辣椒素對(duì)慢性萎縮性胃炎的作用

周琦張其勝*

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院分院消化內(nèi)科(200081)

背景：慢性萎縮性胃炎是一種常見的胃炎類型，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，但目前藥物治療的效果不確切。目的：探討辣椒素對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎的治療作用。方法：采用脫氧膽酸鈉+乙醇+氨水灌胃的方法建立慢性萎縮性胃炎大鼠模型，將44只存活的模型大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量辣椒素干預(yù)組、中劑量辣椒素干預(yù)組、高劑量辣椒素干預(yù)組，后3組大鼠分別灌胃1 mg·kg-1·d-1、10 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1辣椒素，共持續(xù)28 d。采用HE染色評(píng)估胃黏膜慢性炎癥反應(yīng)和萎縮程度，ELISA法檢測(cè)胃組織胃蛋白酶原(PG)Ⅰ、PGⅡ水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胃黏膜組織IKKβ、NF-κB、XIAP蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組、低劑量、中劑量、高劑量辣椒素干預(yù)組之間的胃黏膜慢性炎癥反應(yīng)、萎縮程度、PGⅠ、PGⅡ水平、胃黏膜IKKβ、NF-κB、XIAP蛋白表達(dá)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著辣椒素干預(yù)劑量的增加，慢性炎癥和胃黏膜萎縮程度逐漸好轉(zhuǎn)(P<0.05)，IKKβ、NF-κB、XIAP蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)。結(jié)論：辣椒素對(duì)慢性萎縮性胃炎具有較好的療效。

關(guān)鍵詞辣椒素；慢性萎縮性胃炎；治療

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis)是一種常見的慢性胃炎類型，以胃黏膜萎縮變薄、固有腺體減少或消失為主要特征，可伴有腸上皮化生等表現(xiàn)，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。辣椒是人們經(jīng)常食用的一種食品，同時(shí)也是一種藥材。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為胃病患者不宜食用辛辣食物，但目前有研究發(fā)現(xiàn)辣椒素可能對(duì)胃黏膜具有保護(hù)作用，且對(duì)胃液分泌過程產(chǎn)生一定影響[1-2]。本研究通過對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠模型給予不同劑量辣椒素干預(yù)，分別從病理學(xué)結(jié)果、胃蛋白酶原(pepsinogen, PG)水平、NF-κB系統(tǒng)的炎癥因子表達(dá)等不同方面來評(píng)估辣椒素對(duì)慢性萎縮性胃炎的作用，以期為辣椒素治療慢性萎縮性胃炎提供依據(jù)，以便今后能運(yùn)用于臨床實(shí)踐中。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只Sprague-Dawley(SD)雄性成年大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量200 g左右，大鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，許可證號(hào)SYXK(滬)2007-0003。

二、藥物和主要試劑

辣椒素、脫氧膽酸鈉(碧云天生物技術(shù)公司)；PGⅠ、PGⅡ ELISA試劑盒(嘉興行健生物科技有限公司)。IκB激酶β(IKKβ)抗體、NF-κB抗體、X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)抗體(Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(Jackson公司)。

三、方法

1. 慢性萎縮性胃炎模型制作：每天給予每只大鼠空腹灌胃2 mL 50 ℃脫氧膽酸鈉(20 mmol/L)，每周兩天再給予大鼠空腹灌胃2 mL 60%乙醇，上述灌胃1 h后給予大鼠飼料和日常飲用水，日常飲用水為0.05%的氨水。造模第3個(gè)月時(shí)，隨機(jī)剖殺3只大鼠，觀察模型復(fù)制情況，當(dāng)時(shí)已可見胃黏膜層變薄，肌層增寬，胃小凹變淺，腺體變小、排列紊亂、數(shù)量減少等慢性萎縮性胃炎的表現(xiàn)。其余大鼠繼續(xù)造模3個(gè)月，造模時(shí)間共持續(xù)6個(gè)月。整個(gè)造模實(shí)驗(yàn)過程中，另有3只大鼠死亡，最后存活44只大鼠，行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 動(dòng)物分組：將44只慢性萎縮性胃炎大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組和低、中、高劑量辣椒素干預(yù)組。辣椒素溶液配制方法：取95%的辣椒素1.052 6 g(即含辣椒素1 g)溶于100 mL 0.9% NaCl溶液中，得到10 mg/mL辣椒素溶液，然后用0.9% NaCl溶液按不同比例稀釋得到本實(shí)驗(yàn)所采用的低、中、高劑量辣椒素溶液，濃度分別為1 mg/kg(10 mL/kg)、10 mg/kg(10 mL/kg)、30 mg/kg(10 mL/kg)，每天給予大鼠灌胃，持續(xù)28 d。

3. 標(biāo)本采集和處理：取材前大鼠禁食24 h，不限制飲水。乙醚麻醉動(dòng)物，迅速剖腹，結(jié)扎賁門、幽門，摘出全胃，洗去表面血污，濾紙吸干，沿胃大彎剪開胃腔，用蒸餾水沖洗胃腔，平行胃小彎取部分胃體胃壁。4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)5 μm切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并用測(cè)微尺作形態(tài)計(jì)量。取部分胃體組織行PGⅠ、PGⅡ、 IKKβ、NF-κB、XIAP的檢測(cè)。

4. 病理學(xué)檢查標(biāo)準(zhǔn)：參照2012年的“中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見”[3]，分別從慢性炎癥和萎縮程度兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。慢性炎癥根據(jù)黏膜層慢性炎性細(xì)胞的密集程度和浸潤(rùn)深度分為正常、輕、中、重度。正常：每高倍視野下單個(gè)核細(xì)胞不超過5個(gè)，如數(shù)量略超過正常而內(nèi)鏡下胃黏膜無明顯異常，可診斷為基本正常；輕度：慢性炎性細(xì)胞較少并局限于黏膜淺層，不超過黏膜層的1/3；中度：慢性炎性細(xì)胞較密集，不超過黏膜層的2/3；重度：慢性炎性細(xì)胞密集，占據(jù)黏膜全層。胃黏膜萎縮程度根據(jù)固有腺體的減少程度分為正常、輕、中、重度。正常：固有腺體數(shù)無減少；輕度：固有腺體數(shù)減少小于原有腺體數(shù)的1/3；中度：固有腺體數(shù)減少介于原有腺體數(shù)的1/3~2/3；重度：固有腺體數(shù)減少大于原有腺體數(shù)的2/3。

5. ELISA法檢測(cè)大鼠胃黏膜PGⅠ、PGⅡ水平：將100 mg胃體組織磨碎，采用ELISA法檢測(cè)胃黏膜PGⅠ、PGⅡ水平，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

6. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠胃黏膜IKKβ、NF-κB、XIAP的表達(dá)：取胃黏膜組織，加入蛋白裂解液裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度，并用蛋白上樣緩沖液稀釋至1.5 μg/μL，100 ℃加熱處理10 min，移至常溫冷卻，12 000×g離心10 min去除不溶性沉淀。行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗(IKKβ抗體1∶1 000稀釋，NF-κB抗體1∶1 000稀釋， XIAP抗體1∶1 000稀釋，β-actin 1∶5 000稀釋)4 ℃過夜。PBST洗滌3次, 分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)、羊抗鼠二抗(1∶20 000稀釋)，室溫孵育60 min，PBST洗滌3次。ECL顯色，暗室壓片、顯影、定影。采用Odyssey Infrared Imaging System進(jìn)行掃描，Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析處理。以β-actin作為內(nèi)參照，目的蛋白的條帶灰度值均以β-actin為基準(zhǔn)進(jìn)行校正。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、病理學(xué)結(jié)果

四組大鼠胃黏膜慢性炎癥和萎縮程度相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.43，P=0.000；χ2=18.75，P=0.000)。隨著辣椒素干預(yù)劑量的增加，胃黏膜慢性炎癥和萎縮程度明顯下降(χ2=16.72，P=0.000；χ2=13.76，P=0.000)(圖1、表1)。

二、大鼠胃黏膜PGⅠ、PGⅡ水平

不同劑量辣椒素干預(yù)組、模型組之間大鼠胃黏膜PGⅠ、PGⅡ水平相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=550.75，P=0.000；F=87.584，P=0.000)，且不同劑量辣椒素干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=324.496，P=0.000；F=23.493，P=0.000)(表2)。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胃黏膜組織IKKβ、NF-κB、XIAP表達(dá)水平

四組大鼠胃黏膜組織IKKβ、NF-κB、XIAP表達(dá)水平相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.40，P=0.000；F=154.72，P=0.000；F=228.95，P=0.000)，而隨著辣椒素干預(yù)劑量的增加，IKKβ、NF-κB、XIAP表達(dá)水平呈下降的趨勢(shì)(圖2)。高劑量辣椒素干預(yù)組IKKβ、NF-κB、XIAP表達(dá)水平均顯著低于低、中劑量辣椒素干預(yù)組(P<0.05)，而后兩組之間無明顯差異(P>0.05)。

表2　各組大鼠胃黏膜組織磨碎液PGⅠ、PGⅡ水平

A：模型組；B：低劑量辣椒素干預(yù)組；C：中劑量辣椒素干預(yù)組；D：高劑量辣椒素干預(yù)組

組 別例數(shù)炎癥程度無輕度中度重度萎縮程度無輕度中度重度模型組1102(18.2)5(45.5)4(36.4)005(45.5)6(54.5)低劑量辣椒素干預(yù)組1102(18.2)5(45.5)4(36.4)01(9.1)5(45.5)5(45.5)中劑量辣椒素干預(yù)組1105(45.5)5(45.5)1(9.1)02(18.2)7(63.6)2(18.2)高劑量辣椒素干預(yù)組115(45.5)6(54.5)005(45.5)3(27.3)3(27.3)0

圖2　各組大鼠胃黏膜組織IKKβ、NF-κB、XIAP蛋白表達(dá)水平(蛋白質(zhì)印跡法)

討論

慢性萎縮性胃炎以胃黏膜萎縮變薄、固有腺體減少或消失為主要特征，常伴有腸上皮化生、腺上皮異型增生等表現(xiàn)，為胃癌最主要的癌前病變。故對(duì)慢性萎縮性胃炎的防治顯得尤為重要。

辣椒中最主要的有效成分為辣椒素，目前已發(fā)現(xiàn)辣椒素進(jìn)入人體后，通過選擇性刺激初級(jí)傳入辣椒 素敏感傳入神經(jīng)元(capsaicin-sensitive afferent neurons, CSAN)和細(xì)胞膜上的香草酸受體亞型1(vanilloid receptor subtype 1, VR1)而產(chǎn)生作用。消化道中分布有豐富的CSAN和VR1。與“辣椒傷胃”這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)相悖，有研究表明辣椒素可對(duì)胃黏膜起保護(hù)作用，其機(jī)制可能是辣椒素與VR1結(jié)合，激活與受體直接偶聯(lián)的膜離子通道，引起神經(jīng)元及其纖維和上皮細(xì)胞釋放內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，如P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、神經(jīng)激肽A和興奮性氨基酸等，其中CGRP具有最有效的血管活性作用和胃保護(hù)作用[1-2]。但辣椒素的藥理作用特殊，不同劑量辣椒素對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的效果大不相同。小劑量辣椒素對(duì)CSAN有強(qiáng)烈的刺激作用，大劑量可引起神經(jīng)遞質(zhì)的過量釋放，導(dǎo)致CSAN受到損害，失去信息傳入功能，此為選擇性神經(jīng)毒性損害，可引起傳入神經(jīng)纖維變性、壞死，甚至不可逆性神經(jīng)元細(xì)胞破壞，稱為辣椒素的化學(xué)“去神經(jīng)”作用。有研究指出，辣椒素1~10 mg/kg可對(duì)大鼠產(chǎn)生刺激作用[4]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為辣椒素劑量≥50 mg/kg即可引起大鼠的化學(xué)“去神經(jīng)”作用[5]。故目前認(rèn)為中小劑量辣椒素對(duì)胃黏膜才是有益的。本研究選取中小劑量辣椒素(1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg)對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠模型進(jìn)行干預(yù)。因胃黏膜萎縮呈多灶性，一般先發(fā)生于胃竇，再至胃體，而胃體胃黏膜萎縮的改善優(yōu)先于胃竇，故本研究選取胃體黏膜為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，對(duì)觀察胃黏膜萎縮的改善情況更為有利。結(jié)果顯示隨著辣椒素干預(yù)劑量的增加，大鼠胃黏膜慢性炎癥反應(yīng)和萎縮情況均逐漸好轉(zhuǎn)，提示辣椒素對(duì)慢性萎縮性胃炎可能有治療作用。

PG是胃液中胃蛋白酶的一種非活性前體，分為PGⅠ和PGⅡ，PGⅠ主要由胃底腺主細(xì)胞分泌，而PGⅡ主要由胃底腺、賁門腺、幽門腺和十二指腸Brunner’s腺分泌。目前發(fā)現(xiàn)胃黏膜發(fā)生病變時(shí)，PG水平隨之發(fā)生變化。已有部分國(guó)家采用聯(lián)合檢測(cè)血清PGⅠ、PGⅡ水平，作為篩查慢性萎縮性胃炎的手段，被稱為胃底腺黏膜的血清學(xué)活檢[6-7]。發(fā)生慢性萎縮性胃炎時(shí)，胃底腺數(shù)量減少，常伴有腸上皮化生，導(dǎo)致PGⅠ和PGⅡ的分泌均明顯減少，但十二指腸腺和胰腺仍可分泌PGⅡ，故PGⅡ水平不受影響，因此慢性萎縮性胃炎時(shí)血清PGⅠ水平明顯減少，PGⅡ水平可正常或輕度增多。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素干預(yù)組胃組織PGⅠ、PGⅡ水平均較模型組明顯升高，且不同劑量辣椒素干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究主要以胃體組織的磨碎液作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，故可直觀地通過PGⅠ、PGⅡ水平了解胃底腺數(shù)量，發(fā)現(xiàn)三種劑量的辣椒素均可明顯改善萎縮，效果有明顯差異。

NF-κB系統(tǒng)是各種炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，亦是影響炎癥反應(yīng)中細(xì)胞凋亡進(jìn)程的重要因素。有資料表明NF-κB系統(tǒng)參與了胃炎、消化性潰瘍的發(fā)生、發(fā)展。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在慢性萎縮性胃炎炎癥反應(yīng)中的作用也越來越受到重視，通過干預(yù)NF-κB活化途徑，對(duì)治療慢性萎縮性胃炎具有積極意義。XIAP基因是凋亡抑制蛋白家族成員之一，為目前作用最強(qiáng)的內(nèi)源性凋亡抑制蛋白，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在炎癥反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，核因子NF-κB刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，可明顯上調(diào)XIAP水平，NF-κB抑制物IκB的過表達(dá)能完全抑制NF-κB和XIAP。反之，過表達(dá)XIAP可完全抵消IκB的抑制作用[8]。提示XIAP是一類NF-κB相關(guān)的調(diào)控基因，據(jù)此推測(cè)慢性感染致慢性胃炎和胃癌病變過程中可能存在與IKKβ相關(guān)的XIAP表達(dá)增強(qiáng)[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素干預(yù)組IKKβ、NF-κB、XIAP表達(dá)水平較模型組明顯下降，且隨著辣椒素干預(yù)劑量的增加，IKKβ、NF-κB、XIAP表達(dá)下調(diào)更明顯。說明辣椒素可通過抑制NF-κB系統(tǒng)，阻礙胃黏膜炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，給予慢性萎縮性胃炎大鼠中小劑量辣椒素干預(yù)能修復(fù)胃黏膜損傷，甚至可能逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮，阻止慢性萎縮性胃炎的發(fā)生、發(fā)展，為辣椒素治療慢性萎縮性胃炎并阻止其癌變提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2014-11-24收稿；2015-01-03修回)

Effect of Capsaicin on Chronic Atrophic GastritisZHOUQi,ZHANGQisheng.DepartmentofGastroenterology,BranchofShanghaiFirstPeople’sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai(200081)

Correspondence to: ZHANG Qisheng, Email: zhangqish1@163.com

Background: Chronic atrophic gastritis (CAG) is a common type of gastritis and is closely related to the pathogenesis of gastric carcinoma, however, the efficacy of its drug treatment is not clear. Aims: To study the therapeutic effect of capsaicin on CAG in rats. Methods: CAG rat model was established by intragastric administration of sodium deoxycholate, ethanol and ammonium hydroxide. Forty-four survival model rats were randomly divided into CAG model group and low, moderate, high dose capsaicin groups, rats in the latter 3 groups were intragastrically administrated with 1 mg·kg-1·d-1, 10 mg·kg-1·d-1, 30 mg·kg-1·d-1capsaicin, respectively, for 28 days. The inflammation and degree of atrophy of gastric mucosa were observed by HE staining. Gastric mucosal levels of pepsinogen (PG)Ⅰ, PGⅡ were determined by ELISA. The protein expressions of IKKβ, NF-κB, XIAP were determined by Western blotting. Results: The differences in inflammation and degree of atrophy of gastric mucosa, levels of PGⅠ, PGⅡ, protein expressions of IKKβ, NF-κB, XIAP were statistically significant among model group, low, moderate, high dose capsaicin groups (P<0.05). With the increasing of capsaicin dose, inflammation and degree of atrophy of gastric mucosa were improved in a dose-dependent manner (P<0.05), protein expressions of IKKβ, NF-κB, XIAP were decreased. Conclusions: Capsaicin is effective for the treatment of CAG.

Key wordsCapsaicin;Chronic Atrophic Gastritis;Therapy

通信作者*本文，Email: zhangqish1@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.05.005