性和特異性，該方法亦為非侵入性，受試者不需口服任何試劑，操作簡(jiǎn)便、安全，價(jià)格低廉，適用于所有年齡和類(lèi)型的患者，但國(guó)內(nèi)因缺乏相應(yīng)試劑而未能推廣應(yīng)用[3-5]。本試驗(yàn)收集340例受試者同時(shí)行13C-UBT和HpSA檢測(cè)，以13C-UBT為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)待評(píng)估的HpSA檢測(cè)試劑盒臨床診斷Hp感染的可靠性。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

研究對(duì)象源自2012年11月至2013年6月武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科的就診人群，根據(jù)知情同意原則，340例因常規(guī)臨床診療或體檢目的而行13C-UBT的受試者納入研究，其中初診329例，復(fù)診11例；男144例，女196例，年齡11~91歲，平均51.86歲。入組者檢查前4周內(nèi)未服用過(guò)H2受體拮抗劑、質(zhì)子泵抑制劑、鉍劑和抗菌藥物。

二、主要試劑和儀器

HpSA檢測(cè)試劑盒(生物素-親合素酶聯(lián)免疫法，北京金豪制藥股份有限公司)；尿素[13C]膠囊呼氣試驗(yàn)藥盒(含尿素[13C]75 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20110130，深圳市中核海得威生物科技有限公司)；ZHP-2001型13C呼氣質(zhì)譜儀(北京中科科儀股份有限公司)。

三、方法

1. 糞便標(biāo)本的收集和保存：少數(shù)受試者于就診當(dāng)天留取糞便標(biāo)本，多數(shù)于第2天或擇期留取后送至醫(yī)院。糞便標(biāo)本運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，如擬于1~3 d內(nèi)檢測(cè)，標(biāo)本置2~8 ℃冷藏保存；如擬于3 d后檢測(cè)，標(biāo)本置-20 ℃冷凍保存。對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)，并記錄受試者相關(guān)信息(就診ID、性別、年齡、臨床診斷、13C-UBT數(shù)據(jù)和結(jié)果等)。腹瀉糞便或過(guò)度浸泡的糞便標(biāo)本視為不合格標(biāo)本，不可用于檢測(cè)。

2. HpSA檢測(cè)：黃豆大小的糞便標(biāo)本以 400 μL稀釋液稀釋?zhuān)x心后取50 μL上清液加入包被Hp單克隆抗體的微孔板，隨后加入50 μL生物素標(biāo)記的Hp單克隆抗體混勻，置于37 ℃溫箱中60 min；清洗后加入100 μL親和素/HRP，置于37 ℃溫箱中30 min；清洗后加入100 μL顯色劑，室溫避光顯色30 min后加入100 μL終止液，測(cè)定A450 nm-A620 nm(或A630 nm)。

質(zhì)控：試劑盒中含陰性、弱陽(yáng)性和中/強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品，每次檢測(cè)時(shí)3個(gè)質(zhì)控品須同時(shí)滿(mǎn)足以下條件，方可確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果有效：①陰性質(zhì)控品A450 nm-A620 nm/630 nm<0.100；②弱陽(yáng)性質(zhì)控品A450 nm-A620 nm/630 nm≥0.105且<1.000；③中/強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品A450 nm-A620 nm/630 nm≥1.000。

結(jié)果判定：通過(guò)比較標(biāo)本檢測(cè)值與cut-off值判定檢測(cè)結(jié)果。Cut-off=2.1×(陰性質(zhì)控品A450 nm-A620 nm/630 nm)，如陰性質(zhì)控品A450 nm-A620 nm/630 nm<0.05 則以0.05計(jì)，此時(shí)cut-off值為0.105。標(biāo)本檢測(cè)值≥cut-off值判定為Hp陽(yáng)性。

3.13C-UBT：參照藥盒說(shuō)明書(shū)，受試者在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下或禁食2 h后行13C-UBT。先采集一袋呼氣樣品，囑受試者以少量飲水送服一粒尿素[13C]膠囊，禁飲食、禁吸煙靜坐30 min后再采集一袋呼氣樣品。應(yīng)用質(zhì)譜法測(cè)定服藥前(0 min)和服藥后(30 min)呼氣樣品中的13C-CO2，結(jié)果以千分差值(δ‰)表示。δ‰=1000×(13C測(cè)定樣品的放射性核素豐度/13C參比樣品的放射性核素豐度-1)。

結(jié)果判定：檢測(cè)值通常以δ‰30 min-δ‰0 min表示，≥4.0±0.4判定為Hp陽(yáng)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件PEMS3.1處理數(shù)據(jù)，以四格表法計(jì)算待評(píng)估的HpSA檢測(cè)試劑盒與金標(biāo)準(zhǔn)13C-UBT的陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率，以一致性檢驗(yàn)(κ檢驗(yàn))分析兩者的一致性，κ>0.75為一致性好，0.75≤κ≤0.4為一致性較好，κ<0.4為一致性差。

結(jié)果

待評(píng)估HpSA檢測(cè)試劑盒與金標(biāo)準(zhǔn)13C-UBT結(jié)果的比對(duì)見(jiàn)表1，待評(píng)估試劑盒診斷Hp感染的陽(yáng)性符合率為96.3%(184/191)，陰性符合率為75.8%(113/149)，總符合率為87.4%(297/340)，κ=0.737 522(95% CI: 0.632 905~0.842 140)，表明待評(píng)估試劑盒與金標(biāo)準(zhǔn)一致性較好，可靠性(可重復(fù)性)較高。

進(jìn)一步在11例初診13C-UBT陽(yáng)性、行Hp根除治療停藥4周后療效觀察者中分析待評(píng)估試劑盒的可靠性，陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率均為100%(表2)。

表1　待評(píng)估試劑盒與13C-UBT檢測(cè)結(jié)果四格表

表211例療效觀察者中待評(píng)估試劑盒與13C-UBT檢測(cè)結(jié)果四格表

待評(píng)估HpSA檢測(cè)試劑盒金標(biāo)準(zhǔn)(13C-UBT)陽(yáng)性陰性合計(jì)陽(yáng)性3(a)0(b)3陰性0(c)8(d)8合計(jì)3811

討論

目前臨床上檢測(cè)Hp感染的方法包括侵入性和非侵入性?xún)深?lèi)，其中侵入性方法系在胃鏡直視下對(duì)可疑組織取活檢，再對(duì)活檢組織作進(jìn)一步的檢測(cè)，可診斷98%以上的Hp感染[6]，但因具有創(chuàng)傷性而不適用于兒童、妊娠期婦女以及不能耐受胃鏡檢查者；非侵入性方法包括血清Hp抗體檢測(cè)、UBT、HpSA檢測(cè)等。血清學(xué)試驗(yàn)是Hp成功培養(yǎng)以后首先開(kāi)發(fā)的非侵入性檢測(cè)方法，但由于Hp感染初期抗體可能尚未產(chǎn)生、Hp根除后抗體仍可持續(xù)存在數(shù)月甚至數(shù)年，該方法對(duì)于確定Hp現(xiàn)癥感染和根除治療后的療效觀察價(jià)值較低，適用于Hp感染的流行病學(xué)調(diào)查，而不適用于臨床診斷[5,7]。Hp定植于胃黏膜上皮細(xì)胞表面，黏膜上皮每1~3 d更新一次，含Hp抗原的Hp代謝產(chǎn)物、死亡菌體崩解產(chǎn)物等隨上皮細(xì)胞脫落，通過(guò)胃腸道隨糞便排出。20世紀(jì)90年代，美國(guó)Meridian公司首次推出了基于多克隆抗體的HpSA檢測(cè)技術(shù)，其后單克隆抗體逐漸取代了多克隆抗體，無(wú)論是對(duì)于未治療者的篩查，還是根除治療后的療效確認(rèn)，單克隆抗體的檢測(cè)性能均可與UBT媲美[8]。采用HpSA檢測(cè)Hp感染，受試者只需留取糞便標(biāo)本而不需口服任何試劑，適用于所有年齡(包括兒童和老人)和所有類(lèi)型(包括孕婦)的患者，且無(wú)任何毒性反應(yīng)。此外，由于檢測(cè)的是Hp抗原，因此可準(zhǔn)確反映Hp現(xiàn)癥感染情況。2012年，歐洲Hp研究組發(fā)布的Maastricht Ⅳ共識(shí)報(bào)告[9]和我國(guó)第四次全國(guó)Hp感染處理共識(shí)報(bào)告[5]均指出HpSA檢測(cè)可用于Hp現(xiàn)癥感染的診斷和根除治療后的療效觀察，因此臨床上可考慮以HpSA檢測(cè)替代UBT。

本研究將13C-UBT作為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)待評(píng)估的HpSA檢測(cè)試劑盒臨床診斷Hp感染的可靠性，結(jié)果顯示與金標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)，待評(píng)估試劑盒的陽(yáng)性符合率為96.3%，陰性符合率為75.8%，總符合率為 87.4%，κ系數(shù)為0.737 522，表明其用于臨床診斷Hp感染具有較高的可靠性；對(duì)于根除治療后療效觀察者，待評(píng)估試劑盒與金標(biāo)準(zhǔn)的總符合率達(dá)100%。分析少數(shù)病例HpSA檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)不符的原因，可能有以下兩點(diǎn)：①糞便標(biāo)本質(zhì)量不高可能是主要影響因素。本試驗(yàn)僅少數(shù)受試者于就診當(dāng)天行13C-UBT后留取糞便標(biāo)本，多數(shù)是在第2天或擇期留取，如受試者未能按醫(yī)師交待的正確方法留取標(biāo)本，可能導(dǎo)致糞便標(biāo)本質(zhì)量較差。此外，運(yùn)輸環(huán)節(jié)也可能對(duì)糞便標(biāo)本的質(zhì)量產(chǎn)生影響，如標(biāo)本留取后未能及時(shí)送至醫(yī)院等。②13C-UBT的檢測(cè)誤差可能是另一個(gè)影響因素。2012年歐洲Maastricht Ⅳ共識(shí)報(bào)告[9]報(bào)道的UBT敏感性為88%~95%，特異性為95%~100%，表明UBT在實(shí)際應(yīng)用中確實(shí)存在檢測(cè)誤差問(wèn)題。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明待評(píng)估的酶聯(lián)免疫法HpSA檢測(cè)試劑盒用于臨床診斷Hp感染，與金標(biāo)準(zhǔn)13C-UBT具有較高的符合率和一致性，結(jié)果可靠，可作為Hp現(xiàn)癥感染診斷和根除治療后的療效觀察指標(biāo)在臨床上推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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(2014-10-16收稿；2014-11-23修回)

背景：我國(guó)屬于幽門(mén)螺桿菌(Hp)感染高發(fā)國(guó)家。在眾多Hp感染檢測(cè)方法中，Hp糞便抗原(HpSA)檢測(cè)具有非侵入性、敏感性和特異性較高、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)。目的：評(píng)價(jià)HpSA檢測(cè)試劑盒臨床診斷Hp感染的可靠性。方法：340例行13C-尿素呼氣試驗(yàn)(13C-UBT)的受試者同時(shí)留取糞便標(biāo)本，以待評(píng)估的酶聯(lián)免疫法HpSA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Hp感染。以13C-UBT為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算待評(píng)估試劑盒診斷Hp感染的陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率和κ系數(shù)。結(jié)果：與13C-UBT結(jié)果比對(duì)，待評(píng)估HpSA檢測(cè)試劑盒診斷Hp感染的陽(yáng)性符合率為96.3%，陰性符合率為75.8%，總符合率為87.4%，κ系數(shù)為0.737 522。結(jié)論：待評(píng)估的HpSA檢測(cè)試劑盒用于臨床診斷Hp感染，與金標(biāo)準(zhǔn)13C-UBT具有較高的符合率和一致性，結(jié)果可靠，可在臨床上推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞幽門(mén)螺桿菌；診斷；糞便抗原檢測(cè)；13C-尿素呼氣試驗(yàn)；結(jié)果可重復(fù)性

Reliability of Stool Antigen Test for Clinical Diagnosis ofHelicobacterpyloriInfectionWANGZuoyu,XIELiqun,LIUCaihong,ZHAOHongyan.DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospitaloftheLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin(300162)

Background:Helicobacterpylori(Hp) infection is prevalent in Chinese population. Various diagnostic methods have been developed for Hp infection, among which Hp stool antigen (HpSA) test attracts more attention for its non-invasiveness, high sensitivity and specificity, convenience and low-cost. Aims: To assess the reliability of a commercial HpSA test kit for clinical diagnosis of Hp infection. Methods: A total of 340 subjects receiving13C-urea breath test (13C-UBT) were asked to have their stool samples tested for HpSA by the commercial enzyme immunoassay kit. Using13C-UBT as gold standard, the positive, negative and overall agreement rates and the kappa statistic of the commercial HpSA test kit for diagnosis of Hp infection were calculated. Results: Compared with the result of13C-UBT, the positive, negative and overall agreement rates of the commercial HpSA test kit for diagnosis of Hp infection were 96.3%, 75.8% and 87.4%, respectively, with the kappa statistic being 0.737 522. Conclusions: A high agreement rate and consistency can be observed between the commercial HpSA test kit and the gold standard13C-UBT for clinical diagnosis of Hp infection. The kit is reliable for being used in clinical practice.

Key wordsHelicobacter pylori;Diagnosis;Stool Antigen Test;13C-Urea Breath Test;Reproducibility of Results

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.02.003