胃癌中SEMA3B基因表達(dá)與其啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系*

肖坤庭#史冬濤虞竹雯田文妍陳衛(wèi)昌&

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(215006)

*基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(14KJB320014)

#Email: 20124232017@suda.edu.cn

背景：SEMA3B為一候選腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目的：初步探討DNA甲基化調(diào)控機(jī)制對胃癌中SEMA3B基因表達(dá)的影響。方法：以real-time PCR檢測6株人胃癌細(xì)胞株(SGC7901、AGS、MGC803、BGC823、MKN45、HGC27)、正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和41例胃癌組織及其相應(yīng)癌旁非癌組織中的SEMA3B mRNA表達(dá)。以甲基化特異性PCR檢測SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，并分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。以去甲基化藥物5-Aza-dC(10 μmol/L)處理上述細(xì)胞株72 h，觀察SEMA3B基因甲基化狀態(tài)和 mRNA表達(dá)變化。結(jié)果：6株胃癌細(xì)胞和胃癌組織中的SEMA3B mRNA表達(dá)分別顯著低于GES-1細(xì)胞(P<0.001)和相應(yīng)癌旁非癌組織(P<0.01)。6株胃癌細(xì)胞SEMA3B基因啟動子區(qū)均發(fā)生甲基化，GES-1細(xì)胞則未發(fā)生甲基化。胃癌組織SEMA3B基因甲基化率顯著高于相應(yīng)癌旁非癌組織(67.6%對32.4%，P<0.01)，甲基化狀態(tài)與胃癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。經(jīng)5-Aza-dC處理后，5株胃癌細(xì)胞SEMA3B基因甲基化程度下降，伴mRNA表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：SEMA3B基因啟動子區(qū)高甲基化可能是其在胃癌中表達(dá)下調(diào)的原因之一，并參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。SEMA3B有望成為胃癌診斷和預(yù)后評估的分子標(biāo)記物以及表觀遺傳學(xué)治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞胃腫瘤;基因，SEMA3B；基因，腫瘤抑制；DNA甲基化；基因表達(dá)調(diào)控

Gene Expression Regulation

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)胃癌病例近100萬例，其中約半數(shù)發(fā)生在東亞(主要是中國)[1]。胃癌的預(yù)后主要與其病理分期相關(guān)，早期胃癌經(jīng)治療后5年生存率大于90%，而進(jìn)展期胃癌術(shù)后5年生存率僅為30%~40%[2]。然而由于早期胃癌缺乏特異性癥狀和體征，且我國胃鏡普查率不高，84%的胃癌患者確診時已屬進(jìn)展期[3]。因此，尋找特異性較高的早期診斷標(biāo)記物可能成為改善胃癌治療效果和預(yù)后的有效方法。抑癌基因SEMA3B(semaphorin 3B)定位于染色體3p21.3，研究[4-7]表明該基因在多種惡性腫瘤(成神經(jīng)細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌)中失活與其啟動子區(qū)高甲基化或等位基因丟失有關(guān)。葉春福等[8]的研究發(fā)現(xiàn)SEMA3B mRNA在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織，但目前關(guān)于胃癌組織中SEMA3B基因表達(dá)下調(diào)機(jī)制的研究較少。本研究采用real-time PCR、甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)以及去甲基化藥物處理，旨在了解胃癌細(xì)胞和組織中SEMA3B基因表達(dá)與其啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系，以明確DNA甲基化調(diào)控機(jī)制對胃癌中SEMA3B基因表達(dá)的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞株、組織標(biāo)本和主要試劑

6株人胃癌細(xì)胞株SGC7901、AGS、MGC803、BGC823、MKN45、HGC27和正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

71例胃癌組織及其相應(yīng)癌旁非癌組織(距癌灶邊緣5 cm以上)取自2002年-2006年于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科行手術(shù)切除且經(jīng)術(shù)后病理確診的胃癌患者，其中男48例，女23例，年齡37~81歲，平均(61.3±9.8)歲。所有患者術(shù)前均未接受放、化療以及生物靶向治療，并排除合并其他腫瘤、胃息肉的患者。研究方案經(jīng)蘇州大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入選患者均簽署知情同意書。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-dC)(Sigma-Aldrich Co.)，RNAiso Plus試劑、MightyAmp?DNA多聚酶(Takara Bio Company)，M-MLV First Strand Kit(InvitrogenTM，Thermo Fisher Scientific Inc.)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche Diagnostics)，DNA提取試劑盒、EpiTect Bisulfite DNA甲基化修飾和回收試劑盒(QIAGEN)。

二、方法

1. 胃癌細(xì)胞株培養(yǎng)：SGC7901、AGS、MGC803、BGC823、MKN45細(xì)胞傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，HGC27、GES-1細(xì)胞傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

2. 去甲基化處理：實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞分別以10 μmol/L 5-Aza-dC或10 μmol/L DMSO處理72 h，收集細(xì)胞，提取RNA和DNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。藥物濃度和處理時間根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。

3. Real-time PCR：以RNAiso Plus試劑提取胃癌細(xì)胞、胃癌組織和癌旁非癌組織總RNA，以紫外分光光度法測定RNA濃度和純度，選取合格樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩EMA3B引物：F 5’-GCG TGG AGT GGA ACT TTC CAG-3’，R 5’- CAG CCT GCG CAG CAG TAG TC-3’；內(nèi)參照GAPDH引物：F 5’-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3’，R 5’-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算SEMA3B mRNA相對表達(dá)量。

4. MSP：以DNA提取試劑盒提取胃癌細(xì)胞、胃癌組織和癌旁非癌組織DNA，以紫外分光光度法測定DNA濃度和純度，選取合格樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?00 ng提取得到的DNA，以DNA甲基化修飾試劑盒修飾并純化，-20 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA 1 μL，以SEMA3B甲基化引物和非甲基化引物行PCR擴(kuò)增。SEMA3B甲基化引物：F 5’-TGG TTA GGC GGG GTA TTT TC-3’，R 5’-TCA ACA ATA AAA ACG AAA ACG-3’，擴(kuò)增片段長度133 bp；非甲基化引物：F 5’-GTG GTT AGG TGG GGT ATT TTT-3’，R 5’-ATC AAC AAT AAA AAC AAA AAC A-3’，擴(kuò)增片段長度135 bp。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性30 s，甲基化引物58 ℃/非甲基化引物54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(以ddH2O為陰性對照)，溴化乙錠染色，凝膠成像分析儀觀察并拍照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、胃癌細(xì)胞和胃癌組織SEMA3B mRNA表達(dá)

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1中的SEMA3B mRNA相對表達(dá)量顯著高于6株胃癌細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。在隨機(jī)選取的41例胃癌組織及其相應(yīng)癌旁非癌組織中，70.7%(29/41)的胃癌組織SEMA3B mRNA相對表達(dá)量低于相應(yīng)癌旁非癌組織，兩組SEMA3B mRNA相對表達(dá)量分別為0.009 0±0.000 9和0.013 5±0.001 2，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

二、胃癌細(xì)胞和胃癌組織SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)

MSP檢測結(jié)果顯示，SGC7901細(xì)胞同時擴(kuò)增出甲基化條帶和非甲基化條帶，其余5株胃癌細(xì)胞均只擴(kuò)增出甲基化條帶，而正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1只擴(kuò)增出非甲基化條帶(圖3)，表明6株胃癌細(xì)胞SEMA3B基因啟動子區(qū)均發(fā)生甲基化， 而GES-1細(xì)胞 SEMA3B基因未發(fā)生甲基化。71例胃癌組織中48例SEMA3B基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化，而71例癌旁非癌組織中僅23例發(fā)生甲基化(圖4)，胃癌組織甲基化率顯著高于相應(yīng)癌旁非癌組織(67.6%對32.4%, χ2=17.61，P<0.01)。

***與GES-1細(xì)胞比較，P<0.001

圖1胃癌細(xì)胞株與正常胃黏膜上皮細(xì)胞株SEMA3B mRNA表達(dá)比較

**與癌旁非癌組織比較，P<0.01

圖2胃癌組織(T)與癌旁非癌組織(N)SEMA3B mRNA表達(dá)比較

三、胃癌組織SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

M：甲基化；U：非甲基化

圖3胃癌細(xì)胞株與正常胃黏膜上皮細(xì)胞株SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)(MSP電泳圖)

分析顯示，胃癌組織SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織SEMA3B基因甲基化率分別顯著高于高-中分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P<0.05)；SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期均無相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

M：甲基化；U：非甲基化

表1胃癌組織SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系n(%)

臨床病理特征例數(shù)甲基化非甲基化χ2P值性別 男4833(68.8)15(31.2)0.09>0.05 女2315(65.2)8(34.8)年齡 <60歲2720(74.1)7(25.9)0.83>0.05 ≥60歲4428(63.6)16(36.4)腫瘤大小 <5cm1813(72.2)5(27.8)0.23>0.05 ≥5cm5335(66.0)18(34.0)分化程度 高-中分化4023(57.5)17(42.5)4.27<0.05 低分化3125(80.6)6(19.4)浸潤深度 T1/T24431(70.5)13(29.5)0.40>0.05 T3/T42717(63.0)10(37.0)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無2915(51.7)14(48.3)5.65<0.05 有4233(78.6)9(21.4)TNM分期 Ⅰ/Ⅱ4534(75.6)11(24.4)3.55>0.05 Ⅲ/Ⅳ2614(53.8)12(46.2)

四、去甲基化處理對SEMA3B基因甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)的影響

7株細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L 5-Aza-dC處理72 h后，MGC803細(xì)胞只擴(kuò)增出甲基化條帶，其余5株胃癌細(xì)胞均同時擴(kuò)增出甲基化和非甲基化條帶，而正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1只擴(kuò)增出非甲基化條帶(圖5)；經(jīng)10 μmol/L DMSO處理的所有細(xì)胞株甲基化狀態(tài)均未發(fā)生改變。與經(jīng)DMSO處理的對照組相比，經(jīng)5-Aza-dC處理的實(shí)驗(yàn)組GES-1、MGC803細(xì)胞SEMA3B mRNA表達(dá)無明顯變化，其余5株胃癌細(xì)胞SEMA3B mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖6)。

M：甲基化；U：非甲基化

圖55-Aza-dC去甲基化處理對各細(xì)胞株SEMA3B基因甲基化狀態(tài)的影響(MSP電泳圖)

與相應(yīng)對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖65-Aza-dC去甲基化處理對各細(xì)胞株SEMA3B mRNA表達(dá)的影響

討論

SEMA3B為一候選腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。SEMA3B mRNA長約3.4 kb，編碼由749個氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)。SEMA3s蛋白為信號素(semaphorins)家族成員，氨基端含有高度保守的SEMA結(jié)構(gòu)域，可與多種細(xì)胞表面受體如神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilins)、叢狀蛋白(plexins)結(jié)合，參與神經(jīng)元軸突導(dǎo)向的負(fù)向調(diào)控，并對 腫瘤生長和血管形成發(fā)揮抑制作用(主要是SEMA3B、SEMA3F)[9-10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)SEMA3B與腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165)存在共同的受體neuropilin-1，可通過與VEGF165競爭性結(jié)合neuropilin-1而拮抗其促腫瘤血管生成作用，從而抑制腫瘤生長；而VEGF165亦能拮抗SEMA3B誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。上調(diào)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-6(IGFBP-6)表達(dá)亦為SEMA3B發(fā)揮腫瘤抑制 活性的機(jī)制之一，研究[12]顯示以siRNA沉默IGFBP-6可阻斷SEMA3B的腫瘤細(xì)胞生長抑制效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的SEMA3B mRNA表達(dá)顯著低于相應(yīng)癌旁非癌組織，與葉春福等[8]的研究結(jié)果一致，并得到細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持，提示SEMA3B可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。MSP檢測結(jié)果顯示胃癌組織中的SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化率顯著高于相應(yīng)癌旁非癌組織，相關(guān)性分析表明SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與胃癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示所檢測的6株胃癌細(xì)胞SEMA3B基因啟動子區(qū)均發(fā)生甲基化，其中5株為未分化-低分化腺癌細(xì)胞株，部分有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特征，提示SEMA3B基因甲基化與胃癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望成為胃癌診斷和預(yù)后評估的分子標(biāo)記物。此外，本研究發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1的SEMA3B基因未發(fā)生甲基化，且SEMA3B mRNA表達(dá)顯著高于6株胃癌細(xì)胞，提示胃癌細(xì)胞和組織中的SEMA3B基因甲基化可能與SEMA3B mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)。以去甲基化藥物5-Aza-dC處理各細(xì)胞株72 h，5株胃癌細(xì)胞擴(kuò)增出SEMA3B非甲基化條帶并伴SEMA3B mRNA表達(dá)恢復(fù)，GES-1、MGC803細(xì)胞的SEMA3B基因甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)則均未發(fā)生明顯變化，證實(shí)胃癌細(xì)胞中SEMA3B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化是導(dǎo)致其mRNA表達(dá)下調(diào)的原因之一，SEMA3B是一個潛在的胃癌表觀遺傳學(xué)治療靶點(diǎn)。

綜上所述，SEMA3B基因啟動子區(qū)高甲基化可能是其在胃癌中表達(dá)下調(diào)的原因之一，并參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但其在胃癌中的具體作用及其機(jī)制尚需深入研究加以闡明。SEMA3B在胃癌診斷和預(yù)后評估中的價值仍需更多大樣本臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

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(2015-01-20收稿；2015-03-02修回)

Relationship between SEMA3B Gene Expression and its Promoter Methylation in Gastric CancerXIAOKunting,SHIDongtao,YUZhuwen,TIANWenyan,CHENWeichang.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006)

Correspondence to: CHEN Weichang, Email: weichangchen@126.com

Background: SEMA3B is a candidate tumor suppressor gene, which plays an essential role in tumorigenesis and progression of a wide variety of cancer. Aims: To explore preliminarily the influence of DNA methylation on regulation of SEMA3B gene expression in gastric cancer. Methods: Real-time PCR was used to determine the expression of SEMA3B mRNA in six human gastric cancer cell lines (SGC7901, AGS, MGC803, BGC823, MKN45, and HGC27), one gastric epithelial cell line (GES-1), and 41 gastric cancer tissue and paired adjacent noncancerous tissue specimens. Methylation specific PCR was used to detect the promoter methylation of SEMA3B gene, and correlation between methylation of SEMA3B gene and clinicopathological characteristics of gastric cancer was analyzed. After treated with a demethylation agent, 5-Aza-dC (10 μmol/L), for 72 hours, the methylation and mRNA expression of SEMA3B gene were re-examined in above-mentioned cell lines. Results: SEMA3B mRNA expression was significantly lower in six gastric cancer cell lines and gastric cancer tissues than that in GES-1 cells (P<0.001) and paired adjacent noncancerous tissues (P<0.01). Promoter methylation of SEMA3B gene could be detected in all six gastric cancer cell lines but not GES-1 cells. Frequency of SEMA3B gene methylation was significantly higher in gastric cancer tissues than in paired adjacent noncancerous tissues (67.6%vs. 32.4%,P<0.01), and the frequency was correlated with differentiation and lymph node metastasis of gastric cancer (P<0.05). After treated with 5-Aza-dC, hypermethylation of SEMA3B gene in 5 gastric cancer cell lines was decreased, accompanied by up-regulation of SEMA3B mRNA expression. Conclusions: Hypermethylation in promoter of SEMA3B gene might be one of the mechanisms accounting for the reduced expression of SEMA3B, and being involved in tumorigenesis and progression of gastric cancer. SEMA3B might be a potential biomarker for diagnosis and prognostic assessment for gastric cancer and a promising epigenetic therapeutic target.

Key wordsStomach Neoplasms;Genes, SEMA3B;Genes, Tumor Suppressor;DNA Methylation;

通信作者&本文，Email: weichangchen@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.05.003