瑞巴派特對阿司匹林所致人結(jié)腸癌細胞株Caco-2損傷的保護作用及其機制探討*

袁芳岑#張振玉&段兆濤姜宗丹

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化科(210006)

*基金項目：南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項目(YKK13103)

#Email: fangcenyuan@126.com

背景：隨著膠囊內(nèi)鏡的問世，非甾體消炎藥(NSAIDs)引起的小腸損傷日益受到重視。雖然有多種用于防治NSAIDs相關(guān)胃黏膜損傷的藥物，但對于NSAIDs相關(guān)小腸黏膜損傷，至今仍缺乏有效的防治措施。目的：探討瑞巴派特對阿司匹林所致人結(jié)腸癌細胞株Caco-2損傷的保護作用及其可能機制。方法：以經(jīng)阿司匹林10 mmol/L處理的Caco-2細胞作為阿司匹林組，經(jīng)阿司匹林聯(lián)合不同濃度(0.1、0.5、1.0 mmol/L)瑞巴派特處理的Caco-2細胞作為瑞巴派特組，同時設(shè)立陰性對照組。采用MTT實驗檢測細胞增殖抑制情況；采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況；采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化；采用Transwell實驗檢測細胞通透性；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測緊密連接蛋白occludin、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關(guān)蛋白細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、p38、p-p38、c-Jun氨基端激酶(JNK)、p-JNK表達。結(jié)果：瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L 組Caco-2細胞增殖抑制率、細胞凋亡率、細胞通透性均顯著低于阿司匹林組(P<0.05)，且隨瑞巴派特濃度升高而逐漸降低(P<0.05)。倒置相差顯微鏡觀察顯示，阿司匹林可誘導(dǎo)Caco-2細胞損傷，而瑞巴派特可減輕阿司匹林引起的細胞損傷。與阿司匹林組相比，瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組occludin、ZO-1、p-JNK表達顯著升高(P<0.05)，p-p38、p-ERK1/2表達顯著降低(P<0.05)，變化均呈瑞巴派特濃度依賴性(P<0.05)。結(jié)論：瑞巴派特可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路(抑制p38、ERK1/2磷酸化，促進JNK磷酸化)，使緊密連接蛋白表達上調(diào)、細胞通透性降低，從而防治阿司匹林所致Caco-2細胞損傷。

關(guān)鍵詞瑞巴派特；阿司匹林；Caco-2細胞；Occludin；閉鎖小帶蛋白-1；MAP激酶信號系統(tǒng)

阿司匹林是臨床上常用于消炎、解熱、鎮(zhèn)痛以及抗血小板的藥物。隨著阿司匹林的廣泛使用，其對胃十二指腸黏膜的損傷，如引起糜爛、潰瘍、出血等已被證實。以往由于缺乏特異、有效的檢查手段，阿司匹林相關(guān)小腸損傷長期被忽視。隨著膠囊內(nèi)鏡的問世，非甾體消炎藥(NSAIDs)引起的小腸損傷的檢出率顯著升高，甚至超過了NSAIDs所致胃損傷的發(fā)生率并因此而日益受到重視[1]。近年研究[2]發(fā)現(xiàn)，瑞巴派特對NSAIDs引起的小腸損傷具有治療作用。Caco-2細胞是一種人結(jié)腸癌細胞株，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系。在細胞培養(yǎng)條件下，生長在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上的Caco-2細胞可融合并分化為腸上皮細胞，形成連續(xù)的單層細胞。本研究以阿司匹林和瑞巴派特作用于Caco-2細胞，探討瑞巴派特對阿司匹林所致Caco-2細胞損傷的保護作用及其可能機制。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人結(jié)腸癌細胞株Caco-2由江蘇省人民醫(yī)院普外科惠贈。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，阿司匹林、DMSO購自Sigma公司，瑞巴派特購自湖北康寶泰精細化工有限公司，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，Transwell小室購自Millipore公司，F(xiàn)ITC-Dextran、兔抗人occludin、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、p38、p-p38、c-Jun氨基端激酶(JNK)、p-JNK抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1. Caco-2單層細胞模型建立：Caco-2細胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(37 ℃，5% CO2)，隔天更換培養(yǎng)液，每3 d按1∶3 比例傳代。

2. MTT實驗檢測細胞增殖抑制情況：取對數(shù)生長期Caco-2細胞，以每孔2×104個接種于96孔板，每孔體積100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換無血清培養(yǎng)基饑餓細胞4 h，分別以阿司匹林10 mmol/L(阿司匹林組)以及阿司匹林10 mmol/L+不同濃度瑞巴派特(瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組)處理細胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，以不含藥物的DMEM培養(yǎng)基處理細胞作為陰性對照組。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫避光充分振蕩15 min，以空白孔調(diào)零，于酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/陰性對照組A值)×100%。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

3. 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況：取阿司匹林組、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組和陰性對照組Caco-2細胞，培養(yǎng)24 h后，以不含EDTA的胰酶消化、離心后收集細胞，PBS洗滌2次，依次加入結(jié)合緩沖液 500 μL、Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，上流式細胞儀檢測。

4. 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化：取阿司匹林組、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組和陰性對照組Caco-2細胞，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。

5. Transwell實驗檢測細胞通透性：取對數(shù)生長期 Caco-2細胞，以每孔1×105個接種于24孔Transwell板(6.5 mm，0.4 μm)，頂端和基底端培養(yǎng)基分別為100 μL和600 μL，每隔1 d更換培養(yǎng)液。嵌入小室的過濾膜為聚碳酸酯膜，細胞在此膜上生長，形成連續(xù)的單細胞層。細胞培養(yǎng)至匯滿，更換無血清培養(yǎng)基饑餓上層小室內(nèi)細胞4 h，根據(jù)實驗分組予相應(yīng)處理(同步驟2)，同時加入1 mg/mL FITC-Dextran，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 min，吸取基底端培養(yǎng)基200 μL 作為基礎(chǔ)值，并補足培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。吸取基底端培養(yǎng)基200 μL，以熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm)檢測FITC熒光強度，計算通透率[3-4]。Caco-2單層細胞對FITC-Dextran的通透性以通透系數(shù)Pa表示。Pa=(樣品熒光強度×對照濃度×0.6 mL×103)/[對照熒光強度×通透時間(24 h)×通透膜面積(0.33 cm2)]。檢測結(jié)果以百分率表示，Pa%=(實驗樣品Pa值/對照樣品Pa值)×100%。

6. 蛋白質(zhì)印跡法檢測緊密連接蛋白和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關(guān)蛋白表達：取阿司匹林組、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組和陰性對照組Caco-2細胞，加入蛋白裂解液4 ℃裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入 ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、occludin、ZO-1抗體(工作濃度均為 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶6 000)，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，顯影，定影，以ImageJ 1.38x軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以其與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值的比值表示。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、細胞增殖抑制情況

MTT實驗檢測結(jié)果顯示，阿司匹林組、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組Caco-2細胞增殖抑制率分 別為(56.23±6.75)%、(44.10±4.78)%、(37.97±2.82)%和(31.00±3.26)%，3組不同濃度瑞巴派特組細胞增殖抑制率均顯著低于阿司匹林組(P<0.05)，且隨藥物濃度升高而逐漸降低(P<0.05)。

二、細胞凋亡情況

A：陰性對照組；B：阿司匹林組；C：瑞巴派特0.1 mmol/L組；D：瑞巴派特0.5 mmol/L組；E：瑞巴派特1.0 mmol/L組

圖1流式細胞術(shù)檢測各組Caco-2細胞凋亡情況

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，陰性對照組Caco-2細胞凋亡率為0.7 %(早期凋亡率0.4%，晚期凋亡率0.3%)，阿司匹林組為46.9%(早期凋亡率4.5%，晚期凋亡率42.4%)，瑞巴派特0.1 mmol/L組為35.1%(早期凋亡率8.5%，晚期凋亡率26.6%)，瑞巴派特0.5 mmol/L組為31.2%(早期凋 亡率2.5%，晚期凋亡率28.7%)，瑞巴派特1.0 mmol/L 組為 27.2%(早期凋亡率7.4%，晚期凋亡率19.8%)(圖1)。阿司匹林組細胞凋亡率顯著高于陰性對照組(P<0.05)，3組不同濃度瑞巴派特組均顯著低于阿司匹林組(P<0.05)，且隨藥物濃度升高而逐漸降低(P<0.05)。

三、細胞形態(tài)學(xué)變化

倒置相差顯微鏡觀察顯示，陰性對照組Caco-2細胞呈不規(guī)則類圓形，較均勻貼壁生長；阿司匹林組貼壁細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮、懸浮，部分細胞核濃縮；瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組貼壁細胞數(shù)量隨藥物濃度升高而逐漸增多，細胞形態(tài)逐漸接近類圓形，胞核濃縮細胞比率逐漸降低(圖2)。

四、細胞通透性

Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，阿司匹林組Caco-2細胞通透性顯著高于陰性對照組(P<0.05)，瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組細胞通透性均顯著低于阿司匹林組(P<0.05)，且隨藥物濃度升高而逐漸降低(P<0.05)(圖3)。

五、緊密連接蛋白和MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，阿司匹林組Caco-2細胞occludin、ZO-1、p-JNK表達顯著降低(P<0.05)，p-p38、 p-ERK1/2表達顯

著升高(P<0.05)；與阿司匹林組相比，瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L組occludin、ZO-1、p-JNK表達顯著升高(P<0.05)，p-p38、p-ERK1/2表達顯著降低(P<0.05)，變化均呈瑞巴派特濃度依賴性(P<0.05)(圖4、圖5)。

*與陰性對照組比較，P<0.05；#與阿司匹林組比較，P<0.05

0：陰性對照組；1：阿司匹林組；2：瑞巴派特0.1 mmol/L組；3：瑞 巴派特0.5 mmol/L組；4：瑞巴派特1.0 mmol/L組

圖3Transwell實驗檢測各組Caco-2細胞通透性

A：陰性對照組；B：阿司匹林組；C：瑞巴派特0.1 mmol/L組；D：瑞巴派特0.5 mmol/L組；E：瑞巴派特1.0 mmol/L組

*與陰性對照組比較，P<0.05；#與阿司匹林組比較，P<0.05

1：陰性對照組；2：阿司匹林組；3：瑞巴派特0.1 mmol/L組；4：瑞巴派特0.5 mmol/L組；5：瑞巴派特1.0 mmol/L組

圖5各組Caco-2細胞緊密連接蛋白和MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達蛋白質(zhì)印跡法電泳圖

討論

目前雖然有多種用于防治NSAIDs相關(guān)胃黏膜損傷的藥物，但對于NSAIDs相關(guān)小腸黏膜損傷，至今仍缺乏有效的防治措施。研究[5]指出，質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)奧美拉唑?qū)SAIDs引起的小腸損傷無防治作用，蘭索拉唑效果亦很有限。另有研究[6]發(fā)現(xiàn)，NSAIDs與PPIs聯(lián)合應(yīng)用對小腸的損傷較單用NSAIDs更為嚴(yán)重。2013年西班牙專家關(guān)于NSAIDs腸病防治的共識意見指出，瑞巴派特具有抗炎以及刺激胃黏膜分泌前列腺素的作用，對NSAIDs引起的小腸損傷具有顯著防治效果[7]。新近Kurokawa等[8]進行的一項多中心臨床研究亦發(fā)現(xiàn)，瑞巴派特對阿司匹林引起的小腸損傷具有治療作用。然而，NSAIDs腸病發(fā)生的具體機制迄今尚未明確。

阿司匹林引起的腸損傷以小腸為主。本研究選用Caco-2細胞作為人小腸細胞模型， 其可形成與小腸細胞相同的細胞極性和致密的單細胞層組織，形態(tài)亦類似人小腸上皮細胞，且可分泌與人類相同的酶類以及轉(zhuǎn)化因子，臨床上常用于建立體外腸黏膜屏障模型。本研究MTT實驗檢測結(jié)果顯示，阿司匹林組Caco-2細胞增殖抑制率達50%以上，而不同濃度瑞巴派特組與阿司匹林組相比，細胞增殖抑制率隨藥物濃度升高而逐漸降低，證實阿司匹林可抑制Caco-2細胞增殖，而瑞巴派特可減弱此抑制作用，作用呈濃度依賴性。以流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，結(jié)果與MTT實驗結(jié)果一致，證實瑞巴派特可濃度依賴性地抑制阿司匹林引起的Caco-2細胞凋亡。以倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，阿司匹林組Caco-2細胞皺縮、懸浮，部分細胞核濃縮，而在瑞巴派特組，隨著藥物濃度的升高，貼壁細胞數(shù)量逐漸增多，細胞形態(tài)逐漸接近類圓形，胞核濃縮細胞比率逐漸降低，證實瑞巴派特可減輕阿司匹林引起的Caco-2細胞損傷。

Transwell實驗主要用于研究腫瘤侵襲能力，亦可檢測單層細胞通透性[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林組Caco-2細胞通透性最高，與阿司匹林組相比，不同濃度瑞巴派特組細胞通透性隨藥物濃度升高而逐漸降低，作用呈濃度依賴性。細胞通透性與細胞間緊密連接密切相關(guān)，occludin和ZO-1是緊密連接的重要組成成分[9-10]。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與阿司匹林組相比，不同濃度瑞巴派特組Caco-2細胞occludin、ZO-1相對表達量隨藥物濃度升高而逐漸增高，提示瑞巴派特對Caco-2細胞的保護作用與增強細胞間緊密連接以降低細胞通透性有關(guān)。

研究顯示細胞間緊密連接受MAPK信號通路調(diào)節(jié)[11-14]。MAPK有3個主要亞族，分別為ERK1/2、JNK和p38MAPK，其中ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控細胞生長和分化，JNK和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥、細胞凋亡等病理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Masamune等[15]的研究證實，瑞巴派特能調(diào)控MAPK激酶磷酸化水平。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，阿司匹林組Caco-2細胞與陰性對照組相比，p-p38、p-ERK1/2相對表達量顯著升高，p-JNK相對表達量顯著降低，而不同濃度瑞巴派特組與阿司匹林組相比，p-p38、p-ERK1/2相對表達量顯著降低，p-JNK相對表達量顯著升高，表達變化均呈瑞巴派特濃度依賴性。根據(jù)上述實驗結(jié)果，推測瑞巴派特系通過抑制MAPK信號通路中的p38、ERK1/2磷酸化水平，提高JNK磷酸化水平，從而上調(diào)下游緊密連接蛋白occludin、ZO-1表達，使Caco-2細胞通透性降低，以維持小腸黏膜的完整性。

本研究組前期研究[16]發(fā)現(xiàn)，阿司匹林誘導(dǎo)胃上皮細胞損傷的作用可能是通過抑制ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的，而本研究卻顯示阿司匹林可能通過激活ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而誘導(dǎo)腸黏膜上皮損傷，可見同種NSAIDs作用于不同靶器官所引起的MAPK信號通路改變不盡相同。且本研究僅檢測了MAPK信號通路的改變，未進一步明確其改變是受上游信號調(diào)控抑或是其他信號通路改變的代償反應(yīng)，有待進一步研究。

綜上所述，瑞巴派特可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路(抑制p38、ERK1/2磷酸化，促進JNK磷酸化)，使緊密連接蛋白occludin、ZO-1表達上調(diào)、細胞通透性降低，從而防治阿司匹林所致Caco-2細胞損傷，達到保護腸黏膜的作用。

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(2014-12-19收稿；2015-01-16修回)

Protective Effect and Mechanism of Rebamipide on Injury of Human Colon Cancer Cell Line Caco-2 Induced by AspirinYUANFangcen,ZHANGZhenyu,DUANZhaotao,JIANGZongdan.DepartmentofGastroenterology,NanjingHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing(210006)

Correspondence to: ZHANG Zhenyu, Email： zhangzhenyu808@126.com

Background: With the development of capsule endoscopy, small intestinal injury induced by non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) has become an issue of growing concern. Although there are a variety of drugs used for NSAIDs-induced gastric mucosal injury, small intestinal injury caused by NSAIDs is lack of effective prevention and treatment modalities. Aims: To investigate the protective effect and possible mechanism of rebamipide on human colon cancer cell line Caco-2 injury induced by aspirin. Methods: In aspirin group, Caco-2 cells were treated with aspirin 10 mmol/L; in rebamipide group, Caco-2 cells were treated with aspirin and different concentrations of rebamipide (0.1, 0.5, 1.0 mmol/L), and a negative control group was established. Cell proliferation inhibition was measured by MTT assay. Cell apoptosis was determined by flow cytometry. Morphological changes of cells were observed under inverted phase contrast microscope. Permeability of cells was assessed by Transwell assay. Expressions of tight junction proteins occludin and zonula occluden-1 (ZO-1), as well as mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling pathway-associated proteins including extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2, phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2), p38, p-p38, c-Jun N-terminal kinase (JNK), and p-JNK, were determined by Western blotting. Results: Proliferation inhibition rate, apoptosis rate and permeability of Caco-2 cells in rebamipide 0.1, 0.5, 1.0 mmol/L groups were significantly lower than those in aspirin group in a dose-dependent manner (P<0.05). Injuries of Caco-2 cells were seen in aspirin group by inverted phase contrast microscope and rebamipide could reduce these injuries. Expressions of occludin, ZO-1 and p-JNK were significantly higher and expressions of p-p38 and p-ERK1/2 were significantly lower in rebamipide 0.1, 0.5, 1.0 mmol/L groups than those in aspirin group in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusions: Rebamipide have a protective effect against aspirin-induced Caco-2 cell injury, probably through regulating MAPK signaling pathway (inhibiting p38 and ERK1/2 phosphorylation, stimulating JNK phosphorylation), and subsequently up-regulating the expressions of tight junction proteins and decreasing the permeability of cells.

Key wordsRebamipide;Aspirin;Caco-2 Cells;Occludin;Zonula Occluden-1;MAP Kinase Signaling System

通信作者&本文，Email: zhangzhenyu808@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.05.004