彭麗梅，曹 麗，韓 蕾，錢永強，孫振元*

（1．中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京100091；2．棕櫚園林股份有限公司，上海200433；3．延邊大學農學院，吉林延吉133002）

多年生黑麥草愈傷組織航天搭載后再生株系的抗旱性研究

彭麗梅1，2，曹 麗1，3，韓 蕾1，錢永強1，孫振元1*

（1．中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京100091；2．棕櫚園林股份有限公司，上海200433；3．延邊大學農學院，吉林延吉133002）

利用“神舟七號”飛船搭載多年生黑麥草品種（Derby）的胚性愈傷組織經空間誘變后，從搭載再生株系（SP）群體中獲得了3個抗旱變異株系。自然干旱條件下，對篩選出的3個抗旱變異株系進行了生理生化分析，結果表明，隨自然干旱時間的延長，3個抗旱變異株系均表現(xiàn)出葉片相對含水量和葉綠素含量下降、SOD活性先升后降、丙二醛含量及游離脯氨酸含量上升等特征；不同株系間各指標的變化幅度存在差異，通過上述5項指標綜合評價后初步認為，3個抗旱變異株系的抗旱性順序為SP-64＞SP-119＞SP-17，與表征永久萎蔫系數(shù)反映的結果一致，表明篩選出的抗旱變異株系具有抗旱生理基礎。以上結果說明，空間誘變能誘發(fā)多年生黑麥草抗旱性的變異；獲得的抗旱變異株系為選育抗旱草坪草品種提供了新的種質資源。

多年生黑麥草；空間誘變；胚性愈傷組織；抗旱性

多年生黑麥草（Lolium perenne）是一種重要的冷季型草坪草種，具有早期生長快、分蘗能力強、適應土壤范圍廣等優(yōu)點，廣泛應用于園林綠化草坪和運動場草坪的建植［1-2］。但在我國大多數(shù)地區(qū)夏季干旱缺水，導致多年生黑麥草草坪使用壽命短、草坪質量差［3-4］，因此選育抗旱性強的多年生黑麥草新品種意義重大。

植物空間誘變育種技術是近年來迅速發(fā)展起來的集航天技術、生物技術與農業(yè)育種技術相結合的新興育種技術，可以加速作物新種質資源的創(chuàng)造和優(yōu)良品種的選育［5-6］。近年來，關于空間誘變對草類植物抗旱性的影響已有一些報道，但多集中在牧草上，有關草坪草經空間誘變后抗旱性的變異研究報道較少。1994年蘭州大學用衛(wèi)星搭載了紅豆草（Onobrychis viciaefolia），返地后，對其田間生長情況、發(fā)芽率、耐鹽、耐旱及同工酶等幾個方面作了初步的研究，發(fā)現(xiàn)空間條件對紅豆草的第2代發(fā)芽率沒有明顯影響，但是空間后代卻具有一定的抗鹽性，對PEG水分脅迫也表現(xiàn)一定的抗性［7］。胡向敏［8］利用“實踐八號”衛(wèi)星搭載冰草（Agropyron cristatum）‘蒙農雜種’干種子，發(fā)現(xiàn)空間環(huán)境處理的蒙農雜種冰草抗旱性略有增強的趨勢。王旭等［9］利用衛(wèi)星搭載技術對甘草（Glycyrrhiza uralensis）種子進行太空誘變處理，考察了衛(wèi)星搭載后甘草種子在干旱脅迫條件下，萌發(fā)過程中的發(fā)芽率、胚根長勢、可溶性蛋白變化以及過氧化物酶和過氧化氫酶的活力，結果表明甘草種子的抗旱性增強：在干旱脅迫條件下，飛行組種子的發(fā)芽率、胚根長勢要高于地面對照組，其萌發(fā)過程中的過氧化物酶、過氧化氫酶活力也高于地面對照組。

本研究將來自1粒種子的多年生黑麥草品種（Derby）的胚性愈傷組織進行航天搭載［10］，測定了3個抗旱多年生黑麥草變異株系葉片相對含水量、葉綠素含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及游離脯氨酸含量等生理生化指標的變化，以期為草坪草空間誘變抗旱變異研究提供參考，也為多年生黑麥草抗旱品種的選育提供科學依據。

1 材料與方法

1．1 材料

試驗于2010年7月至2011年3月在中國林業(yè)科學研究院科研溫室內進行。以來自1粒種子的多年生黑麥草品種德比（Derby）的胚性愈傷組織通過“神舟七號”飛船搭載后，經地面組培再生的株系（SP）為試驗材料。通過測定再生株系的表征永久萎蔫系數(shù)（APWI），篩選出3個抗旱多年生黑麥草變異株系：SP-64（APWI：10．39%）、SP-119（APWI：10．77%）、SP-17（APWI：10．86%）。

1．2 方法

1．2．1 抗旱變異株系的篩選 2010年7月將216株SP進行分株繁殖，種植于裝有土壤基質（園土∶河沙＝3∶2）的口徑16 cm、高14 cm的塑料花盆中，每盆中基質量基本一致，放置于溫室自然光照下生長，進行正常養(yǎng)護。

采用表征永久萎蔫系數(shù)法測定植株的抗旱性，標準為：將多年生黑麥草植株葉片85%以上萎蔫且過夜不恢復時記為表征永久萎蔫，此時的土壤含水量計為APWI，APWI越高，抗旱性越弱；反之，則越強［11］。

2010年10月，待各材料蓋度達到85%以上，給各份材料充分澆水至土壤最大持水量后進行自然干旱處理（不澆水）至表征永久萎蔫，每株系設3次重復。每盆隨機選擇4個點，共12個點，用SU-LA型土壤水分測試儀（北京盟創(chuàng)）測出該株系表層土壤5 cm的含水量，12個點的平均值即為該株系的APWI。

1．2．2 抗旱變異株系對自然干旱的生理響應 2010年12月28日將篩選出的3個抗旱多年生黑麥草變異株系（SP-64、SP-119、SP-17）進行分株，每盆分株15株，栽植到直徑16 cm、高14 cm的塑料花盆中，底部有圓孔以排水；栽培基質為沙壤土，放置于溫室中進行正常養(yǎng)護。

2011年2月22日篩選生長健壯而一致的株系，給各份材料充分澆水至土壤最大持水量后進行自然干旱處理（不澆水），分別設0，3，6，9 d干旱處理和第12天的復水處理，每處理設3次重復。分別于第0，3，6，9，12天對處理的株系進行取樣并測定土壤含水量，取樣時間為早晨8：00－9：00。葉片相對含水量（RWC）采用飽和稱重法測定，葉綠素（Chl）含量采用丙酮浸提法測定，SOD活性采用NBT光還原法測定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定，游離脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法測定，均參照《植物生理學實驗指導》［12］進行，各指標測定值以單位干重計。土壤含水量的測定：用SU-LA型土壤水分測試儀測出株系表層土壤5 cm的土壤含水量，每盆隨機選擇3個點，3次重復共9個點，求平均值。

1．3 數(shù)據處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件對自然干旱下抗旱變異株系的各生理指標進行方差分析。

2 結果與分析

2．1 抗旱變異株系的篩選

土壤水分測試儀測得SP的APWI平均值為12．28%，標準差為0．66%，變異范圍為10．39%～14．52%，變異系數(shù)為5．42%；SP的APWI的區(qū)間估計為［10．99%，13．57%］（置信度為95%）。對216個SP的APWI進行方差分析并多重比較，結果顯示SP群體內存在極顯著差異（P＜0．01）。以SP群體APWI區(qū)間下限估計的臨界值作為候選變異株系的篩選標準，從SP中篩選出了3個抗旱變異株系，變異率為1．39%?？购底儺愔晗禐镾P-64（10．39%），SP-119（10．77%），SP-17（10．86%）。

2．2 自然干旱對抗旱變異株系土壤含水量的影響

分別在不同處理時期測定土壤含水量，如圖1所示，隨著自然干旱時間的延長，3個抗旱多年生黑麥草變異株系土壤含水量呈降低趨勢。以干旱處理第0，3，6，9天的平均土壤含水量進行方差分析表明，干旱處理第0，3，6，9天，平均土壤含水量依次為34．42%±0．67%，23．93%±0．45%，16．84%±0．31%，7．93%±0．79%，土壤含水量各梯度間差異極顯著（P＜0．01），說明不澆水后，土壤干旱程度逐漸加劇，對供試的多年生黑麥草材料會產生干旱脅迫，且干旱處理0～3 d土壤水分散失迅速，3～9 d水分散失較慢且速度較穩(wěn)定，但同一取樣時間3個多年生黑麥草株系間土壤含水量差異不顯著（P＞0．05）。

2．3 自然干旱對抗旱變異株系葉片相對含水量的影響

在干旱脅迫下，植物葉片相對含水量的高低在一定程度上可以反映葉片保水能力的強弱，是衡量植物抗旱能力的一個主要指標［13］。由圖2可知，3個抗旱多年生黑麥草變異株系葉片相對含水量隨著自然干旱時間的延長逐漸下降，至自然干旱第6天，達到極顯著水平（P＜0．01），自然干旱第9天，SP-64、SP-119和SP-17葉片相對含水量與第0天相比分別下降了38．11%，57．43%，70．51%，SP-64葉片相對含水量顯著高于SP-119和SP-17（P＜0．05）。表明自然干旱處理下，SP-64葉片保水能力最強，SP-119次之，這與表征永久萎蔫系數(shù)表示的抗旱性一致。復水第3天，3個變異株系葉片相對含水量均恢復到處理前水平，說明在干旱脅迫下，3個抗旱多年生黑麥草變異株系組織或細胞受損較輕，復水后能較快恢復。

2．4 自然干旱對抗旱變異株系葉綠素含量的影響

如圖3A所示，隨自然干旱處理時間的延長，SP-17葉綠素總含量呈下降趨勢，SP-64與SP-119呈“先升后降”的趨勢。自然干旱第9天，與第0天相比較，3個多年生黑麥草株系葉綠素總含量均顯著下降（P＜0．05），下降幅度為SP-17＞SP-119＞SP-64，其葉綠素總含量分別下降了34．50%，17．42%，11．41%。

由圖3B可知，隨自然干旱時間的加長，3個多年生黑麥草株系葉綠素a含量呈“先升后降”的趨勢。處理0～3 d，多年生黑麥草葉綠素a含量增加，增加幅度為SP-64＞SP-119＞SP-17，其葉綠素a含量分別增加了6．04%，3．07%，0．30%，說明適度干旱有利于提高多年生黑麥草葉綠素a含量；處理第9天，各株系葉綠素a含量顯著下降（P＜0．05），與第0天相比，SP-64葉綠素a含量下降幅度最小，SP-119次之，SP-64、SP-119、SP-17分別下降了21．36%，29．32%，49．28%。

從圖3C可以看出，隨著干旱時間的延長，各株系葉綠素a／b值呈“先升后降”的趨勢。自然干旱0～6 d，葉綠素a／b值未出現(xiàn)顯著變化（P＞0．05），至第9天，各株系葉綠素a／b值顯著下降（P＜0．05），其中SP-17下降幅度最大。復水第3天，葉綠素a／b值增大，其中SP-17增幅最大，3個抗旱多年生黑麥草變異株系葉綠素a／b值增至同一水平。

2．5 自然干旱對抗旱變異株系SOD活性的影響

由圖4可看出，隨著自然干旱時間的延長，3個多年生黑麥草株系SOD活性先略上升后下降。自然干旱初期，3個多年生黑麥草株系葉片的SOD活性均有不同程度的提高，3個株系均在處理第3天時SOD活性增至最大。在自然干旱第3～6天，各株系葉片SOD活性均維持在較高水平。隨著自然干旱時間的延長，活性氧積累超過保護酶系統(tǒng)的清除能力，并對抗氧化酶系統(tǒng)造成傷害，導致SOD活性下降，3個抗旱變異株系SOD活性均呈現(xiàn)不斷下降趨勢，至自然干旱第9天各株系SOD活性均顯著下降（P＜0．05），下降幅度最大的是SP-17（43．73%），最小的是SP-64（23．70%），SP-119的下降幅度為34．12%。復水第3天，各株系SOD活性均大幅上升?？傮w來看，在自然干旱下，SP-17葉內SOD活性的變化幅度較其他株系明顯，對于脅迫的敏感程度較強，在一定程度上說明其抗旱性不如其余兩個株系。

2．6 自然干旱對抗旱變異株系MDA含量的影響

隨自然干旱時間的延長，干旱脅迫程度加重，3個多年生黑麥草株系葉片MDA含量均增加，且三者的趨勢相同（圖5）。自然干旱處理第3天，測得SP-64、SP-119和SP-17葉片MDA的上升幅度分別為17．2%，12．9%和29．3%。在處理第6天測得3個株系MDA含量的增加幅度均減緩，至處理第9天，植物受傷害程度繼續(xù)增大，各株系葉片MDA含量顯著增加（P＜0．05），SP-64、SP-119和SP-17葉片MDA含量與第0天相比，上升幅度分別為39．15%，42．48%和68．66%。復水后3個多年生黑麥草株系葉片的MDA含量均明顯降低，均恢復到處理前（第0天）的水平。從MDA含量看，3個多年生黑麥草株系抗旱性為SP-64＞SP-119＞SP-17，與表征永久萎蔫系數(shù)反映的結果一致。

2．7 自然干旱對抗旱變異株系游離脯氨酸含量的影響

干旱脅迫能夠刺激植物體內游離脯氨酸的積累［14-15］。由圖6可看出，隨著自然干旱時間的延長，3個多年生黑麥草株系脯氨酸含量增加，除自然干旱第3天的游離脯氨酸含量與第0天不存在顯著差異（P＞0．05），其他處理時期的游離脯氨酸含量分別與第0天差異顯著（P＜0．05）。自然干旱第6天，3個抗旱變異株系葉片游離脯氨酸含量顯著升高（P＜0．05）；自然干旱第9天各株系的游離脯氨酸含量達到最大值，SP-64、SP-119、SP-17葉片游離脯氨酸含量分別為4．32，6．62和7．13 mg／g。復水第3天各株系葉片游離脯氨酸均有一定的下降，但只有SP-64恢復到處理前水平。從脯氨酸隨干旱脅迫加重的積累和復水后的恢復情況來看，SP-64脯氨酸增加量最小，恢復也快，說明其忍受干旱脅迫的能力強于其余兩個株系，而且復水后能快速恢復到處理前水平。因此SP-64的抗旱性強于其余兩個株系。

3 討論

本文采用表征永久萎蔫系數(shù)作為衡量多年生黑麥草抗旱性的指標，以表征永久萎蔫系數(shù)的95%置信區(qū)間下限為臨界篩選標準，從多年生黑麥草愈傷組織航天搭載后經植株再生獲得的216個株系中篩選出3個具有潛在抗旱能力的變異株系。表征永久萎蔫系數(shù)法是通過測定草坪草的坪用質量為0時的土壤含水量，來評價草坪草的抗旱性：草坪草在表征永久萎蔫時土壤含水量越高，抗旱性越差；反之，則越強［11］。這種方法具有操作簡單、直觀且重現(xiàn)性好，在大規(guī)模草坪草抗旱性鑒定中比較實用。

在干旱脅迫下，抗旱能力較強的植物能維持較高的RWC［16］。本試驗結果表明，在自然干旱處理下，隨著土壤含水量的下降，3個抗旱多年生黑麥草變異株系葉片相對含水量均逐漸下降，初步斷定，SP-64的耐旱時間最長，其次為SP-119，再次為SP-17。

干旱脅迫條件下植物體葉綠素含量的變化，會直接影響光合產量，可以指示植物對干旱脅迫的敏感度［17］。試驗結果表明，隨著自然干旱時間的延長，3個株系葉片葉綠素總量、葉綠素a含量、葉綠素a／b值均先升后降，說明適度干旱有利于提高多年生黑麥草株系的葉綠素含量。自然干旱第9天，3個多年生黑麥草株系葉綠素總含量和葉綠素a含量均顯著下降，下降幅度均為SP-17＞SP-119＞SP-64，說明SP-64的受害最輕。干旱脅迫下葉綠素含量下降的原因可能是脅迫加速了葉綠體的降解和抑制了葉綠素的合成。Fang等［18］和Snatos［19］認為葉綠體降解的主要原因可能是脅迫下葉綠素合成酶活性下降引起的。復水后第3天，多年生黑麥草葉綠素總含量繼續(xù)下降，但下降趨勢減緩，表明干旱9 d后，3個多年生黑麥草株系葉綠體受害嚴重，3 d不足以恢復，而趙玲等［17］在干旱脅迫對草地早熟禾（Poa pratensis）抗旱生理的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，復水后葉綠素含量有一定程度的恢復。復水第3天，除SP-64繼續(xù)下降外，其余兩株系葉綠素a均有一定程度的升高，說明葉綠素a含量的變化對干旱脅迫的響應有一定的滯后現(xiàn)象。

SOD是植物體內清除活性氧的第一道防線，對抵御活性氧自由基的毒害具有重要作用［20］，酶活性越高，清除自由基的能力就越強，植物的抗逆性也越強［13］。本試驗表明，隨著自然干旱時間的延長，3個抗旱多年生黑麥草變異株系SOD活性先升后降，這與孫宗玖等［21］在偃麥草（Elytrigia repens）、周興元等［20］在4種暖季型草坪草上的研究結果一致，說明供試的多年生黑麥草在清除活性氧方面存在一個閾值，在這個閾值之內植物能有效清除自由基的毒害，當超過這個閾值時，保護酶活性下降，植物就會受到傷害。復水第3天，3個株系SOD活性顯著上升，說明3個抗旱變異株系抗氧化酶系統(tǒng)均具有較強的恢復能力。

干旱脅迫下，植物體內活性氧產生和清除的代謝平衡會遭受破壞，植物細胞內大量富集活性氧，引發(fā)膜脂過氧化自由基鏈式反應，導致膜脂過氧化產物（如MDA）增加，膜的完整性與生理功能受到破壞［22］。MDA含量通常作為膜脂過氧化指標，常用來表示細胞膜脂過氧化程度和對逆境反應的強弱：在干旱脅迫過程中，在脅迫強度較輕，脅迫時間較短時，植物體中MDA的含量較低，質膜相對透性增加較少；在脅迫強度較重，脅迫時間較長時，MDA含量增加，質膜透性增加［16］。試驗結果表明，從整個干旱進程來看，3個株系均具有很強的耐旱適應能力。

游離脯氨酸是植物細胞重要的滲透調節(jié)物質之一，干旱脅迫能刺激其在植物體內的積累，但關于其積累的量與抗旱性之間的關系，不同的植物研究有不同的結論。盧少云等［23］的研究認為耐旱性弱的地毯草（Axonopus compressus）中脯氨酸的積累對干旱更敏感，積累的量更大，且脯氨酸的積累與植物受傷害程度呈顯著正相關。任文偉等［24］的研究表明，干旱脅迫下脯氨酸積累具有種間差異，并與抗旱性呈正相關。也有研究認為將游離脯氨酸積累量作為植物抗旱性的度量有一定的局限性，但將其作為某些植物在干旱脅迫下體內發(fā)生反應的一個比較敏感的參數(shù)或指標還是比較合適的［25］。本試驗結果表明，3個多年生黑麥草株系游離脯氨酸含量均隨著自然干旱時間的延長而不斷積累，故對這3個多年生黑麥草株系而言，脯氨酸積累量更宜作為干旱傷害程度的應答指標。

4 結論

根據以上各項試驗結果可知，3個抗旱變異株系在自然干旱處理下，隨干旱時間的延長，3個抗旱變異株系都表現(xiàn)出葉片相對含水量和葉綠素含量下降、SOD活性先升后降、丙二醛含量及游離脯氨酸含量上升等特征；不同株系間各指標的變化幅度存在差異，通過上述5項指標綜合評價后初步認為，3個抗旱變異株系的抗旱性順序為SP-64＞SP-119＞SP-17，與表征永久萎蔫系數(shù)反映的結果一致，表明篩選出的抗旱變異株系具有一定的抗旱生理基礎。

本研究通過空間誘變處理以誘導多年生黑麥草胚性愈傷組織發(fā)生變異，從再生植株中篩選出3個抗旱變異株系，抗旱性生理測定表明篩選出的抗旱變異株系具有抗旱生理基礎，同時發(fā)現(xiàn)游離脯氨酸的積累是多年生黑麥草抵御干旱脅迫的生理適應性反應，可以指示受害的程度。前期的研究工作中我們還發(fā)現(xiàn)空間誘變能誘發(fā)多年生黑麥草的形態(tài)變異，說明空間誘變育種技術是多年生黑麥草種質創(chuàng)新的有效方法。

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Drought resistance analysis of regenerated plants from calli of Lolium perenne carried by the Shenzhou No．7 spaceship

PENG Limei1，2，CAO Li1，3，HAN Lei1，QIAN Yongqiang1，SUN Zhenyuan1*
1.Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Key Laboratory of Forest Cultivation，State Forestry Administration，Beijing 100091，China；2.Palm Landscape Architecture Co.，Ltd.，Shanghai 200433，China；3.College of Agriculture Yanbian University，Yanji 133002，China

Three mutants with high drought tolerance（SP-64，SP-119，SP-17）have been screened from plants regenerated from the embryogenic calli of the Lolium perenne variety Derby，which were carried aboard by the Shenzhou No．7 spaceship．This paper presents the results of an evaluation of the physiological responses to drought treatment for these 3 mutants．As drought duration increased，the relative water content and chlorophyll content of the mutants decreased，whereas malondialdehyde（MDA）and soluble proline content increased．However，the 3 mutants’superoxide dismutase（SOD）activities at first decreased and then increased．The variation ranges of indices were different for each mutation．A comprehensive analysis of these indices suggests that drought tolerance decreased in the order of SP-64，SP-119 and SP-17，which is consistent with the results of the apparent permanent wilting index（APWI）．These results indicate that space mutation could induce the mutagenesis of drought resistance and so provide new germplasm resources for the breeding of turf-grass varieties．

Lolium perenne；space treatment；embryogenic calli；drought resistance

10．11686／cyxb20150109 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

彭麗梅，曹麗，韓蕾，錢永強，孫振元．多年生黑麥草愈傷組織航天搭載后再生株系的抗旱性研究．草業(yè)學報，2015，24（1）：64-71．

Peng L M，Cao L，Han L，Qian Y Q，Sun Z Y．Drought resistance analysis of regenerated plants from calli of Loliumperenne carried by the Shenzhou No．7 spaceship．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：64-71．

2013-11-11；改回日期：2014-06-22

國家“863”計劃項目（2007AA100105，2009AA102109）資助。

彭麗梅（1987-），女，湖南隆回人，研究實習員，碩士。E-mail：penglimeihuagong＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：sunzy＠caf．ac．cn