張偉宏，蔣莉莉，汪曉凱，趙秋民，楊東斌，黃貫峰，張煥云，楊　陽，梁　芳，韓　雷，吳細丕

1)鄭州大學護理學院 鄭州 450001　2) 鶴壁市人民醫(yī)院 鶴壁 458030　3) 鄭州大學學報編輯部 鄭州 450001　4)鄭州大學附屬中心醫(yī)院 鄭州 450052　5)河南省眼科研究所 鄭州 450003

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黃曲霉菌感染小鼠角膜動物模型的建立及組織病理學變化*

張偉宏1，2)，蔣莉莉1)，汪曉凱1)，趙秋民3)，楊東斌2)#，黃貫峰2)，張煥云2)，楊陽2)，梁芳4)，韓雷5)，吳細丕5)

1)鄭州大學護理學院 鄭州 4500012) 鶴壁市人民醫(yī)院 鶴壁 4580303) 鄭州大學學報編輯部 鄭州 4500014)鄭州大學附屬中心醫(yī)院 鄭州 4500525)河南省眼科研究所 鄭州 450003

關(guān)鍵詞角膜炎；黃曲霉菌；小鼠

摘要目的：建立黃曲霉菌感染小鼠角膜動物模型，并觀察病變后不同時期角膜組織病理學變化。方法：用培養(yǎng)接種棒對40只C57BL/6小鼠進行仿真臨床角膜劃痕導致真菌感染。在第1、3、5、7和14天行裂隙燈顯微鏡檢查評分，隨后處死小鼠制作角膜鋪片，免疫熒光染色后進行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果：術(shù)后第1、3和5天，接種眼臨床評分升高迅速，在第5天達到峰值，隨后第7和14天臨床評分逐漸降低；術(shù)后第1天接種眼角膜緣組織已有中性粒細胞浸潤、角膜鞏膜緣血管擴張充血等明顯急性炎癥變化，第3天角膜鞏膜緣出現(xiàn)新生血管芽，中性粒細胞向角膜中央潰瘍灶浸潤、聚集，第5天中性粒細胞浸潤進一步加重，見侵入角膜基質(zhì)層放射狀生長的新生血管，第7天中性粒細胞浸潤仍較嚴重，新生血管向角膜中央潰瘍灶生長明顯，管腔增粗，第14天中性粒細胞明顯減少，新生血管萎縮、減少。結(jié)論：成功建立黃曲霉菌角膜炎小鼠動物模型；感染第5天可能是角膜炎癥過程中的關(guān)鍵時間窗。

AbstractAim: To establish an effective mouse model of simulated clinical corneal fungal infections and observe the pathological changes of corneal tissue lesions after different periods of fungal keratitis.Methods: Forty C57BL/6 mice models were inoculated with a culture stick simulated clinical corneal scratches which caused fungal infections.On the 1st,3rd, 5th,7th and 14th day, infectious corneas were observed and given clinical scoring by slit-lamp biomicroscope，and then the mice were killed to make corneal stretched preparation. After immunofluorescence staining, the corneal tissue were observed with laser scanning confocal microscope. Results: The clinical scoring increased sharply on the 1st,3rd and 5th day after inoculation and peaked on the 5th day, then decreased on the 7th and 14th days. On the 1st day,the eye limbal tissue had neutrophil infiltration,corneal limbal vascular dilatation and congestion and other significant acute inflammatory changes.On the 3rd day,there were limbal corneal neovascularization buds, and neutrophil infiltration to gather corneal ulcer lesions. On the 5th day neutrophil infiltration further aggravated and invasive corneal stroma radial growth of new blood vessels could be seen. On the 7th day neutrophil infiltration was still severe, neovascularization obvious grew to the central cornea ulcer lesions,and luminal enlargement could be found on the 14th day neutropenia decreased significantly, and neovascularization atrophy reduced. Conclusion: An animal model of aspergillus keratitis has been successfully established. The key time window is the 5th day during the inflammation process of fungal keratitis.

角膜外傷尤其是植物性外傷引發(fā)的真菌性角膜炎是一種嚴重致盲性眼病。中國是真菌性角膜炎發(fā)病大國，致病真菌以鐮刀菌和曲霉菌為主[1-2]。近年來，真菌性角膜炎發(fā)病率有逐年升高的趨勢，由于缺少理想的動物模型，導致真菌性角膜炎發(fā)病機制的研究相對滯后。盡管以往研究[3-5]中有通過角膜基質(zhì)注射法、角膜接觸鏡法及免疫抑制法等建立真菌性角膜炎動物模型的報道，但因其不符合真菌性角膜炎的自然發(fā)病過程而制約該病發(fā)病機制的研究。已有研究[6-7]表明：白細胞尤其中性粒細胞作為機體內(nèi)初始免疫活性細胞，能迅速吞噬、消滅入侵的病原微生物。但是中性粒細胞向感染部位的遷徙是一把雙刃劍，過度的浸潤常造成炎癥組織的損傷甚至破壞。因此，該實驗擬模擬臨床角膜外傷建立近似自然真菌感染小鼠角膜動物模型，并對其病變過程及真菌感染后不同時期小鼠角膜中性粒細胞和新生血管等病理學變化進行觀察。

1材料與方法

1.1材料40只體重17~20 g雌性C57BL/6純系小鼠，6～8周齡，健康無眼疾(河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK豫2005-0001)；動物的飼養(yǎng)與使用均按照科研動物使用規(guī)范進行。中國真菌菌種保藏中心提供黃曲霉菌(編號：3.2758)，F(xiàn)ITC標記的Gr-1抗中性粒細胞抗體和PE標記的CD31血管內(nèi)皮細胞抗體(美國Baylor醫(yī)學院李志杰教授惠贈)。

1.2實驗方法

1.2.1真菌菌種制備將標準菌種溶于生理鹽水，轉(zhuǎn)接在新鮮的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面上孵育，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次培養(yǎng)。28 ℃培養(yǎng)3 d后，將已滅菌的接種棒置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面上28 ℃培養(yǎng)3 d。

1.2.2動物模型的制作40只C57BL/6純系小鼠左眼設(shè)為手術(shù)對照，右眼接種黃曲霉菌。妥布霉素點眼，3次/d，持續(xù)3 d后小鼠腹腔內(nèi)注射2 g/L戊巴比妥鈉溶液行全身麻醉(劑量為20 mL/kg)，利多卡因點眼表面麻醉，然后用5 mg/L慶大霉素溶液沖洗右眼結(jié)膜囊，常規(guī)消毒鋪巾，眼科手術(shù)用顯微鏡下，2 mm環(huán)鉆在角膜中央用亞甲藍標記定位后，取已培養(yǎng)好的接種棒在定位的區(qū)域內(nèi)作“*”形劃痕，深度為破壞角膜上皮到達淺基質(zhì)層，結(jié)膜囊內(nèi)涂抹紅霉素眼膏，3-0絲線縫合上下眼瞼。對照眼用已滅菌未培養(yǎng)的接種棒劃痕接種，余同模型眼。術(shù)后妥布霉素點眼，3次/d。造模后隨機分為第1、3、5、7和14天組，每組8只。

1.2.3真菌感染角膜的臨床評分相應(yīng)時間點每組小鼠進行裂隙燈顯微鏡檢查，參照Hiraoka等[8]制定的評分系統(tǒng)對感染眼進行綜合盲評。①角膜潰瘍范圍：病灶直徑<2 mm評為1分，≥2 mm但未累及全角膜評為2分，病灶累及全角膜評為3分。②角膜混濁度：輕度角膜水腫評為1分，角膜水腫大于50%評為2分，全角膜混濁評為3分。③角膜新生血管形成：角膜鞏膜緣少量新生血管形成評為1分，新生血管向角膜中央生長小于50%區(qū)域評為2分，新生血管向角膜中央生長大于50%區(qū)域評為3分。④前房積膿：前房內(nèi)少量灰白色膿性滲出評為1分，前房積膿可看到液平、但未連接角膜病灶部位評為2分，前房積膿連接角膜病灶部位或出現(xiàn)連接角膜病灶的內(nèi)皮斑評為3分。有下列癥狀的加上相應(yīng)的得分：后彈力膜膨出加1分，角膜穿孔加1分，眼前房出血加1分，虹膜炎加1分。感染的嚴重程度以每只眼的總得分作為評估標準。

1.2.4角膜刮片及真菌培養(yǎng)相應(yīng)時間點每組小鼠行角膜刮片，行KOH濕片與Giemsa染色后，光學顯微鏡下觀察；并在小鼠角膜病灶部位鉗取少量組織，采用新鮮的薩氏培養(yǎng)基進行接種。

1.3角膜組織中性粒細胞和新生血管的免疫熒光染色檢測相應(yīng)時間點分別處死每組小鼠，取眼球，在眼球赤道用手術(shù)刀穿透性切取帶角膜緣的眼前節(jié)后，置于新鮮配制的PBS中進行虹膜的剝離；已分離干凈的眼前節(jié)組織置于10 g/L多聚甲醛-PBS溶液中固定30 min后，使用PBS對已固定組織漂洗3次；漂洗干凈的組織在20 g/L BSA-PBS溶液中浸泡15 min，然后用體積分數(shù)2%的Triton X-100-PBS溶液對其透膜15 min；最后將組織置于抗Gr-1單克隆熒光抗體和CD31血管內(nèi)皮細胞熒光抗體液中(均按1200稀釋)，4 ℃冰箱內(nèi)避光孵育過夜后使用PBS漂洗未結(jié)合抗體3次；手術(shù)刀放射狀切開后平鋪于載玻片上，使用膠水固定，蓋玻片壓平，常溫避光過夜[9-10]；將載玻片放入觀察區(qū)域，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察中性粒細胞和新生血管的變化。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應(yīng)用單因素方差分析進行不同時間點接種眼臨床評分結(jié)果的比較，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1裂隙燈顯微鏡下臨床表現(xiàn)及臨床評分小鼠接種眼全部形成真菌性角膜炎。接種后第1天可見角膜水腫混濁，表面粗糙不平，角膜鞏膜緣血管擴張充血。第3天整個角膜呈現(xiàn)灰白色混濁，其中央部位有灰白色菌絲苔覆蓋的浸潤潰瘍病灶，角膜鞏膜緣血管充血減輕，有新生血管出現(xiàn)。第5天真菌感染角膜炎癥達到峰值，角膜中央出現(xiàn)后彈力膜的膨出率為50%，角膜穿孔率為21%；角膜鞏膜緣出現(xiàn)明顯的向心性生長的新生血管以及前房積膿。第7天病灶化膿壞死逐漸減少，潰瘍壞死區(qū)出現(xiàn)肉芽組織，潰瘍病灶逐漸縮小，放射狀向心性生長的新生血管接近病灶區(qū)。第14天角膜中央病灶已經(jīng)瘢痕修復，深入到病灶的新生血管已逐漸退化。病灶周圍角膜組織恢復正常。在上述時間點對接種眼進行臨床評分，造模后第1、3、5天臨床評分升高迅速，在第5天達到峰值(圖1)，然后逐漸降低，評分分別為4.38±1.30、7.13±0.99、10.13±1.36、8.63±1.19和2.38±0.92；不同時間點內(nèi)臨床評分差異有統(tǒng)計學意義(F=58.475，P<0.001)。對照眼第1天角膜組織已基本恢復正常。

圖1　黃曲霉菌感染后小鼠角膜裂隙燈顯微鏡檢查結(jié)果

A：接種后第3天，評分為7分；B：接種后第5天，評分為11分；C：接種后第7天，評分為9分。

2.2角膜刮片檢查和真菌培養(yǎng)情況接種后第1、3、5、7和14天角膜刮片行KOH濕片和Giemsa染色。接種眼KOH濕片顯微鏡下可看到明顯的菌絲及孢子；Giemsa染色鏡下可見明顯菌絲，并且沒有觀察到細菌。真菌培養(yǎng)見相應(yīng)菌屬菌落且鑒定為所接種菌種(圖2)。在第1和3天，KOH濕片、Giemsa染色和真菌培養(yǎng)陽性率未見明顯差異，隨后第5、7、14天各時間點角膜刮片檢查和真菌培養(yǎng)的陽性率逐漸降低(表1)。對照眼未見病原菌感染。

圖2　接種眼角膜刮片檢查和真菌培養(yǎng)結(jié)果

表1　接種眼角膜刮片KOH濕片、

2.3角膜組織中中性粒細胞和新生血管觀察結(jié)果

見圖3。造模后第1天接種眼角膜緣組織已有中性粒細胞浸潤、角膜鞏膜緣血管擴張充血等明顯急性炎癥變化；第3天角膜鞏膜緣出現(xiàn)呈毛刺狀新生血管芽，大量中性粒細胞向角膜中央潰瘍灶浸潤聚集；第5天中性粒細胞浸潤進一步加重，見侵入角膜基質(zhì)層放射狀生長的新生血管；第7天中性粒細胞浸潤仍然較重，新生血管向角膜中央潰瘍灶生長明顯，管腔增粗；第14天中性粒細胞明顯減少，新生血管萎縮、減少。對照眼第1天在角膜鞏膜緣可見少量中性粒細胞散在分布，但未見新生血管的形成。A：接種后第3天，角膜鞏膜緣向心性生長的新生血管以及新生血管周圍呈毛刺狀的新生血管芽(×400)；B：接種后第5天，向角膜中央病灶遷移的大量中性粒細胞以及病灶部位密布尚有輪廓的中性粒細胞(×200)；C：接種后第7天，角膜鞏膜緣向心性生長粗大的新生血管以及從角膜鞏膜緣向角膜中央遷移的大量中性粒細胞(×200)。

圖3　接種眼角膜平鋪片激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

3討論

真菌性角膜病是嚴重致盲性眼病之一。調(diào)查結(jié)果[2]顯示，近年來，該病在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于治療效果較差，致盲及致殘率居高不下[11]。目前，研究者已經(jīng)認識到真菌性角膜炎的發(fā)生主要由外傷(植物性占多數(shù))、角膜手術(shù)、配戴接觸鏡和異物等原因造成角膜上皮組織的損傷和缺損，真菌可通過損傷和缺損部位侵入到角膜內(nèi)生長繁殖，引起角膜組織的壞死以及炎癥反應(yīng)；但由于缺乏重復性及敏感性良好的哺乳動物模型，導致對該病的深入研究比較欠缺，許多基礎(chǔ)研究以及應(yīng)用基礎(chǔ)研究尚屬空白。建立理想的模擬人角膜真菌感染的動物模型已成為眼科基礎(chǔ)及臨床研究亟待解決的首要課題。

目前動物模型制作多采用兔或大鼠，均是非近交系動物；但近交系動物遺傳的均質(zhì)性和反應(yīng)的一致性能使實驗結(jié)果精準可靠，有利于真菌性角膜炎免疫學及分子水平的研究[12]，故該實驗選擇近交系C57BL/6小鼠建立動物模型。作者制作動物模型時用接種棒劃破小鼠角膜上皮組織，仿真臨床患者角膜的真菌感染自然過程，且不需應(yīng)用免疫抑制劑，成功制作小鼠動物模型。用2 mm環(huán)鉆進行角膜中央定位，使病變部位與周圍組織對比明顯，易于觀察；用在真菌中培養(yǎng)的接種棒劃痕模仿人角膜真菌感染的植物性外傷；接種后縫合眼瞼，給接種真菌提供適宜生長的溫度與濕度，且能減少淚液及瞬目對真菌的沖刷，為真菌黏附創(chuàng)建有利環(huán)境，并能避免環(huán)境污染，這些環(huán)節(jié)能有效提高模型的成功率。在角膜真菌感染過程中，角膜局部的免疫功能非常重要，但對機體進行免疫抑制會嚴重影響真菌性角膜炎的病程及炎癥發(fā)展過程。與現(xiàn)有的動物模型相比，該研究制作的動物模型不需要對小鼠應(yīng)用免疫抑制劑，真菌感染從角膜上皮破損面開始，真正仿真臨床上真菌性角膜炎自然感染的過程，并且制作成功率高。模型判定時間點選擇在中期以前進行，鈣熒光白染色、Giemsa染色和真菌培養(yǎng)同時進行。實驗中該模型臨床表現(xiàn)和模型檢測結(jié)果顯示成功率為100%，為研究真菌性角膜炎病變發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定了堅實基礎(chǔ)。該研究結(jié)果顯示了造模后由淺入深發(fā)展的自然病變進程，展現(xiàn)了真菌性角膜炎典型的臨床癥狀，并經(jīng)裂隙燈顯微鏡臨床檢查評分、角膜刮片及真菌培養(yǎng)證實了模型的穩(wěn)定性和可靠性。但接種后縫合小鼠眼瞼與臨床真菌性角膜炎患者感染過程還存在差異，還需在接種方法上進一步改進。

在角膜建立真菌感染的前提是角膜存在上皮層的損傷和缺損，同時伴有真菌孢子或菌絲的種植。針對創(chuàng)傷的反應(yīng)，首先進入感染角膜的炎癥細胞是中性粒細胞[12-13]，它與臨床上最常見的炎癥性疾病發(fā)生與發(fā)展的細胞機制和分子機制關(guān)系密切，其功能和數(shù)量以及生存周期嚴重影響炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。角膜感染或創(chuàng)傷后形成的新生血管可導致視力顯著下降，造成角膜疤痕，改變角膜的局部免疫狀況，是角膜感染或創(chuàng)傷后最常見的特征之一[14-16]。該實驗利用角膜平鋪片技術(shù)在激光掃描共聚焦顯微鏡下，從角膜上皮層開始一直到內(nèi)皮細胞層逐層觀察了接種眼不同時期的中性粒細胞和新生血管變化，清楚地觀察到中性粒細胞作為非常重要的初始免疫細胞向角膜中央潰瘍灶動態(tài)遷移的過程，最終在病灶聚集、死亡；同時也觀察到新生血管在炎癥反應(yīng)中的發(fā)生以及向病灶發(fā)展的過程，這與裂隙燈顯微鏡下相應(yīng)時間點的臨床檢查及臨床評分結(jié)果相符。上述結(jié)果也表明，在黃曲霉菌感染小鼠角膜的炎癥反應(yīng)和角膜組織破壞過程中，第5天是關(guān)鍵的時間窗；在時間窗前募集而來的中性粒細胞對于阻止微生物感染起著極其重要的作用，在時間窗后募集以及先前聚集的中性粒細胞在角膜真菌感染后炎癥病灶的組織破壞中起關(guān)鍵作用。由此說明中性粒細胞向感染部位的遷徙是一把雙刃劍，大量浸潤的中性粒細胞造成角膜炎癥組織的損傷甚至破壞。但病變部位募集的中性粒細胞的作用機制，以及它與真菌感染、組織破壞之間的關(guān)系是研究者需要深入探索的重點。

綜上所述，不需要對宿主進行免疫抑制，用接種棒破壞角膜表面上皮組織，即可成功建立仿真臨床真菌性角膜炎自然感染過程的小鼠模型。

參考文獻

[1]Wang L,Sun S,Jing Y,et al.Spectrum of fungal keratitis in central China[J].Clin Experiment Ophthalmol,2009,37(8):763

[2]穆紅梅,皮百木,李家臣,等.真菌性角膜炎的流行病學、臨床和微生物學特征分析[J].眼科新進展,2013,33(9):879

[3]Abou Shousha M,Santos AR,Oechsler RA,et al.A novel rat contact lens model for Fusarium keratitis[J].Mol Vis,2013,19(12):2596

[4]Zhang H,Wang L,Li Z,et al.A novel murine model of Fusarium solani keratitis utilizing fluorescent labeled fungi[J].Exp Eye Res,2013,110(5):107

[5]Chandra J,Pearlman E,Ghannoum MA.Animal models to investigate fungal biofilm formation[J].Methods Mol Biol,2014,1147:141

[6]Taylor PR,Roy S,Leal SM,et al.Activation of neutrophils by autocrine IL-17A-IL-17RC interactions during fungal infection is regulated by IL-6, IL-23, RORγt and dectin-2[J].Nat Immunol,2014,15(2):143

[7]He S,Zhang H,Liu S,et al.γδ T cells regulate the expression of cytokines but not the manifestation of fungal keratitis[J].Exp Eye Res,2015,135(6):93

[8]Hiraoka T,Kaji Y,Wakabayashi T,et al.Comparison of micafungin and fluconazole for experimental Candida keratitis in rabbits[J].Cornea,2007,26(3):336

[9]Li Z,Burns AR,Rumbaut RE,et al.gamma delta T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion[J].Am J Pathol,2007,171(3):838

[10]Li Z,Burns AR,Smith CW.Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: distinct adhesion molecule requirements[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,47(5):1947

[11]Mimouni M,Tam G,Paitan Y,et al.Safety and efficacy of intrastromal injection of 5% natamycin in experimental fusarium keratitis[J].J Ocul Pharmacol Ther,2014,30(7):543

[12]Sun Y,Chandra J,Mukherjee P,et al.A murine model of contact lens-associated fusarium keratitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(3):1511

[13]Huang W,Ling S,Jia X,et al.Tacrolimus(FK506) suppresses TREM-1 expression at an early but not at a late stage in a murine model of fungal keratitis[J].PLoS One,2014,9(12):e114386

[14]Guo H,Gao J,Wu X.Toll-like receptor 2 siRNA suppresses corneal inflammation and attenuates Aspergillus fumigatus keratitis in rats[J].Immunol Cell Biol,2012,90(3):352

[15]Zeng P,Pi RB,Li P,et al.Fasudil hydrochloride, a potent ROCK inhibitor, inhibits corneal neovascularization after alkali burns in mice[J].Mol Vis,2015,21(6):688

[16]Sijnave D,Van Bergen T,Castermans K,et al.Inhibition of Rho-associated kinase prevents pathological wound healing and neovascularization after corneal trauma[J].Cornea,2015,34(9):1120

*河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程項目4120；河南省醫(yī)學學術(shù)帶頭人出國培訓計劃項目201201053；河南省科技創(chuàng)新杰出人才計劃資助項目104200510007；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程科技領(lǐng)軍人才基金20100304

Establishment of mouse aspergillus keratitis model and changes of mouse corneal histopathology

ZHANGWeihong1，2),JIANGLili1),WANGXiaokai1),ZHAOQiumin3),YANGDongbin2)，HUANGGuanfeng2),ZHANGHuanyun2),YANGYang2),LIANGFang4),HANLei5),WUXipi5)

1)SchoolofNursing，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)ThePeople’sHospitalofHebiCity,Hebi4580303)EditorialBoardofJournalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)TheAffiliatedZhengzhouCentralHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500525)InstituteofOphthalmologyofHenanProvince,Zhengzhou450003

Key wordskeratitis；aspergillus；mouse

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.024

中圖分類號R772.21

通信作者#，男，1974年2月生，博士，在站博士后，研究方向：慢性病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：dongbinyang@126.com