劉彩霞，趙繼學(xué)，尹繼剛

隱孢子蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，主要感染宿主小腸上皮細(xì)胞，可引起人獸共患隱孢子蟲病。該病主要在隱孢子蟲的卵囊階段通過糞-口途徑傳播，飲用受污染的水、食入不干凈的食物或是直接接觸感染的人或動(dòng)物均能導(dǎo)致感染。

隱孢子蟲病的臨床癥狀常為霍亂樣腹瀉，免疫功能正常的宿主表現(xiàn)為腸胃不適、腹瀉、腹痛、體液大量丟失及發(fā)熱等，一般發(fā)病后7～14 d 可自愈。但是對(duì)于免疫功能低下的宿主，尤其是未斷奶的動(dòng)物和營養(yǎng)不良的兒童，此病可能引起持續(xù)性腹瀉，甚至導(dǎo)致死亡。隱孢子蟲病的治療方法有限，目前尚無可用于預(yù)防的疫苗，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升態(tài)勢(shì)，大規(guī)模隱孢子蟲病的暴發(fā)也引起了公眾對(duì)該病的廣泛關(guān)注。本文對(duì)隱孢子蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷以及治療研究進(jìn)展作一綜述。

1 實(shí)驗(yàn)室診斷

及時(shí)準(zhǔn)確的診斷對(duì)于有效管理感染人群，制訂相關(guān)的預(yù)防措施尤為關(guān)鍵。根據(jù)所檢測(cè)樣本的不同，隱孢子蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括直接檢測(cè)蟲體（或抗原/核酸）和間接檢測(cè)蟲體2 個(gè)方面。

1.1 直接檢測(cè)蟲體（或抗原/核酸）

1.1.1 檢測(cè)糞便中的隱孢子蟲卵囊 是最常規(guī)的一種檢測(cè)手段，常用方法有如下幾種。

1.1.1.1 抗酸染色法 該法是最常規(guī)的一種檢測(cè)方法。微小隱孢子蟲卵囊為圓形，大小為4～6 μm，內(nèi)含4 個(gè)子孢子，有一厚壁卵殼。通過抗酸染色很容易辨別。常用的染色方法有改良金胺酚抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法及番紅染色法等。為了提高檢出率，鏡檢之前須要對(duì)糞便樣本進(jìn)行富集，在給出陰性結(jié)論之前至少要檢測(cè)3 份樣本。

抗酸染色法的特異度和靈敏度均低于直接免疫熒光法（direct immunofluorescence assay,DFA）、聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerase chain reaction,PCR）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠檢測(cè)到當(dāng)前感染，而PCR 和ELISA 不能區(qū)分當(dāng)前感染和既往感染。該方法還能檢測(cè)到其他原蟲，如環(huán)孢子蟲和等孢球蟲等。缺點(diǎn)在于對(duì)人員的要求較高，而且需要必要的設(shè)備，如顯微鏡。

1.1.1.2 DFA 即隱孢子蟲卵囊與熒光標(biāo)記的單克隆抗體反應(yīng)后用熒光顯微鏡觀察。該方法與抗酸染色法相比，具有很高的靈敏度和特異度，被很多實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。須要注意的是，糞便樣本在檢測(cè)前須經(jīng)過福爾馬林滅活和濃縮處理。檢測(cè)食物、水和環(huán)境樣本時(shí)，可能會(huì)與藻類發(fā)生交叉反應(yīng)，須要通過相差顯微鏡觀察卵囊內(nèi)容物和子孢子以及通過細(xì)胞核染料來加以確認(rèn)。該方法適用于暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè)。該方法的缺點(diǎn)在于不能區(qū)分感染蟲種和基因型。Reboredo-Fernández 等[1]收集了32 份無脊椎動(dòng)物樣本，用DFA 檢測(cè)到含有卵囊陽性率為12.5%。

1.1.2 檢測(cè)小腸液或腸組織活體組織標(biāo)本中的隱孢子蟲 過去由于抗酸染色法和抗原檢測(cè)方法不成熟而采用該法，現(xiàn)在已不常用。由于腸道寄生蟲感染的不均一性，通常會(huì)遇到假陰性的情況。

1.1.3 檢測(cè)糞便中的隱孢子蟲抗原

1.1.3.1 ELISA 該方法不須要在檢測(cè)前富集樣本，靈敏度高于抗酸染色法，自動(dòng)化程度高，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣本進(jìn)行篩查。而且對(duì)操作人員的技術(shù)要求低。用該方法檢測(cè)，必須設(shè)立對(duì)照。

1.1.3.2 側(cè)流免疫層析法（immunochromatographic lateral flow,ICLF） ICLF 試紙條是由樣品墊結(jié)合物釋放墊、檢測(cè)線、對(duì)照線、硝酸纖維素膜和吸收墊組成。ICLF 是一種快速檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低，操作步驟簡(jiǎn)單，但是與其他免疫學(xué)檢測(cè)方法相比靈敏度較低。Chalmers 等[2]用熒光定量PCR 檢測(cè)259 份糞便樣本，確定了152 份陽性樣本，包括80份人隱孢子蟲（C.homnis）、68 份微小隱孢子蟲（C.parvum）、2 份貓隱孢子蟲（C.felis）、1 份泛在隱孢子蟲（C.ubiquitum）和1 份火雞隱孢子蟲（C.meleagridis）樣本，再用于測(cè)試其他檢測(cè)方法，其中ELISA 的靈敏度為91.4%，DFA 的靈敏度為92.1%，而免疫熒光顯微鏡法的靈敏度為97.4%，ICLF 靈敏度為84.9%。本法適合于對(duì)AIDS 患者、兒童和暴發(fā)流行疫情的檢測(cè)或監(jiān)測(cè)。通常ELISA 和ICLF 檢測(cè)隱孢子蟲時(shí)，也可以同時(shí)檢測(cè)其他相關(guān)病原（如賈第蟲和溶組織內(nèi)阿米巴）[3-4]。

1.1.4 分子生物學(xué)方法

1.1.4.1 PCR 該法若用于檢測(cè)糞便中的卵囊，糞便須儲(chǔ)存于重鉻酸鉀或凍存以檢測(cè)DNA。防腐劑能夠抑制PCR 反應(yīng)，因此必須洗去，但如果防腐劑進(jìn)入卵囊，將影響PCR 檢測(cè)。常用的靶基因有18S 核糖體DNA、卵囊璧蛋白基因和糖蛋白GP60 基因等。其中巢氏PCR 和熒光定量PCR 具有更高的靈敏度。熒光定量PCR 可以對(duì)樣品中的卵囊數(shù)定量，從而確定樣本對(duì)環(huán)境的污染程度[5]。PCR 不僅可以作為檢測(cè)病原體核酸的手段，還可以作為區(qū)分不同蟲種和同一蟲種內(nèi)不同基因型的工具，這在暴發(fā)疫情的傳染源追溯上具有重要意義。由于DNA 穩(wěn)定性好，以DNA 為模板建立的PCR 不能確定樣本中蟲體的活力和感染特性，而以RNA 為模板的反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)。

1.1.4.2 RT-PCR 由于RNA 在蟲體死后很快降解，因此RT-PCR 可以評(píng)價(jià)蟲體的活力和感染性。最常采用的靶基因是熱休克蛋白70 基因，在蟲體受到熱應(yīng)激時(shí)，該基因高效穩(wěn)定表達(dá)，這樣提高了檢測(cè)的靈敏度，還能準(zhǔn)確定量蟲體的活力和感染性。

1.1.4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP） 該技術(shù)的靈敏度高于巢氏PCR。研究顯示在巢氏PCR 檢測(cè)為陰性的樣本中，有約1/3 的樣本為L(zhǎng)AMP 陽性[6]。因此，該方法適用于檢測(cè)健康人或動(dòng)物的低水平感染。

1.2 間接檢測(cè)蟲體

1.2.1 診斷方法 包括ELISA、蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）和多重微珠免疫法（multiplex microbead immunoassay,MIA）等。

1.2.1.1 ELISA 是最常用的方法，其操作簡(jiǎn)便易行，適用于大規(guī)模流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。Lee 等[7]從位于韓國4 個(gè)不同地區(qū)的醫(yī)院采集微小隱孢子蟲病患者血清，制備粗抗原用ELISA 對(duì)隱孢子蟲感染率進(jìn)行了調(diào)查。檢測(cè)的2394 份樣本中，特異性IgG、IgM 和IgA 抗體陽性率分別為34%、26%和56%。

1.2.1.2 Western-blot 是篩查和診斷隱孢子蟲病的有效方法，很多實(shí)驗(yàn)室以該方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。Al-Braikan 和Al-Rabia[8]收集了130 份成年人（18～30 歲）血清樣本，制備15～17 kDa 與27 kDa 隱孢子蟲抗原，用Western-blot 分析隱孢子蟲的感染情況。15 kDa 抗原陽性率為8.5%，27 kDa 抗原陽性率為23.8%，34.6%人血清樣本與2 種抗原都發(fā)生反應(yīng)。Shayan 等[9]收集437 份牛血清樣本，其中犢牛264份，牛173 份，用p23 基因擴(kuò)增后連接pGEX-5X-2載體表達(dá)重組蛋白質(zhì)用于識(shí)別血清抗體，Westernblot 檢測(cè)結(jié)果顯示，2 組樣本感染微小隱孢子蟲血清陽性率分別為33%和37%。以上結(jié)果說明Western-blot 可用于隱孢子蟲病的檢測(cè)。該方法的缺點(diǎn)在于所需抗原和時(shí)間較多，不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

1.2.1.3 MIA 該法是近年來新開發(fā)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有比ELISA 更高的靈敏度（因?yàn)榭乖c微珠結(jié)合更容易被抗體捕獲），具有所需樣本體積小、省時(shí)省力和成本低的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了ELISA 的不足，而且容易準(zhǔn)確定量。Du 等[10]用重組蛋白Cp23、SA35和SA40 與微粒子偶聯(lián)，建立MIA 用于檢測(cè)隱孢子蟲特異性抗體，結(jié)果顯示此方法靈敏度較高，且發(fā)現(xiàn)兒童新近感染率高，而成人的既往感染率高。

1.2.2 診斷抗原 包括天然蟲體抗原和重組抗原。

1.2.2.1 天然蟲體抗原 隱孢子蟲全蟲抗原是血清學(xué)檢測(cè)方法中廣泛應(yīng)用的診斷抗原。Kaushik 等[11]純化隱孢子卵囊，超聲處理后反復(fù)凍融制備全蟲抗原，通過建立ELISA 比較感染隱孢子蟲的HIV 陽性和陰性患者血清中特異性IgG、IgM 和IgA 抗體與微小隱孢子蟲可溶性全蟲抗原的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示，全蟲抗原檢測(cè)特異性抗體IgG 的靈敏度比IgM 和IgA 抗體高，并且證明隱孢子蟲特異性抗體反應(yīng)可能與疾病的癥狀沒有必然聯(lián)系。Jenkins 等[12]用全蟲抗原與重組Cp41 抗原作對(duì)照，檢測(cè)人血清樣本，檢測(cè)結(jié)果一致。由于該抗原制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不同批次之間不容易標(biāo)準(zhǔn)化，近年來多用重組表達(dá)的抗原代替天然蟲體抗原。

1.2.2.2 重組抗原

1.2.2.2.1 CP23 抗原（又稱P23、P27 或27 kDa 抗原） 該抗原是隱孢子蟲最主要的免疫識(shí)別抗原之一。CP23 是一種表面膜蛋白質(zhì)，最初被報(bào)道為一種單獨(dú)的抗原，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它屬于一個(gè)分子量相近的蛋白質(zhì)家族，該家族共包含5 個(gè)分子量為23～27 kDa 的蛋白質(zhì)（包括CP23），這5 個(gè)抗原均能被單克隆抗體C6B6 所識(shí)別，意味著這5 個(gè)蛋白質(zhì)既擁有共同的蛋白質(zhì)骨架也有部分結(jié)構(gòu)的改變[13]。Perryman 等[14]也對(duì)P23 中的一段多肽進(jìn)行了序列分析，并推測(cè)該蛋白質(zhì)分子量約為11.2 kDa（GenBank登錄號(hào)為U34390）。但是，在Western-blot 分析中，該蛋白質(zhì)的條帶出現(xiàn)在23 kDa 位置，因此該蛋白質(zhì)被命名為CP23，分析原因可能是由于該蛋白的糖基化性質(zhì)造成了分子量上的差異。

重組CP23 作為診斷抗原得到了廣泛應(yīng)用。Priest 等[13]用重組的CP23 抗原建立的ELISA 與天然抗原檢測(cè)具有很好的相關(guān)性，證實(shí)該方法可用于流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。Borad 等[15]表達(dá)純化CP23 重組蛋白質(zhì)將其作為抗原，使用ELISA 檢測(cè)孟加拉國5 歲以下感染隱孢子蟲腹瀉兒童血清中IgG、IgA 和IgM抗體，以未感染隱孢子蟲腹瀉組作對(duì)照，結(jié)果顯示試驗(yàn)組血清中3 種抗體水平顯著高于對(duì)照組，并發(fā)現(xiàn)急性腹瀉兒童血清中IgA 和IgM 水平顯著高于遷延性腹瀉病例。該抗原作為診斷抗原的缺點(diǎn)是不能區(qū)分是否近期感染，因?yàn)榧词够颊甙Y狀恢復(fù)后相當(dāng)一段時(shí)間，抗體仍保持高水平。

1.2.2.2.2 CP15/17 抗原 該組抗原為子孢子表膜抗原，大小為15～17 kDa,溶于Triton-X 114。這些抗原與人類感染隱孢子蟲產(chǎn)生的IgG、IgA 和IgM 抗體反應(yīng)，識(shí)別15、17、27 kDa 抗原的單克隆抗體，也可以與隱孢子蟲的表面抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，這些結(jié)果說明在隱孢子蟲的感染階段15、17、27 kDa 抗原是重要的抗體靶標(biāo)[16]。該蛋白質(zhì)通常與27 kDa 抗原共同用于隱孢子蟲病的檢測(cè)。Chalmers 等[17]用15、17、27 kDa 蛋白質(zhì)作為抗原，用Western-blot檢測(cè)人類感染隱孢子蟲陽性血清，每60 d 檢測(cè)1 次。結(jié)果顯示15/17 kDa 抗原復(fù)合物比27 kDa 抗原反應(yīng)強(qiáng)烈，但是181～240 d 后幾乎檢測(cè)不到抗體反應(yīng)；27 kDa 抗原反應(yīng)雖然較弱，但是在感染較長(zhǎng)時(shí)間后仍能檢測(cè)到IgG 抗體反應(yīng)。Priest 等[18]純化了重組抗原rCp27/GST 與rCp17/GST 重組抗原并偶聯(lián)微粒子，用MIA 檢測(cè)了隱孢子蟲與賈第蟲感染率，結(jié)果約40%采集于隱孢子蟲暴發(fā)流行的血清樣品能夠被17 kDa 和27 kDa 抗原所識(shí)別，至少有60%采集于賈第蟲暴發(fā)流行的血清樣品能夠被多種賈第蟲抗原所識(shí)別。

1.2.2.2.3 CP41 抗原 該抗原位于卵囊壁，2005年Kjos 等[19]擴(kuò)增CP41 基因，連接pTrcHis 載體后在大腸埃希菌表達(dá)了多聚組氨酸融合蛋白質(zhì)，與制備的微小隱孢子蟲全蟲抗原同時(shí)用ELISA 檢測(cè)了192名健康成年人血清，結(jié)果全蟲抗原與重組CP41 抗原檢測(cè)IgM 抗體一致率為79%，檢測(cè)IgG 抗體一致率為88%，回歸分析表明二者具有很高的相關(guān)性，表明CP41 重組蛋白質(zhì)可代替蟲體抗原應(yīng)用于隱孢子蟲感染的檢測(cè)。

1.2.2.2.4 SA35 與SA40 蛋白 Tosini 等[20]構(gòu)建了微小隱孢子蟲基因組文庫，用兔抗微小隱孢子蟲血清篩選得到3 個(gè)陽性克隆sa20、sa35 和sa40，其中sa35 和sa40 序列定位于第7 號(hào)染色體，而sa20 序列定位于第6 號(hào)染色體，其中sa40 與GP900 的同源性很高，而GP900 是強(qiáng)免疫原性的蛋白質(zhì)，推斷sa40 與sa35 在宿主體內(nèi)引起IgG 抗體應(yīng)答反應(yīng)。大腸埃希菌表達(dá)重組蛋白質(zhì)，Western-blot 檢測(cè)結(jié)果表明，sa35 和sa40 與兔抗隱孢子蟲血清和感染隱孢子蟲的人血清有特異性反應(yīng)。這些結(jié)果表明，sa35 和sa40 可能成為診斷隱孢子蟲病的檢測(cè)抗原。這2 種抗原能夠被新近感染者的血清所識(shí)別。

1.2.2.2.5 CpP2 Priest 等[21]確定了一個(gè)大小為15～17 kDa 的新蛋白質(zhì)——微小隱孢子蟲60S 酸性核糖體蛋白P2（CpP2），建立了重組蛋白質(zhì)CpP2-ELISA檢測(cè)人血清樣本，與Western-blot 相比，其靈敏度為89%，特異度為92%。

2 治 療

尋求針對(duì)隱孢子蟲病特別是AIDS 患者隱孢子蟲病令人滿意的治療方案，一直是眾多研究的目標(biāo)。過去嘗試采用的治療方案包括：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、氨基糖苷類如巴龍霉素、離子載體類如馬杜拉霉素、利福昔明、奧曲肽以及免疫治療方法[22]。盡管一些藥物被證實(shí)具有一些療效，主要是大環(huán)內(nèi)酯類的螺旋霉素和克拉霉素、氨基糖苷類的巴龍霉素、離子載體類藥物拉沙里菌素和馬杜拉霉素，但研究結(jié)果缺乏一致性，治療效果依賴于機(jī)體免疫功能的恢復(fù)。在不治療的情況下，大多數(shù)免疫功能正常的患者在2 周內(nèi)康復(fù)。對(duì)于免疫缺陷患者，治療的目的在于減輕癥狀和免疫系統(tǒng)重建。治療手段主要包括如下幾個(gè)方面。

2.1 抗蟲化學(xué)藥物治療

2.1.1 硝唑尼特 該藥已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于免疫功能正常的人群，它能夠影響隱孢子蟲的代謝過程。已證實(shí)該藥對(duì)感染隱孢子蟲的兒童腹瀉有效。一項(xiàng)來自贊比亞的研究發(fā)現(xiàn)，用藥前后腹瀉程度和糞便中的卵囊數(shù)差異明顯，但對(duì)其他患者延長(zhǎng)療程是否有效有待證實(shí)[23]。另一項(xiàng)來自埃及的研究發(fā)現(xiàn)，該藥能夠降低1～11 歲兒童的腹瀉程度和卵囊排出量[24]。但對(duì)于AIDS 患者來說，該藥的療效不確切。

2.1.2 常山酮內(nèi)酯 該藥可用于犢牛隱孢子蟲病的預(yù)防，可以減輕癥狀，并降低對(duì)環(huán)境的污染。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該藥可用于治療羔羊的隱孢子蟲病，能夠明顯降低卵囊排出量，減輕癥狀，降低致死率（治療劑量100 μg/kg）[25]。

2.1.3 阿奇霉素 可作為免疫缺陷患者的輔助治療藥物。

2.2 減少腸蠕動(dòng)的藥物 這一類藥物能夠通過降低腸蠕動(dòng)，促進(jìn)小腸吸收從而減輕腹瀉，包括洛哌丁胺及其衍生物。

2.3 電解質(zhì)補(bǔ)充 通過口服和靜脈補(bǔ)充電解質(zhì)溶液（含鈉、鉀和鈣離子等），可以補(bǔ)充體液的大量流失，保持體液的平衡。

2.4 對(duì)AIDS 患者抗病毒治療的協(xié)同作用 對(duì)于AIDS 患者，高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法能夠降低體內(nèi)的病毒載量，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。

2.5 蛋白酶抑制劑 半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶已證實(shí)參與隱孢子蟲卵囊的脫囊過程，與蟲體的侵入相關(guān)[26]。體外模型和小鼠模型已證實(shí)蛋白酶抑制劑可以抑制蟲體的侵入和保護(hù)小鼠抵抗致死劑量蟲體的攻擊[27]，有望成為新型的抗蟲藥物。

3 展 望

目前，對(duì)隱孢子蟲感染的檢測(cè)和診斷面臨挑戰(zhàn)，將不同的診斷方法和不一致的分型技術(shù)應(yīng)用于臨床、獸醫(yī)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等不同的領(lǐng)域，以及對(duì)不同國家和地區(qū)間進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果不具有可比性。標(biāo)準(zhǔn)化的診斷和分型技術(shù)，可以在國家和世界范圍內(nèi)將來自人、動(dòng)物和環(huán)境的數(shù)據(jù)更好地對(duì)接，這將有助于暴發(fā)疫情的傳染源追溯，更好地研究隱孢子蟲的傳播與流行。隨著功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的迅速發(fā)展，相信在不久的將來會(huì)有更多、更有效的藥物應(yīng)用于隱孢子蟲病的臨床治療。

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