朱晉坤，毛 華，尹揚光，董 文，杜 峰，魯玉明，熊宗華，鄧夢揚

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·論著·

血小板源性生長因子和血小板源性內皮細胞生長因子在內皮細胞和血管平滑肌細胞中的作用研究

朱晉坤，毛 華，尹揚光，董 文，杜 峰，魯玉明，熊宗華，鄧夢揚

目的 通過體外轉染血小板源性生長因子(PDGF)和血小板源性內皮細胞生長因子(PD-ECGF)質粒，觀察兩種生長因子對人臍靜脈內皮細胞EAHY926和主動脈血管平滑肌細胞T/G HA-VSMC的影響，評估兩種生長因子對血管損傷治療的可行性。方法 構建人pcDNA 3.1(+)空載(空載組)、pcDNA 3.1(+)-PDGF-透明質酸(HA) (PPH組) 和pcDNA 3.1(+)-PD-ECGF-HA (PPEH組)質粒，分別轉染入EAHY926和T/G HA-VSMC中，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)檢測內源性PD-ECGF和外源性PD-ECGF對EAHY926和T/G HA-VSMC細胞增殖的影響；細胞傷痕實驗觀察內源性PD-ECGF和外源性PD-ECGF對EAHY926和T/G HA-VSMC細胞遷移速度的影響。結果 MTT法檢測3組EAHY926吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=235.18，P<0.001)，其中PPH組高于空載組和PPEH組(P<0.05)；空載組與PPEH組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。MTT法檢測3組T/G HA-VSMC吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=82.89，P<0.001)，其中PPH組高于空載組(P<0.05)；PPEH組低于空載組(P<0.05)。MTT法檢測轉染PPEH質粒的培養(yǎng)基(L-PPEH)對PPH誘導的EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影響，空載組、PPH組、PPH+L-PPEH組EAHY926吸光度值比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=512.89,P=0.183)。空載組、PPH組、PPH+L-PPEH組T/G HA-VSMC吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=317.40,P<0.001)；其中PPH組高于空載組和PPH+L-PPEH組(P<0.05)。細胞傷痕實驗證實，轉染PPEH質粒的EAHY926、T/G HA-VSMC細胞遷移能力增強；PPEH組EAHY926平均細胞遷移距離百分比(56.1%±2.2%)較空載組(27.8%±3.4%)升高(t=-15.08,P<0.001)；PPEH組T/G HA-VSMC平均細胞遷移距離百分比(69.1%±2.3%)較空載組(43.6%±5.8%)升高(t=-33.64,P<0.001)。用轉染PPEH質粒的培養(yǎng)基培養(yǎng)EAHY926、T/G HA-VSMC發(fā)現(xiàn)，外源性PD-ECGF處理的EAHY926、T/G HA-VSMC細胞遷移能力亦明顯增強。結論 通過轉染PDGF質粒，模擬血管損傷后內皮細胞和平滑肌細胞受到PDGF和/或PD-ECGF刺激，發(fā)現(xiàn) PDGF能明顯上調內皮細胞和血管平滑肌的增殖和遷移。PD-ECGF對血管內皮細胞增殖的效果不明顯，但能上調血管內皮細胞和血管平滑肌的遷移速度；同時PD-ECGF能抑制血管內皮細胞的增殖。兩種因子同時使用能抑制平滑肌細胞的過度增殖，促進內皮細胞和平滑肌細胞的遷移。兩者聯(lián)合使用可能成為促進經皮冠狀動脈介入術(PCI)后損傷血管恢復及預防血管再狹窄的新策略。

血小板源性生長因子；血小板源性內皮細胞生成因子；血管成形術，氣囊，冠狀動脈；肌細胞,平滑??；內皮細胞；細胞增殖

朱晉坤，毛華，尹揚光，等.血小板源性生長因子和血小板源性內皮細胞生長因子在內皮細胞和血管平滑肌細胞中的作用研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(9)：1023-1028.[www.chinagp.net]

Zhu JK,Mao H,Yin YG,et al.Role of PDGF and PD-ECGF in endothelial cells and vascular smooth muscle cells[J].Chinese General Practice，2015，18(9)：1023-1028.

經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)后靶血管存在血栓形成及血管舒縮功能喪失現(xiàn)象，至今仍是臨床應用面臨的重大難題。損傷局部血管再內皮化不良是上述過程發(fā)生的機制之一。在血管損傷時，血管內皮細胞起著血管修復以及新生血管的作用[1-2]。血小板源性生長因子(PDGF)有助于內皮細胞的增殖[3]，但同時PDGF也能加速平滑肌細胞增殖和遷移[4-5]，這就意味著PDGF很可能導致PCI后靶血管再狹窄。而血小板源性內皮細胞生成因子(PD-ECGF)也被稱為胸苷磷酸化酶(TP)，能夠加速損傷局部血管內皮生成和遷移，但與PDGF相反的是，PD-ECGF能抑制局部平滑肌細胞過度增殖[6]。PDGF最初是在血小板細胞中發(fā)現(xiàn)并由血小板分泌用于創(chuàng)傷修復的生長因子，PDGF是創(chuàng)傷愈合過程中較早出現(xiàn)的生長因子之一,在創(chuàng)面愈合的全過程中起重要作用。在正常情況下，PDGF在血管內皮細胞僅有少量表達，在血管內皮受損如缺血、創(chuàng)傷及炎癥等病理條件下，其在血管內皮的表達水平明顯升高。本研究基于PDGF和PD-ECGF的特點，在人臍靜脈血管內皮細胞EAHY926及主動脈血管平滑肌細胞T/G HA-VSMC內表達PDGF，借以模擬血管損傷后內皮細胞和平滑肌細胞受到PDGF和/或PD-ECGF刺激后兩種細胞的增殖遷移變化，旨在研究兩者聯(lián)合用于加速損傷血管重塑、預防PCI后靶血管再狹窄的可行性。

1 材料與方法

1.1 質粒構建 pcDNA 3.1(+)-透明質酸(HA)由第三軍醫(yī)大學公共實驗平臺留存，本載體在多克隆位點后引入了HA標簽(氨基酸序列為：YPYDVPDYA)，可以與目的蛋白融合表達以標記目的蛋白。合成PDGF和PD-ECGF引物。PDGF上游引物:5′-CCGGAATTCATGAATCGCTGCTGGGCGC-3′,下游引物:5′-ACCCAAGCTTGGCTCCAAGGGTCTCCTT-3′；PD-ECGF上游引物:5′-CCGGAATTCATGGCAGCCTTGATGAC-3′，下游引物:5′-ACCCAAGCTTTTGCTGCGGCGGCAGAACG-3′。采用聚合酶鏈式反應(PCR)從cDNA中富集PDGF和PD-ECGF全長。電泳純化后采用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ進行酶切，以表達載體pcDNA 3.1(+)為骨架，重組連接為pcDNA 3.1(+)-PDGF-HA(PPH)和pcDNA 3.1(+)-PD-ECGF-HA(PPEH)質粒。

1.2 細胞培養(yǎng) EAHY926和T/G HA-VSMC購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，由本實驗室凍存。兩種細胞均接種于50 ml細胞培養(yǎng)瓶中，在含10%胎牛血清(USA)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素(hyclone，USA)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中(Life Technology，USA)中，于37 ℃環(huán)境中5%二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng)。

1.3 質粒轉染 按照轉染試劑說明書，將2.5 μg (6孔板)或100 ng(96孔板) pcDNA 3.1(+)空載，PPH或PPEH質粒與10 μl(6孔板)或0.5 μl (96孔板)轉染試劑(lipofectamin 2000，Life Technology)分別稀釋于無血清的240 μl培養(yǎng)基中，5 min后將兩種稀釋液1∶1混合，20 min后加入事先用無血清和抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞中，4～6 h后換成RPMI 1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 免疫印跡法 收集分別轉染了pcDNA 3.1(+)空載(空載組)、PPH(PPH組)或PPEH(PPEH組)質粒72 h后的EAHY926和T/G HA-VSMC的蛋白，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒和分光光度計測定蛋白濃度，并加入上樣緩沖液備用。將總蛋白50 μg于預先配制好的10%或15%聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中進行分離，每個樣本至少用2塊平行膠進行分離。通過“三明治”濕法轉印于預先活化好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜(merck-millipore，USA)上。轉印完成后的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉過夜。一抗孵育2～4 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，15 min/次；二抗孵育1～2 h，PBST洗滌3次，15 min/次，其后顯色觀察。

1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法) 細胞接種在96孔板中，每孔6 000個細胞，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)約24 h后轉染PPH或PPEH質粒；每組4個重復孔；繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后，5 mg/ml MTT溶液加入到各孔中，100 μl/孔，于37 ℃溫育2～4 h，除去MTT后每孔

本研究創(chuàng)新點：

損傷血管再內皮化及重塑是經皮冠狀動脈介入術(PCI)預后的關鍵。既往研究證實血小板源性生長因子(PDGF)只在損傷血管的內皮細胞中高表達，以促進平滑肌細胞和內皮細胞的遷移和增殖，但平滑肌細胞的過度增殖常引起血管的再狹窄，影響PCI效果。同時，有研究表明，正常情況下，血小板源性內皮細胞生長因子(PD-ECGF)可能抑制平滑肌細胞的增殖，但促進平滑肌細胞和內皮細胞的遷移。但對PD-ECGF在血管損傷、PDGF高表達的情況下，是否能拮抗PDGF的促增殖效果，抑制平滑肌細胞增殖，目前為止并沒有明確的報道。本研究提出假設，認為在損傷血管細胞中，高表達PDGF的內皮細胞或平滑肌細胞的增殖和遷移可能受到外源性PD-ECGF的影響，且PD-ECGF和PDGF的聯(lián)合使用在促進血管內皮細胞遷移增殖/加速血管重塑的同時也可抑制平滑肌細胞過度增殖。本研究通過高表達PDGF模擬血管損傷狀態(tài)下的內皮細胞和平滑肌細胞，證實其促進了平滑肌和內皮細胞的遷移和增殖；在此基礎上，發(fā)現(xiàn)PD-ECGF可以抑制PDGF引起的平滑肌細胞增殖，但不影響PDGF引起的內皮細胞增殖，且進一步促進平滑肌細胞及內皮細胞的遷移。研究結果為改善PCI預后、加速損傷血管重塑、防止血管再狹窄提供了潛在的干預靶標。

加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖床上緩慢搖動30 min。在酶標儀中490 nm處讀取吸光度值。

1.6 細胞傷痕實驗 用標記筆在6孔板底部均勻劃上3～4條橫線，將適量EAHY926或T/G HA-VSMC種植于6孔板內〔(1～2)×105個/孔〕，貼壁轉染24 h或未轉染48 h后用藍色無菌1 ml槍尖在6孔板內傷痕；PBS清洗，除去漂浮細胞后，加入低濃度血清培養(yǎng)基(含2% FBS的培養(yǎng)基)。以橫線為參照物，取3個點的平均值，細胞遷移距離百分比=(0 h時細胞平均間距-24 h后細胞平均間距)/0 h時細胞平均間距。

2 結果

2.1 PPH和PPEH對EAHY926增殖的影響 3組EAHY926吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=235.18，P<0.001)；其中PPH組高于空載組和PPEH組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空載組與PPEH組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖1)。

注：PPH=pcDNA 3.1(+)-血小板源性生長因子-透明質酸，PPEH=pcDNA 3.1(+)-血小板源性內皮細胞生長因子-透明質酸；與PPH組比較，*P<0.05

圖1 MTT法檢測3組EAHY926吸光度值

Figure 1 Absorbance values of EAHY926 among three groups detected by MTT method

2.2 PPH和PPEH對T/G HA-VSMC增殖的影響 3組T/G HA-VSMC吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=82.89，P<0.001)；其中PPH組高于空載組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PPEH組低于空載組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2)。

注：與空載組比較，*P<0.05

圖2 MTT法檢測3組T/G HA-VSMC吸光度值

Figure 2 Absorbance values of T/G HA-VSMC among three groups detected by MTT method

2.3 外源性PD-ECGF對EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影響 MTT法檢測轉染PPEH質粒的培養(yǎng)基(L-PPEH)對PPH誘導的EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影響，空載組、PPH組、PPH+L-PPEH組EAHY926吸光度值比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=512.89,P=0.183)。空載組、PPH組、PPH+L-PPEH組T/G HA-VSMC吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=317.40,P<0.001)；其中PPH組高于空載組和PPH+L-PPEH組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)。

2.4 PD-ECGF對EAHY926遷移的影響 細胞傷痕實驗證實，轉染PPEH質粒的EAHY926細胞遷移能力增強(見圖4A)；PPEH組EAHY926平均細胞遷移距離百分比(56.1%±2.2%)較空載組(27.8%±3.4%)升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=-15.08,P<0.001)。

用轉染PPEH質粒的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉染PPH質粒的EAHY926，發(fā)現(xiàn)外源性PD-ECGF轉染PPEH質粒后EAHY926細胞遷移能力亦明顯增強(見圖4B)。

注：A為EAHY926，B為T/G HA-VSMC；與PPH組比較，*P<0.05

圖3 MTT法檢測轉染PPEH質粒的培養(yǎng)基對PPH誘導的EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影響

Figure 3 MTT method detecting the influence of medium transfected with PPEH on the proliferation of EAHY926 and T/G HA-VSMC induced by PPH

圖4 PD-ECGF對EAHY926細胞遷移能力的影響

2.5 PD-ECGF對T/G HA-VSMC遷移的影響 細胞傷痕實驗證實，轉染PPEH質粒的T/G HA-VSMC細胞遷移能力增強(見圖5A)；PPEH組T/G HA-VSMC平均細胞遷移距離百分比(69.1%±2.3%)較空載組(43.6%±5.8%)升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=-33.64,P<0.001)。

用轉染PPEH質粒的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉染PPH質粒的HA-VSMC，發(fā)現(xiàn)T/G HA-VSMC細胞遷移能力亦明顯增強(見圖5B)。

圖5 PD-ECGF對T/G HA-VSMC細胞遷移能力的影響

Figure 5 Influence of PD-ECGF on the migration of T/G HA-VSMC

3 討論

PDGF最初在血清和血小板中發(fā)現(xiàn)，能在體外誘導平滑肌細胞和成纖維細胞的分裂，因此被認為是一種分裂素[7-8]，而且在促進細胞增殖、遷移以及血管外周細胞重建中起著重要作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF能明顯誘導血管內皮細胞和平滑肌細胞的增殖，這與既往研究結果[10]一致。內皮細胞和平滑肌細胞的遷移和增殖是血管受損后的正常生理反應，目的是修復損傷的血管，PDGF在其中起到關鍵作用。但PDGF可以引起平滑肌細胞過度增殖，后者被認為在血管再狹窄過程中扮演重要角色[11]。正常血管內皮細胞幾乎不表達或者很少表達PDGF，而損傷的血管內皮細胞則高表達PDGF。于是本研究通過高表達PDGF來模擬受損的內皮細胞，同時采用由內皮細胞表達的PD-ECGF來培養(yǎng)內皮細胞和血管平滑肌細胞，外源PD-ECGF培養(yǎng)高表達PDGF的內皮細胞和平滑肌細胞，觀察兩種細胞的增殖遷移情況。PD-ECGF能明顯抑制平滑肌細胞增殖，誘導內皮細胞遷移，是理想的抑制平滑肌細胞過度增殖的細胞因子[12-13]。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，在PDGF過表達的環(huán)境中內皮細胞和平滑肌細胞的增殖雖然明顯上調，但PD-ECGF卻能拮抗并抑制平滑肌細胞的增殖，而對PDGF過表達引起的內皮細胞增殖并無明顯抑制。PD-ECGF能誘導內皮細胞增殖[14]，但是在與PDGF合用時卻沒有表現(xiàn)出拮抗作用，引起該結果的原因可能是內皮細胞增殖的速度已經趨于飽和。由上述結果，本研究假設PDGF可增殖血管內皮細胞和平滑肌細胞，而PD-ECGF卻能抑制平滑肌細胞的過度增殖，兩者在血管重鑄的過程中共同作用加速傷口愈合防止血管狹窄。

PD-ECGF/TP是嘧啶核苷合成和分解過程中的一個重要酶,主要分布于血小板、淋巴細胞、網狀細胞核胎盤基質中，其一個重要產物磷酸脫氧核糖(dRP)是血管生成和血管內皮細胞增殖遷移的必須因子。同時，PD-ECGF在體內血管生成中起著重要作用，能趨化內皮細胞，抑制低氧環(huán)境下的細胞凋亡[15]。近年來，PD-ECGF作為血管內皮生長因子在血管重塑和血管生成中受到了廣泛關注。國內外一些實驗室證實，PD-ECGF能誘導腫瘤細胞模型中血管內皮細胞的遷移卻不增強腫瘤的侵襲[16]。而最近關于PD-ECGF與血管平滑肌細胞的文章則認為，PD-ECGF通過激活STAT3來抑制平滑肌細胞的增殖[17]。本研究結果則顯示，PDGF和PD-ECGF均能增強內皮細胞和平滑肌細胞的遷移。內源性PD-ECGF可以明顯促進內皮細胞和平滑肌細胞的遷移；外源性PD-ECGF可以進一步促進PDGF過表達狀態(tài)下內皮細胞和平滑肌細胞的遷移，但卻能抑制過表達PDGF狀態(tài)下平滑肌細胞的增殖。兩者聯(lián)合在加速內皮細胞增殖的同時，在抑制平滑肌細胞過度增殖上起重要作用。兩種生長因子在損傷內皮細胞和平滑肌細胞的定位功能上也可能有相互聯(lián)系，后續(xù)的具體機制還需進一步在體內進行研究或驗證。

總之，本研究提示，利用PDGF對內皮細胞和平滑肌細胞的增殖作用，誘導兩種細胞增殖并遷移至受損處，同時利用PD-ECGF抑制平滑肌細胞過度增殖、趨化內皮細胞的特點，將有助于PCI后損傷血管的修復，降低PCI后血管再狹窄風險，具有潛在的臨床應用價值。

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(本文編輯：陳素芳)

Role of PDGF and PD-ECGF in Endothelial Cells and Vascular Smooth Muscle Cells

ZHUJin-kun,MAOHua,YINYang-guang,etal.

DepartmentofVasculocardiology,theFirstPeople′sHospitalofGuiyang,Guiyang550002,China

Objective To investigate the influence of platelet derived growth factor (PDGF) and platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) on human umbilical endothelial cells EAHY926 and human-aorta vascular smooth muscle cells T/G HA-VSMC by transfecting the plasmids of PDGF and PD-ECGF in vitro and to evaluate the possibility of treating vascular injury by the two kinds of plasmids.Methods pcDNA 3.1(+)no-load (no-load group)，pcDNA 3.1(+)-PDGF-HA (PPH group) and pcDNA 3.1 (+)-PD-ECGF-HA (PPEH group) plasmids were constructed and transfected into EAHY926 and T/G HA-VSMC.MTT method was used to evaluate the influence of endogenous and exogenous PD-ECGF on the proliferation of EAHY926 and T/G HA-VSMC before and after transfection.Cell wound healing assay was used to evaluate the influence of endogenous and exogenous PD-ECGF on the migration speed of EAHY926 and T/G HA-VSMC after transfection.Results MTT method was used to detect the absorbance value of EAHY926 among the three groups,and the differences were statistically significant (F=235.18,P<0.001),with the PPH group significantly higher than the no-load group and PPEH group (P<0.05).The no-load group and PPEH group showed no statistically significant differences (P>0.05).MTT method was also used to detect the absorbance value of T/G HA-VSMC among the three groups,and the differences were statistically significant (F=82.89,P<0.001),with the PPH group significantly higher than the no-load group(P<0.05),and the PPEH group significantly lower than the no-load group(P<0.05).MTT method detecting the influence of medium transfected with PPEH on the proliferation of EAHY926 and T/G HA-VSMC induced by PPH.There was no significant difference in the absorbance value of EAHY926 among no-load group，PPH group and PPH+L-PPEH group(F=512.89,P=0.183).There was significant difference in the absorbance value of T/G HA-VSMC among no-load group,PPH group and PPH+L-PPEH group (F=317.40,P<0.001),with the PPH group significantly higher than the no-load group and PPH+L-PPEH group(P<0.05).Cell wound healing assay demonstrated that EAHY926 and T/G HA-VSMC transfected with PPEH plasmid had a higher migration ability;compared with the no-load group,the average percentage of cell migration distance of EAHY926 in PPEH group was significantly increased〔(56.1%±2.2%) vs.(27.8%±3.4%)〕 (t=-15.08,P<0.001);compared with the no-load group,the average percentage of cell migration distance of T/G HA-VSMC in PPEH group was significantly increased〔(69.1%±2.3%) vs.(43.6%±5.8%)〕(t=-33.64,P<0.001).EAHY926 and T/G HA-VSMC cultured in medium transfected with PPEH showed that the migration ability of EAHY926 and T/G HA-VSMC transfected with PPEH processed by exogenous PD-ECGF also increased significantly.Conclusion After transfection of PDGF plasmid,the stimulation of PDGF and/or PD-ECGF on endothelial cells and smooth muscle cells is simulated.It is found that PDGF can significantly up-regulate the proliferation and migration of endothelial cells and smooth muscle cells.PD-ECGF has limited influence on the proliferation of vascular endothelial cells,but can up-regulate the migration speed of vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells.Meanwhile,PD-ECGF can inhibit the proliferation of vascular endothelial cells.The combined application of the two factors can inhibit over-proliferation of smooth muscle cells and promote migration of endothelial cells and smooth muscle cells.The combination may become a new strategy for the recovery of vascular damage and prevention of vascular restenosis after PCI.

Platelet-derived growth factor；Platelet-derived endothelial cell growth factor；Angioplasty,balloon,coronary；Myocytes,smooth muscle；Endothelial cells；Cell proliferation

貴州省科技廳社會發(fā)展項目(黔科合SY[2010]3087號)

550002貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院心血管內科(朱晉坤，毛華，董文，杜峰，魯玉明，熊宗華)；第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院心血管內科(尹揚光，鄧夢揚)

朱晉坤，550002貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院心血管內科；E-mail：jkz2001@163.com

R 349.51

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.010

2014-07-21；

2015-01-02)