王淑玲,余向軍,詹怡飛,趙振坤,龐瀟卿,謝　恬,曾昭武,4

(1．杭州師范大學醫(yī)學院，浙江 杭州 310036；2.淳安縣楓樹嶺鎮(zhèn)綜合農(nóng)技服務中心，浙江 杭州 311717； 3.杭州民生藥業(yè)集團有限公司，

浙江 杭州 310012；4.大連華立金港藥業(yè)有限公司，遼寧 大連 116000)

典則分析研究柴胡達原飲不同煎煮方式對化學成分溶出的影響

王淑玲1,余向軍2*,詹怡飛3,趙振坤1,龐瀟卿1,謝恬1,曾昭武1,4

(1．杭州師范大學醫(yī)學院，浙江 杭州 310036；2.淳安縣楓樹嶺鎮(zhèn)綜合農(nóng)技服務中心，浙江 杭州 311717； 3.杭州民生藥業(yè)集團有限公司，

浙江 杭州 310012；4.大連華立金港藥業(yè)有限公司，遼寧 大連 116000)

摘要：研究柴胡達原飲多種分煎、合煎方式對柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚5種成分溶出的影響.將柴胡達原飲方中10味中藥材，按照君臣佐使分為4組：A(黃芩、柴胡)，B(枳殼、桔梗、厚樸、草果、青皮、檳榔)，C(荷葉)，D(炙甘草).按照排列組合排成15種組合方式.采用UFLC檢測提取液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量.運用SAS 9.1對數(shù)據(jù)進行相關分析和綜合評判.結果發(fā)現(xiàn)：5種成分均能達到基線分離，各成分均有較寬的線性范圍和良好的線性關系；枳殼在合煎、分煎中受到的影響與青皮、厚樸是不同的；較佳組合為ACD+B，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量分別為1.3130、0.6370、1.9420、0.8786、0.6110 mg/mL.ACD+B方式分煎，5種成分的溶出最大；相關分析能較好地揭示各組分的相互關系.

關鍵詞：柴胡達原飲; 合煎; 分煎; 相關分析; 綜合評價法

柴胡達原飲，現(xiàn)代多用于治療流行性感冒、夏秋季無名高熱及不明原因的發(fā)熱而癥見寒熱往來，胸膈痞滿，苔白厚膩，脈弦滑者，療效較好.處方由清代醫(yī)家俞根初首創(chuàng)，出自《重訂通俗傷寒論》，由柴胡、黃芩、枳殼、青皮、厚樸、桔梗、草果、檳榔、荷葉、炙甘草組成.以柴芩為君者，以柴胡疏達膜原之氣機，黃芩苦泄膜原之郁火也.臣以枳、桔開上，樸、果疏中,青、檳達下，以開達三焦之氣機，使膜原伏邪從三焦而外達肌腠也.佐以荷透之；使以甘草和之.整個處方透表清里，宣暢三焦，透達募原.枳殼、青皮、厚樸均為此方中的臣藥.柚皮苷、新橙皮苷是枳殼的主要藥用成分；橙皮苷是青皮的主要藥用成分；厚樸酚、和厚樸酚是厚樸的的主要藥用成分.本文通過測定15種組合方式所煎湯劑中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚的含量，研究15種組合方式對這5種成分溶出的影響，選擇溶出度綜合評價值高的組合方式對于提高全方藥效具有重要意義.

1儀器與材料

超高效液相色譜儀、工作站及紫外檢測器(日本Shimadzu公司)；FA1100型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；甲醇(色譜純，天津四友)，水為去離子雙蒸水(實驗室自制)；柚皮苷對照品(10236472)由中國藥品生物制品鑒定所提供，橙皮苷、新橙皮苷(10191201111)、厚樸酚、和厚樸酚(10191201203)由南昌貝塔生物科技有限公司提供；磷酸(分析純，杭州大方化學試劑廠).藥材經(jīng)杭州師范大學王淑玲鑒定，柴胡為傘形科多年生草本植物北柴胡(BupleurumsinensesDC.)和狹葉柴胡(南柴胡BupleurumsachalinenseFr.Schm)的干燥根；黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根；枳殼為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實；青皮為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮；厚樸是木蘭科植物厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils)或凹葉厚樸(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils. var. bilobaRehd. et Wils)的干燥干皮、根皮及枝皮；桔梗為桔梗科植物桔梗(Platycodongrandiflorum( Jacq.) A.DC.)的干燥根部；草果是姜科豆蔻屬植物草果(Amomumtsao-ko)的干燥成熟果實；檳榔為棕櫚科植物檳榔(ArecacatechuLinn.)的干燥種子；荷葉是睡蓮科植物蓮(NelumbonuciferaGaerth.)的葉；炙甘草為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、脹果甘草(GlycyrrhizainflateBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabiaL.)的干燥根及根莖.切厚片.切片，蜜炙[1].以上藥材均符合2010版中國藥典標準，由華東大藥房提供.

表1　梯度洗脫條件

2方法與結果

2.1　色譜條件

色譜柱為Spherisorb C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，進樣量15 μL，體積流量1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長294 nm，流動相為乙腈-水，梯度洗脫條件見表1.

在此色譜條件下，樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚相應峰分離良好，且陰性對照無干擾.

2.2　對照品溶液的制備

精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚等對照品適量，干燥后，精密稱定，加色譜級甲醇定容，配制成56、144、88、48、44 μg/mL的混合對照品溶液，備用.

2.3　樣品溶液的制備

柴胡達原飲處方由柴胡15 g、黃芩15 g、枳殼15 g、青皮15 g、厚樸15 g、桔梗15 g、草果6 g、檳榔10 g、荷葉10 g、炙甘草6 g共10味中藥材組成.方中飲片按君臣佐使組方原則分為4組：A(黃芩、柴胡)，B(枳殼、桔梗、厚樸、草果、青皮、檳榔)，C(荷葉)，D(炙甘草).按照排列組合法，共有15種組合方式(ABCD，A+B+C+D，AB+C+D，AC+B+D，AD+B+C，BC+A+D，BD+A+C，CD+A+B，AB+CD，AC+BD，AD+BC，ABC+D，ABD+C，ACD+B，BCD+A).

將處方中藥材分別粉碎，按處方比例稱取10～20目之間粗粉，進行提取.提取3次，時間依次為30、15、15 min，提取溫度為100 ℃.加水量分別為中藥量的10、8、8倍.提取液分別用4層紗布濾過，分別離心(3 000 r·min-1，20 min)，合并上清液，減壓濃縮并定容.ABCD、B、AB、BC、BD、ABC、ABD、BCD的提取液減壓濃縮定容至500 mL；A、C、D、AC、AD、CD、ACD的提取液減壓濃縮定容至100 mL.吸取ABCD提取液1 mL，至10 mL容量瓶中，加色譜級甲醇定容，搖勻，得ABCD樣品液；從A、B、C、D提取液中分別吸取1、5、1、1 mL.搖勻后吸取1 mL至10 mL容量瓶中，加色譜級甲醇定容，得A+B+C+D樣品液；以此類推制備15種組合方式的樣品液.分別過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得15組供試液.

2.4　陰性對照溶液的制備

按處方比例分別制備缺枳殼、青皮、厚樸的陰性樣品，按2.3項操作，得陰性對照溶液，依2.1項測定.結果陰性對照在柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚相應保留時間處無干擾.

2.5　線性關系考察

取制備的混合對照品溶液，進樣量依次為1、3、5、10、20 μL，依2.1項測定.以各對照品峰面積為縱坐標，質(zhì)量(μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：柚皮苷y=1 300 690x+18 161(r=0.9995)，橙皮苷y=1 254 040x+42 902(r=0.9995)，新橙皮苷y=624 020x+13 852(r=0.9997)，和厚樸酚y=124 912x-12 202(r=0.9999)，厚樸酚y=138 888x-2 612.7(r=0.9999).結果表明柚皮苷在0.28~5.6 μg，橙皮苷在0.44~8.8 μg，新橙皮苷在0.44~8.8 μg，和厚樸酚在0.24~4.8 μg，厚樸酚在0.22~4.4 μg線性關系良好.

2.6　精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液15 μL，連續(xù)進樣6 次，依2.1項測定.計算得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的RSD分別為0.86%、1.13%、2.02%、1.73%、1.32%，表明儀器精密度良好.

2.7　穩(wěn)定性試驗

取ABCD組供試液，分別在 0、2、4、6、8、12 和 24 h，按2.1項下色譜條件測定，測得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD分別為 1.49%、0.81%、0.89%、0.76%、1.85%，表明樣品溶液 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.8　重現(xiàn)性試驗

取ABCD組6份，按2.3項操作制備供試液，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積.測得樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD 為1.23%、2.02%、1.07%、1.10%、1.40%.結果表明測定方法重現(xiàn)性良好.

2.9　回收率試驗

取已知含量的ABCD組供試液6份，每份1 mL，分別按照下表2加入對照品，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，依2.1項測定.結果見表2.

表2　回收率試驗結果

2.10　樣品含量測定

取2.3項方法制備供試品溶液(圖譜如圖1-圖5所示,其中：1—柚皮苷；2—橙皮苷；3—新橙皮苷；4—和厚樸酚；5—厚樸酚)，分別進樣測定，每份平行測定3次，外標一點法計算，取平均值.結果見表3.

圖1　混合對照品圖譜Fig. 1　Mixed standard map

圖2　缺枳殼陰性對照圖譜Fig .2　Auranth fructus negative control map

圖3　缺青皮陰性對照圖譜Fig. 3　Citri reticulatae pericarpium viride negative control map

圖4　缺厚樸陰性對照圖譜Fig. 4　Magnoliae officinalis cortex negative control map

圖5　樣品圖譜Fig. 5　Samples map

表3　15種組合方式中5種成分的含量

2.11　5種成分之間的相關性分析

運用SAS9.1[2]系統(tǒng)研究5種成分兩兩之間的相關性，結果見表4.

表4　5種成分兩兩之間的相關性

注：r表示相關系數(shù);*P<0.05,**P<0.01.

由表4可知:柚皮苷和新橙皮苷存在相關性；新橙皮苷與和厚樸酚、厚樸酚存在相關性；和厚樸酚與厚樸酚存在相關性.由于這些成分均存在于臣藥B中，它們存在相關性說明分煎、合煎方式對它們?nèi)艹龅挠绊懯且恢碌?同時，橙皮苷對和厚樸酚與厚樸酚都有相關性，對柚皮苷和新橙皮苷都沒有相關性，說明橙皮苷、和厚樸酚與厚樸酚受到的影響是一致的.而柚皮苷對和厚樸酚與厚樸酚無相關性，新橙皮苷對和厚樸酚與厚樸酚有相關性，前面已知柚皮苷和新橙皮苷有相關性，說明此方法分析相關性具有一定的局限性.

表5　3種藥材的典則相關分析

注：r表示典則相關系數(shù)；*P<0.05,**P<0.01.

由于柚皮苷和新橙皮苷存在相關性，和厚樸酚與厚樸酚存在相關性，柚皮苷和新橙皮苷是枳殼的主要藥用成分，和厚樸酚與厚樸酚是厚樸的主要藥用成分，將5種成分分為三組：柚皮苷和新橙皮苷、橙皮苷、和厚樸酚與厚樸酚.對這三組數(shù)據(jù)兩兩進行相關分析，即是對藥材枳殼、青皮和厚樸進行相關分析.利用SAS統(tǒng)計軟件對兩組變量間進行相關分析即典則相關分析(canonical correlation analysis)，反應兩組變量的相關本質(zhì).分析結果見表5.

2.12　綜合評價法選擇較優(yōu)的組合方式

表6　綜合評判Y值

由上表可知，Y值最高的組合為ACD+B.

3討論

1) 15種組合方式供試液的色譜峰個數(shù)一致，說明該條件下，未檢出合煎、分煎方式產(chǎn)生的新化合物[3-4].

2) 運用SAS9.1系統(tǒng)研究5種成分兩兩之間的相關性，具有一定的局限性.利用SAS統(tǒng)計軟件中對兩組變量間進行典則相關分析，在數(shù)據(jù)分析上，反應兩組變量的相關本質(zhì).青皮和厚樸存在相關性；枳殼和青皮、厚樸的相關性不顯著.可以認為枳殼在合煎、分煎中受到的影響與青皮、厚樸是不同的.另外，組合對各味藥其他成分的影響，對整體藥性的影響以及煎出液的藥效方面的影響，還需要進一步深入研究.

3) 但從5種成分煎出量角度分析，利用綜合評價法選擇較優(yōu)的組合方式，Y值最高的組合為ACD+B.而且，B分煎時的Y值要明顯大于B與其他組分合煎，表明B分煎更有利于藥用成分的溶出.

參考文獻:

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 阮敬.SAS統(tǒng)計分析從入門到精通[M].北京:人民郵電出版社,2009.

[3] Satoh H. Pharmacological characteristics of Kampo medicine as a mixture of constituents and ingredients[J]. J Integr Med,2013,11(1):11-16.

[4] Islam M K, Mahmud I, Saha S,etal. Preliminary pharmacological evaluation of Alocasia indica Schott tuber[J]. J Integr Med,2013,11(5):343-351.

On the Effects of Different Decoction of Chaihudayuan Decoction on the Extract of

5 Chemicals by Canonical Correlation Analysis

WANG Shuling1, YU Xiangjun2, ZHAN Yifei3, ZHAO Zhenkun1, PANG Xiaoqing1, XIE Tian1, ZENG Zhaowu1，4

(1.Medical College, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2.Agro-technical Station of Fengshuling Town,

Hangzhou 311717, China; 3.The People’s Livelihood Pharmaceutical Co., Hangzhou 310012, China;

4.Dalian Holley Kingkong Pharmaceutical Co.,Ltd., Dalian 116000, China)

Abstract:This paper studies the effects of different mixed and separated decoction of Chaihudayuan Decoction on the extract of 5 chemicals, naringin, hesperidin, neohesperidin, honokiol and magnolol. The 10 medicinal herbs used in Chaihudayuan Decoction are divided into 4 groups according to monarch, minister, assistant and guide. The 4 groups have 15 different decoctions and the contents of the 5 chemicals are determined by UFLC. The data is analyzed by SAS 9.1. The results show that the 5 chemicals are well separated and show good linearity. Hovenia dulcis is affected in combined decoctions and separated decoctions differently from green husk, magnolia bark. The best composition is ACD+B, and the contents of naringin, hesperidin, neohesperidin, honokiol and magnolol are 1.313, 0.6370, 1.942, 0.8786, 0.6110 mg/mL respectively. The separated decoction ACD+B is proper for the 5 chemicals. The correlation analysis can deeply reveal the relations between the compositions.

Key words:Chaihudayuan Decoction; mixed decoction; separated decoction; correlation analysis; comprehensive evaluation

第14卷第1期2015年1月杭州師范大學學報(自然科學版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.14No.1Jan.2015

*共同第一作者

文章編號:1674-232X(2015)01-0049-06

中圖分類號:R284. 1

文獻標志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.01.009

通信作者：王淑玲(1972-)，女，講師，博士，主要從事中藥新技術、新制劑、新劑型、中藥復方研究.E-mail：wsling222@163.com

基金項目:杭州市科技發(fā)展計劃項目(20130432B05，20131232i37)；遼寧省 “百千萬人才工程”資助項目(2013921005)；大連市科技計劃項目(2013E11SF052).

收稿日期：2014-05-17