Slit3/Robo4信號通路功能研究進(jìn)展*

何藺1任麗蓉2綜述劉濤3王浩宇3審校

(1.川北醫(yī)學(xué)院， 四川 南充 637000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院， 四川 瀘州 646000；3.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院， 四川 南充 637000)

【摘要】Slit是一種高度保守的分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，Robo作為Slit蛋白的單次跨膜受體，二者相互作用共同調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育。Slit3是近年發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)有力的促血管生成因子，與其受體Robo4結(jié)合參與血管新生、器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生、生殖系統(tǒng)和乳腺調(diào)節(jié)及人類干細(xì)胞工程等過程，該文就Slit3/Robo4的最新研究現(xiàn)狀作一綜述。

【關(guān)鍵詞】Slit3； Robo4； 血管新生； 器官發(fā)育

【中圖分類號】R 33

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.048

Abstract【】Slit is a highly conserved secreted extracellular matrix protein, Robo acts as a single transmembrane receptor protein of Slit, they interact each other in the regulation of growth and development of both neuronal and non-neuronal cells. Slit3 is a potent angiogenic growth factor found in recent years, involved in angiogenesis, organ development, tumorigenesis, reproductive system and breast regulation and human stem cell engineering process binding to its Robo4 receptor. The paper will summarize the newest research status of Slit3/ Robo4.

基金項目：四川省科技廳基金項目(2013JY0129)

通訊作者：劉濤，教授，主任醫(yī)師，E-mail：nclt456@sina.com

收稿日期：( 2015-01-30； 編輯： 張翰林)

ProgressinFunctionResearchofSlit3/Robo4SignalingPathwayHELin1, Ren Lirong2reviewingLIUTao3, WANG Haoyu3cheking

(1. North Sichuan Medical College, Nanchong 637000,Sichuan,China;

2. Luzhou Medical College, Luzhou 646000,Sichuan,China;

3. Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan,China)

【Keywords】Sit3;Robo4;Angiogenesis;Organogenesis

Slit蛋白是一種由神經(jīng)系統(tǒng)中線膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)并分泌的一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在脊椎動物中有三種同源的Slit家族蛋白(Slit1-3)；Robo作為Slit蛋白的單次跨膜受體同屬于神經(jīng)細(xì)胞黏附分子[1]。Slit/Robo信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育，其中Slit3/Robo4信號分子參與了機(jī)體多種生命活動過程。

1Slit3蛋白的生物學(xué)特性及其分布

Slit蛋白最早是在1984年由Nfisslein-Volhard等[1]首次從果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種由神經(jīng)系統(tǒng)中線膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)并分泌的一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，被認(rèn)為是一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子。無脊椎動物只有單一的Slit蛋白，而在脊椎動物中有三種同源的Slit家族蛋白(Slit1-3)。Slit3蛋白同Slit1和Slit2蛋白一樣，在結(jié)構(gòu)上都具有高度保守性，包括用于指導(dǎo)蛋白合成的N末端信號肽、4個富含亮氨酸的重復(fù)(LRR)單位D1～D4；9個(在哺乳動物中)或7個(非哺乳動物中)表皮生長因子重復(fù)序列(EGFrepeats)；1個層黏連蛋白-G樣結(jié)構(gòu)域和1個C-末端的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域[2]。有研究表明，Slit可通過自身富含亮氨酸重復(fù)單位與Robo的胞外免疫球蛋白區(qū)域結(jié)合[3]，其第二個富含亮氨酸的重復(fù)單位中還含有一個重要的肝素結(jié)合功能區(qū)，該區(qū)域能提高Slit與Robo相互作用的穩(wěn)定性，且與SlIt的定位密切相關(guān)，是Slit-Robo信號傳導(dǎo)通路的必要組成部分之一[4]。Slit1表達(dá)在神經(jīng)組織及人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞上[5]；Slit2除表達(dá)于神經(jīng)組織外，還表達(dá)于肺、腎、內(nèi)皮細(xì)胞以及多種實體腫瘤[6]；Slit3定位于線粒體，廣泛分布于在腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、舌頭、脾、淋巴結(jié)、膈膜、臍靜脈等組織[7-8]，也表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[9]。

2Robo4蛋白的生物學(xué)特性及其分布

Robo蛋白作為Slit蛋白的單次跨膜受體屬于神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，亦稱Robo受體，哺乳動物有4種Robo受體，即Robo1/DUTT1、Robo2、Robo3/Rig-1和Robo4/Mgc[10]。Robo1-3受體由5個免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)合區(qū)、3個Ⅲ型纖維黏連蛋白功能區(qū)、1個胞內(nèi)片段和1個跨膜片段組成，胞內(nèi)片段為4個保守的模體，即CC0、CC1、CC2和CC3。Robo4與其他3種受體不同的是只有2個Ig樣結(jié)合區(qū)和2個纖維黏連蛋白功能區(qū)，胞內(nèi)無CC1和CC3模體片段，其余組成部分一致[11]，這提示Robo4的生物學(xué)特性不完全相同于Robo1、Robo2和Robo3。Robo1-3均表達(dá)于神經(jīng)元，Robo2-3還可表達(dá)于白細(xì)胞、肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等非神經(jīng)細(xì)胞[12]。Robo4主要表達(dá)于心血管系統(tǒng)，心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管中膜周圍組織、腦血管及肺的支氣管平滑肌細(xì)胞等都已檢測到robo4的表達(dá)，并在心臟、肝腎、骨骼肌和脾中分別表現(xiàn)為高、中、低度的表達(dá)趨勢[13]。

3Slit3/Robo4信號通路的作用

3.1Slit3/Robo4對血管新生的作用血管新生(Angiogenesis)是一個復(fù)雜的血管發(fā)芽過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、基質(zhì)的降解，內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移和分化等，其涉及多種信號機(jī)制的參與，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(BFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子中的Slit/Robo等。近年來對Sit/Robo的研究中，ZhangB等[7]發(fā)現(xiàn)Slit3是一種強(qiáng)有力的促血管生成因子，表達(dá)和分泌于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。Slit分子的同源受體蛋白Robo1和Robo4也廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，提示Slit3可能以旁分泌或自分泌的方式調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在Slit3刺激下，胞內(nèi)Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(RhoGTPases)中的RhoA、Rac1和Cdc42可被激活，其中RhoA和Rac1可快速達(dá)到并維持激活高峰，加入anti-Robo4抗體后Slit3的這種作用將被阻斷，表明Slit3通過與其受體Robo4結(jié)合激活胞內(nèi)RhoGTPases，活化RhoA、Rac1和Cdc42，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白細(xì)胞骨架重排，促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)形成。細(xì)胞功能研究分析顯示Slit3和Robo4結(jié)合后還可發(fā)揮刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自發(fā)性和趨化性的作用。Slit3在體內(nèi)可促進(jìn)新生血管生長，在體外還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管網(wǎng)絡(luò)形成和新生血管出芽，Slit3基因缺陷的小鼠表現(xiàn)出胚胎期血管生成紊亂[7、14]。Jones等[15]研究指出，Robo4可通過抑制病理性視網(wǎng)膜血管的生成和內(nèi)皮細(xì)胞的高滲透性來穩(wěn)定血管網(wǎng)的結(jié)構(gòu)。Robo4與其配體Slit2結(jié)合后抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)-165誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、血管腔形成和血管滲透性，與Slit3結(jié)合后同樣可以發(fā)揮抑制VEGF-165誘導(dǎo)的血管滲漏作用。

3.2Slit3/Robo4與器官發(fā)育Slit3廣泛存在于機(jī)體并與多種器官的生長發(fā)育密切相關(guān)。最新研究報道Slit3是目前在竇角心肌中發(fā)現(xiàn)的唯一slit/robo家族基因，最為廣泛表達(dá)并存在于心肌的流出道和心房肌，也參與腔靜脈的線性排列和靜脈竇的形成[16]。Slit3基因缺陷的小鼠可發(fā)生右心室擴(kuò)張、單側(cè)或雙側(cè)腎和輸尿管發(fā)育障礙以及不同程度的腎功能不全[8]。YuanWL等通過建立小鼠先天性膈疝slit3基因模型[17]，首次確立slit3在膈膜生長發(fā)育中的重要作用，即slit3缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育過程中膈膜中心腱發(fā)育缺陷，從而導(dǎo)致先天性膈疝的形成。ZhangB等[18]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)slit3與robo4結(jié)合促進(jìn)隔膜血管的生成，硫酸乙酰肝素可促進(jìn)和增強(qiáng)這一信號作用；在硫酸乙酰肝素合酶NDST1不足者也會導(dǎo)致隔膜血管發(fā)育的缺失和先天性膈疝的形成。

3.3Slit3/Robo4對生殖系統(tǒng)和乳腺的調(diào)節(jié)妊娠時，Slit3在羊膜和子宮平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)增加，并對促炎性因子IL-1b誘導(dǎo)COX-2表達(dá)和PGE2釋放起到調(diào)節(jié)作用[19]。LiaoWX等在研究Slit/Robo傳導(dǎo)信號在人胎盤的表達(dá)及其對先兆子癇和缺氧的影響時，在胎盤上檢測到slit2、slit3、robo1、robo4相關(guān)的mRNA和蛋白質(zhì)，其中slit3、robo1、robo4信號蛋白位于胎盤絨毛的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞；并發(fā)現(xiàn)缺氧顯著增加絨毛膜癌細(xì)胞slit2相關(guān)的mRNA和蛋白質(zhì)，也顯著增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞slit3、robo1、robo4信號的表達(dá)[20]。滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上Slit/Robo信號蛋白的共表達(dá)表明存在一個自分泌/旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)胎盤的功能。Slit/Robo信號通路參與胎兒卵巢中卵泡的發(fā)育，通過抑制細(xì)胞遷移和促進(jìn)細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育和成年卵巢中發(fā)揮功能性的作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Robo2和Robo4表達(dá)在早期卵泡形成階段增加，并在原始卵泡成熟后保持高水平狀態(tài)[21]。MarlowB等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Robo4缺陷的內(nèi)皮細(xì)胞通過Scr和FAK激酶激活血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)-R2來促進(jìn)血管的生長，而乳腺基質(zhì)源性的Slits蛋白通過內(nèi)皮細(xì)胞上的配體蛋白Robo4下調(diào)VEGF/VEGFR2信號，從而抑制乳腺血管生長。

3.4Slit3/Robo4與腫瘤發(fā)生Slit3/Robo4分子可表達(dá)于腫瘤組織，Slit3存在于腫瘤細(xì)胞系和實體腫瘤，因腫瘤細(xì)胞的遺傳背景不同而對腫瘤細(xì)胞的增殖分化表現(xiàn)出抑制或促進(jìn)效應(yīng)[23]；Robo4特異性定位于腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，是腫瘤微血管的一個特異性標(biāo)志物[24]。Robo4可維持腫瘤微血管的出芽增殖，促進(jìn)形成腫瘤微血管系統(tǒng)[25]，故其正常表達(dá)是腫瘤血管生成正常出芽的必要條件。HongY等研究指出，結(jié)直腸癌組織中的Slit3和miR-218表達(dá)水平都低于正常，并且Slit3的表達(dá)下調(diào)程度和miR-218的相一致，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌病人的預(yù)后[26]。而在甲狀腺癌組織，miR-218-2和其宿主基因Slit3可協(xié)同抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖，減弱體內(nèi)甲狀腺癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生能力[27]。

3.5Slit3/Robo4與人類干細(xì)胞工程在人類干細(xì)胞研究中，Robo4可以把造血干細(xì)胞(HematopoieticStemCell，HSCs)引導(dǎo)到特定的骨髓微環(huán)境(niche)處，改變干細(xì)胞的運(yùn)動能力；而Cxcr4是HSCs定位的一種調(diào)節(jié)因子，可在Robo4-/-的HSCs中表達(dá)上調(diào)以補(bǔ)償Robo4基因產(chǎn)物的缺失；Robo4和Cxcr4共同作用能保持造血干細(xì)胞結(jié)合到骨髓微環(huán)境中,并提出在造血干細(xì)胞移植治療中,可將Robo4作為一個治療靶點[28]。Slits(Slit1-3)mRNA表達(dá)于原始骨髓基質(zhì)以及骨髓源性的內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞系，而人類CD34+造血干祖細(xì)胞(HSPCs)表達(dá)Robos(Robo1-4)mRNA，其中Slit3可迅速降低HL60細(xì)胞和CD34+造血干祖細(xì)胞(HSPCs)中活化RhoA的水平，并直接影響參與肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)和HSPC遷移的途徑[29]。JonathanD.Paul等通過利用功能獨特的人類間充質(zhì)干細(xì)胞(HumanMesenchymalStemCells，MSC)克隆，發(fā)現(xiàn)所謂的外周性間充質(zhì)干細(xì)胞分泌增生性的血管信號分子Slit3，Slit3通過引導(dǎo)Robo4陽性的內(nèi)皮細(xì)胞形成工程組織網(wǎng)絡(luò)從而指導(dǎo)血管發(fā)育[30]。實驗采用三維組織血管網(wǎng)絡(luò)的活細(xì)胞成像，證明了siRNA敲除MSCs中的Slit3分子導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂的群集現(xiàn)象。同時，敲除內(nèi)皮細(xì)胞上的Robo4受體后可抑制體內(nèi)異種植入物的功能性血管生成。大量研究資料表明Slit3表達(dá)的異質(zhì)性可能成為間充質(zhì)干細(xì)胞用于組織修復(fù)在臨床是否成功應(yīng)用的可變因素，體外有效的血管網(wǎng)絡(luò)形成需要Slit3/Robo4信號的參與。

3.6Slit3/Robo4的其他功能作用有研究表明，人類Slit3分子的C端片段(HSCF)是一種新型的肝素結(jié)合蛋白，能阻止抗凝血酶與肝素結(jié)合，并能中和與肝素和低分子量肝素(LMWH)有關(guān)的抗IIa和Xa凝血因子的活性，從而發(fā)揮強(qiáng)效中和肝素抗凝活性的作用；揭示了HSCF可潛在發(fā)展為一個新的解毒劑來治療肝素和低分子肝素在臨床應(yīng)用中的用藥過量[31]。另外，Slit3的刺激可增強(qiáng)體外原始單核細(xì)胞的自發(fā)性和趨化因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞遷移，并可增加體內(nèi)腹膜炎發(fā)生時髓樣細(xì)胞的募集，促進(jìn)機(jī)體的炎癥調(diào)節(jié)反應(yīng)[32]。SchubertT等通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，Slit3對類風(fēng)濕患者體內(nèi)具有侵襲性的滑膜成纖維細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞都有很強(qiáng)的抑制作用[33]。這提示來源于Slit3的肽合成物可能將會成為在病理情況下減弱甚至阻止侵襲性細(xì)胞破壞正常組織的強(qiáng)大治療手段，也將為治療類風(fēng)濕、黑色素細(xì)胞瘤等疾病開啟新的篇章。

4小結(jié)與展望

近年來，Slit3/Robo4信號分子對血管新生、器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生、生殖系統(tǒng)和乳腺調(diào)節(jié)、人類干細(xì)胞工程等多種生命活動的作用研究取得了一定的進(jìn)展，其具體作用機(jī)制及其生物學(xué)功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)。而在心血管研究領(lǐng)域，Slit3/Robo4對血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的研究層次尚處于不同階段。在內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究中，目前已有研究證實Slit3與Robo4結(jié)合可調(diào)控正常和病理狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管新生，提示可以通過干預(yù)Slit3/Robo4這一信號通路來達(dá)到預(yù)防和治療某些與血管新生有關(guān)疾病的目的；而在平滑肌細(xì)胞(SmoothMuscleCells，SMCs)上僅檢測到Slit2、Slit3、Robo1和Robo4信號分子的表達(dá)[34]，Slit3和Robo4對平滑肌細(xì)胞的具體作用機(jī)制是否類似于內(nèi)皮細(xì)胞或還存在其他信號分子的參與，目前尚無確切的實驗研究數(shù)據(jù)，有待進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)。因此，對Slit/Robo信號通路的深入研究，有望在不久的將來對心血管系統(tǒng)及其他系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展提供更多的理論依據(jù)，并為疾病的治療提供更多新的作用靶點，促進(jìn)研發(fā)新生有效藥物。

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