劉秀明，楊文婷，張雪萌，焦重達(dá)，姚 娜，楊美英，官麗莉，李海燕，李校堃

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

紅花查爾酮異構(gòu)酶基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及表達(dá)分析

劉秀明a,b，楊文婷a,b，張雪萌b，焦重達(dá)b，姚 娜a，楊美英b，官麗莉a，李海燕a,b，李校堃a

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

【目的】 克隆紅花(CarthamustinctoriusL.)黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI)基因的全長(zhǎng)序列，研究其組織表達(dá)特異性，為紅花代謝調(diào)控研究提供參考?！痉椒ā?利用RT-PCR技術(shù)克隆CHI基因的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其全長(zhǎng)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其與相似序列的同源性；利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法，分析CHI基因在紅花不同開花時(shí)期的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】CHI基因全長(zhǎng)1 161 bp，開放閱讀框長(zhǎng)654 bp，編碼217個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量約為23.14 ku，等電點(diǎn)為5.67，序列含有典型的加尾信號(hào)序列AATAA和Poly(A)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，該基因與其他物種CHI基因具有較高的同源性，其中與青木香的同源性最高，達(dá)到82%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，CHI基因在紅花花蕾期的表達(dá)量最高。【結(jié)論】 克隆得到了紅花CHI基因，其在紅花花蕾期的表達(dá)量最高。

紅花；查爾酮異構(gòu)酶；cDNA克??；real-time PCR

紅花(CarthamustinctoriusL.)屬菊科，為一年生草本植物。紅花具有活血通經(jīng)，去瘀療傷，宣毒透疹等功效，其主要有效成分為紅花黃色素和紅花紅色素[1]。紅花黃色素為紅花中多種水溶性查爾酮成分的混合物，是黃酮化合物中重要的一類，不但是很有價(jià)值的食用色素，而且具有活血通絡(luò)、消炎鎮(zhèn)痛等功效，在血管性疾病、高血壓、糖尿病并發(fā)癥等方面亦有重要療效[2]。查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI；EC5.5.1.6)是植物黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[3-4]，其在黃酮化合物合成中將查爾酮異構(gòu)化生成槲皮素[5]。因此，超表達(dá)查爾酮異構(gòu)酶基因，可以提高紅花黃酮化合物的含量，為大量生產(chǎn)紅花黃色素提供了可能。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于查爾酮異構(gòu)酶的研究報(bào)道較多，主要集中在葫蘆巴[6]、青木香屬[7]、苜蓿[8]、水稻[9]、柑橘[10]、桑樹[11]、金花茶[12]、水仙[13]、花生[14]等多種作物上，而有關(guān)紅花中查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及表達(dá)分析尚未見報(bào)道。本研究克隆獲得了紅花中的CHI基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為提高紅花中黃酮化合物的含量及紅花代謝調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物 紅花(CarthamustinctoriusL.)“吉紅”早熟品種種子購(gòu)自新疆紅花緣科技有限公司。

1.1.2 試 劑 RNA提取試劑盒(RP3301)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RP6601)購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；克隆所用載體pEASY-T1 Simple Cloning Kit(CT111-01)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；race試劑盒購(gòu)自羅氏公司；熒光定量試劑盒(RR420A)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 紅花花瓣RNA提取及第一鏈cDNA的合成 選取紅花盛花期花瓣，迅速放于液氮中，用錫箔紙包好后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。RNA提取按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，提取的RNA用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)其純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于 -20 ℃冰箱中備用。

1.2.2CHI基因的克隆 根據(jù)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心實(shí)驗(yàn)室紅花花瓣454測(cè)序結(jié)果中挑選的候選基因，設(shè)計(jì)特異性引物，驗(yàn)證CHI基因的中間片段。根據(jù)驗(yàn)證的CHI基因中間片段，以紅花cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全長(zhǎng)基因克隆，所用引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，dNTP Mixture 8 μL，10×LA Buffer 5 μL，Primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，LATaq0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 將擴(kuò)增出全長(zhǎng)片段的CHI基因PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收目的片段，將其連接到pEASY-T1 Simple載體上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，菌液PCR鑒定和酶切鑒定后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)得的序列利用DNAMAN 軟件進(jìn)行核苷酸序列編輯和氨基酸序列推導(dǎo)，在NCBI 網(wǎng)站上通過BLAST 搜索同源性序列，利用clustalW1.83軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用ProtParam 軟件(http://web.expasy.org/)分析編碼蛋白氨基酸序列的組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)[15]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 分別提取紅花花蕾期、初花期、盛花期和衰落期花瓣RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量分析。定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，DNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 3 s，62 ℃退火，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花花瓣總RNA的提取

核酸檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，提取的紅花花瓣RNA質(zhì)量濃度均在1 000 ng/μL左右。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，提取的紅花RNA有28S和18S 2條清晰帶，且28S條帶的亮度約為18S的2倍(圖1)。說(shuō)明RNA提取完整，無(wú)降解，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。

2.2 CHI基因中間片段的獲取及驗(yàn)證

根據(jù)紅花花瓣454測(cè)序結(jié)果拼接比對(duì)，獲得了CHI基因的中間片段序列，通過RT-PCR擴(kuò)增出209 bp的中間片段(圖2A)，經(jīng)過膠回收后連接到克隆載體pEASY-T1 Simple上，進(jìn)一步通過菌液PCR(圖2B)和EcoRⅠ、Hand Ⅲ酶切鑒定(圖2C)，證實(shí)測(cè)序結(jié)果正確。

2.3 CHI基因cDNA克隆及序列分析

根據(jù)CHI基因209 bp的中間片段，以紅花花瓣cDNA為模板，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行3′race和5′race克隆，擴(kuò)增出670 bp的3′端序列和636 bp的5′端序列。將測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN進(jìn)行拼接，得到紅花CHI基因的全長(zhǎng)cDNA片段(圖3)。圖3顯示，CHI基因全長(zhǎng)cDNA長(zhǎng)度為1 161 bp。序列分析表明，該基因的開放閱讀框長(zhǎng)654 bp，編碼217個(gè)氨基酸(圖4)，5′非翻譯區(qū)長(zhǎng)度為250 bp，3′非翻譯區(qū)長(zhǎng)度為257 bp，含有典型的加尾信號(hào)序列AATAA和Poly(A)。該基因所編碼的蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量約為23.14 ku，等電點(diǎn)(pI)為5.67。帶負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)共23個(gè)，總的帶正電荷殘基(Arg+Lys)共20個(gè)。將紅花CHI基因在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)分析，搜索到青木香(Saussureamedusa)、大麗花(Dahliapinnata)、葡萄(Vitislabrusca)等21個(gè)物種的查爾酮異構(gòu)酶基因，利用clustalW1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖5)表明，紅花查爾酮CHI基因與青木香的同源關(guān)系最近，達(dá)到82%，與菊花和飛蓬的親緣關(guān)系也較近，說(shuō)明克隆得到的基因確為紅花CHI基因。

圖3 紅花CHI基因全長(zhǎng)序列的cDNA克隆
A.CHI基因3′端；B.CHI基因5′端；C.CHI基因全長(zhǎng);M.DL2000 Marker;1.3′race；2.5′race；3～5.cDNA ofCHI
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of cDNA ofCHIgene
A.PCR product ofCHIgene 3′ race；B.PCR product ofCHIgene 5′ race；C.PCR product ofCHIgene cDNA;
M.DL2000 Marker;1.3′ race；2.5′race；3-5.cDNA ofCHI

圖4 紅花CHI基因編碼的氨基酸序列
Fig.4 Amino acid sequence ofCHIgene of safflower

2.4 CHI基因在紅花中的表達(dá)特征

采集紅花不同開花時(shí)期的花瓣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以18S作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法分析CHI基因在紅花不同開花時(shí)期的表達(dá)量，結(jié)果見圖6。由圖6可見，紅花CHI基因在花蕾期的表達(dá)量最高；其次為衰落期，幾乎是初花期表達(dá)量的17倍；表達(dá)量最低的是初花期。

3 討 論

CHI基因是黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶[16]，其催化查爾酮異構(gòu)化合成相應(yīng)的黃酮[17]。本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆得到紅花CHI基因的全長(zhǎng)序列，且與其他物種CHI基因有較高的同源性。Park 等[18]研究表明，利用發(fā)根系統(tǒng)使黃芩中CHI基因超表達(dá)可以提高黃酮化合物的含量。Qin等[6]克隆了葫蘆巴CHI基因并在擬南芥突變體中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化擬南芥植株的異黃酮含量比野生型擬南芥有較大提高。Zhang等[19]證實(shí)，CHI基因在黃酮化合物合成過程中具有重要的作用，甘草CHI基因在甘草發(fā)根中過量表達(dá)可明顯提高黃酮含量，這與CHI基因活性與轉(zhuǎn)錄水平的提高直接相關(guān)。Li等[7]的試驗(yàn)證實(shí)，超表達(dá)青木香CHI基因是提高黃酮化合物產(chǎn)量的一個(gè)有效方法。

CHI基因存在組織表達(dá)特異性，不同組織部位表達(dá)不同。銀杏[17]CHI基因主要在葉片中表達(dá)，促進(jìn)黃酮化合物積累合成，這與銀杏CHI基因啟動(dòng)子區(qū)域功能是相關(guān)的。而巨峰葡萄[20]CHI基因在幼葉和幼根中都有表達(dá)，且在根中的表達(dá)受溫度誘導(dǎo)。本研究克隆的CHI基因在紅花花蕾期表達(dá)量最高，表明在花蕾期黃酮化合物的含量可能最高，這為后期研究該基因的超表達(dá)提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

從紅花中克隆得到了CHI基因的中間片段，進(jìn)而獲得其全長(zhǎng)cDNA序列，通過對(duì)基因全長(zhǎng)序列的生物信息學(xué)分析及比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其序列中含有典型的加尾信號(hào)序列AATAA和Poly(A)，且與其他物種的CHI基因具有較高的同源性。Real-time PCR結(jié)果表明，CHI基因在紅花花蕾期的表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因相關(guān)的黃酮化合物可能在花蕾期積累最多。

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Cloning and expression of Chalcone isomerase gene cDNA ofCarthamustinctorius

LIU Xiu-minga,b,YANG Wen-tinga,b,ZHANG Xue-mengb,JIAO Zhong-dab,YAO Naa,YANG Mei-yingb,GUAN Li-lia,LI Hai-yana,b,LI Xiao-kuna

(aMinistryofEducationEngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment, bCollegeofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun，Jilin130118，China)

【Objective】 This study cloned full-length of Chalcone isomerase(CHI)gene in flavonoids biosynthesis fromCarthamustinctoriusand investigated tissue expression specificity to provide reference for the research ofCarthamustinctoriusmetabolic regulation.【Method】 The full-length cDNA ofCHIgene fromCarthamustinctoriuswas cloned using RT-PCR and analyzed using the bioinformatics methods.Phylogenetic tree was constructed for studying homology with similar sequences and the expression at different flowering periods was analyzed by real-time PCR.【Result】 The full-length cDNA ofCHIgene was 1 161 bp with an opening reading frame (ORF) of 654 bp encoding 217 amino acids.The putative protein ofCHIgene had a molecular weight of 23.14 ku and a theoretical pI of 5.67,containing typical AATAA tail signal sequence and Poly(A).Genealogical tree showed thatCHIgene had high homology with other species and the highest value was 82% withSaussureamedusa.Real-time PCR results indicated that relative expression ofCHIgene was highest in bud stage. 【Conclusion】CHIgene was cloned successfully fromCarthamustinctoriusflower,which had highest expression inCarthamustinctoriusbud stage.

Carthamustinctorius;Chalcone isomerase;cDNA cloning;real-time PCR

2014-01-10

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2011AA100606)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101172,31201237)；吉林省科技廳中青年科技領(lǐng)軍人才及優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20111815)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20122223120002)

劉秀明(1981-)，女，吉林松原人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物生物反應(yīng)器研究。E-mail:xiuming1211@163.com

李海燕(1971-)，女，吉林舒蘭人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆與生物反應(yīng)器研究。E-mail：hyli99@163.com

時(shí)間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.020

Q786

A

1671-9387(2015)07-0201-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.020.html