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甘草干姜湯治療變應性鼻炎大鼠的實驗研究*

***貴陽醫(yī)學院臨床醫(yī)學院2011級本科學生網(wǎng)絡出版時間：2015-01-13

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1915.023.html

張燕平1， 吳寧2**， 王煒妍1， 王時敏2***

(1.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽550003； 2.貴陽醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察甘草干姜湯對變應性鼻炎大鼠外周血中γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)的表達及鼻黏膜組織的影響。方法： 120只大鼠隨機分為正常組、甘草干姜湯組、模型組及西藥組4組，后3組用卵清蛋白(AVO)制作變應性鼻炎動物模型，分別給予甘草干姜湯2~2.5 mL/只、西替利嗪溶液2~2.5 mL/只、生理鹽水2~2.5 mL/只灌胃(模型組及對照組)，每天1次；每組大鼠分別在灌胃10、20及30 d時處死10只，檢測大鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，同時觀察各組大鼠各時點的行為學和鼻黏膜組織學變化。結果： 灌胃10 d，甘草干姜湯組和西藥組與模型組大鼠行為學表現(xiàn)無明顯差異(P>0.05)，但與正常組存在明顯差異(P<0.01)；灌胃20 d，甘草干姜湯組和西藥組大鼠與模型組和正常組均有明顯的差異(P<0.01)；灌胃30 d，甘草干姜湯組和西藥組行為學變化接近正常組(P>0.05)；甘草干姜湯組和西藥組灌胃10和20 d 時，血清中IFN-γ、IL-4水平與正常組、模型組均有明顯差異(P<0.01)；灌胃30 d，甘草干姜湯組、西藥組IFN-γ和IL-4與模型組比較，分別有明顯升高和下降(P<0.01)，但與正常組無明顯差異(P>0.05)；HE染色示甘草干姜湯組與西藥組灌胃30 d，鼻黏膜結構逐漸修復，嗜酸細胞顯著減少，而正常組與模型組未見明顯改變。結論： 甘草干姜湯能改善變應性鼻炎大鼠的癥狀，對鼻黏膜有一定修復作用，其機制可能與調(diào)節(jié)IFN-γ-及IL-4水平有關。

[關鍵詞]鼻炎，變應性； 白細胞介素4； γ-干擾素； 鼻粘膜； 甘草干姜湯

變應性鼻炎又稱過敏性鼻炎，是由于易感個體接觸致敏變應原后導致的多種免疫活性細胞、細胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥性疾病，臨床以頻繁發(fā)作的噴嚏，過量的鼻水樣分泌物等癥狀為主要特征，是耳鼻咽喉頭頸外科常見多發(fā)病及難治性疾病[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學提出一些改善變應性鼻炎癥狀的治療手段，但對遠期療效還缺乏滿意的治療方法和手段，且費用高，藥物副作用大，治療手段要求高，患者堅持系統(tǒng)治療的依從性不高。中醫(yī)藥對治療變應性鼻炎有獨特優(yōu)勢，但缺乏對其治療機理的科學依據(jù)。甘草干姜湯是張仲景的經(jīng)方，具有溫中復陽，培土生金之功，全方藥味精簡，理方甚深，臨床用甘草干姜湯煎水口服可明顯減輕變應性鼻炎癥狀[2]，為探究其治療機理，本研究采用甘草干姜湯治療變應性鼻炎動物模型，總結如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑

健康清潔級SD大鼠120只，體重180~220 g，雌雄各半，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，合格證號SCXK(渝)2007-005。參照實驗動物與人臨床用藥劑量體重換算的轉換公式計算，將甘草干姜湯(甘草30 g、干姜15 g)按原方劑量要求在蒸餾水煎汁后用生理鹽水配成濃度相當于生藥0.384 g/mL煎液[3]。西替利嗪(宜昌長江藥業(yè)有限公司提供，批號20120314)，10 mg/片，用生理鹽水配制成0.05%溶液。卵清白蛋白(OVA，sigma產(chǎn)品，A5503-1G)；氫氧化鋁[AL(OH)3]、ELISA法血清試劑、白細胞介素-4(IL-4)含量測定試劑盒、干擾素-γ(IFN-γ)含量測定試劑盒，由上海巧伊生物科技有限公司提供，批號JER-03、JER-06。

1.2實驗方法

1.2.1造模參照章如新[4]、Konno A[5]變應性鼻炎動物模型制作方法并改進：將120只大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機選90只采用卵清蛋白致敏的方法造模，用配好的含[OVA 0.3 mg+AL(OH)3凝膠30 mg]的變應原混懸液每鼠1 mL腹腔注射，隔日1次，共7次，為基礎致敏。腹腔注射完成后，每只大鼠以0.25%OVA生理鹽水溶液2 mL霧化吸入強化致敏，每日1 次，連續(xù)5 d。間歇3 d后，用5%OVA生理鹽水攻擊雙側鼻腔，每側50 μL，每日1次，共7次。剩余30只大鼠用相應等量的生理鹽水腹腔注射、霧化和滴鼻攻擊。

1.2.2動物分組致敏后的90只大鼠隨機分為甘草干姜湯組、模型組和西藥組，各30只；剩余30只為正常組。甘草干姜湯組和西藥組分別給予甘草干姜湯和西替利嗪溶液2~2.5 mL/只，其余兩組給予2~2.5 mL/只的生理鹽水灌胃，每天1次；給藥期間，甘草干姜湯組、西藥組和模型組每日仍以1%OVA滴鼻維持致敏，正常組以生理鹽水滴鼻，每日1次，每次20 μL，直至給藥結束。各組大鼠分別在灌胃10、20、30 d時處死10只。

1.2.3行為學觀察參照1997年(?？?修訂的全國變應性鼻炎診斷及療效評定標準：從給藥開始，觀察大鼠的噴嚏、抓鼻和流涕情況，觀察時間為鼻腔滴藥(給予1%OVA，每側50 μL)30 min內(nèi)，采用疊加量化記分法對大鼠進行行為學指標評分[6]。(1)噴嚏：1次連續(xù)3～9個為1分，10～14個為2分，≥15個為3分。(2)鼻癢：輕搔鼻2～3次為1分，3～5次為2分，5次以上為3分。(3)流涕：流至鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。疊加總分≥5分表示制造模型成功。

1.2.4外周血IL-4、INF-γ測定大鼠末次給藥24 h內(nèi)，股動脈放血取血，分離血清，采用定量ELISA 法檢測血清IFN-γ和IL-4的含量。

1.2.5鼻黏膜組織取材大鼠處死后，剝除上頜骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中游離出來，沿鼻中線切開，暴露鼻中隔及雙側鼻腔，取鼻黏膜組織。將部分鼻中隔前部黏膜固定于10%甲醛溶液中，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片4 μm厚，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學改變。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1行為學表現(xiàn)

模型組、甘草干姜湯組和西藥組全部動物疊加記分均>5分，出現(xiàn)典型的變應性鼻炎癥狀，頻繁的噴嚏，搔抓鼻周圍，大量清涕流出及覓食減少等行為學表現(xiàn)；正常組動物偶有輕微噴嚏和搔抓鼻部的癥狀，但疊加記分均<5；模型組、甘草干姜湯組和西藥組3組大鼠變應性鼻炎造模成功。灌胃10 d，甘草干姜湯組與西藥組大鼠仍有的噴嚏、撓鼻、流清涕表現(xiàn)，與模型組大鼠行為學表現(xiàn)無明顯差異(P>0.05)，但與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。甘草干姜湯組與西藥組給藥20 d后，癥狀明顯好轉，噴嚏、撓鼻次數(shù)較前明顯減輕，鼻部癥狀未完全恢復，仍有變應性鼻炎癥狀表現(xiàn)，與模型組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；甘草干姜湯組與西藥組治療30 d后，鼻部癥狀與正常組大鼠差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠干預后的行為學指標

(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P>0.05；(3)與正常組比較，P<0.01；(4)與模型組比較，P<0.01；(5)與正常組比較，P>0.05；(6)與模型組比較，P<0.01

2.2血清IFN-γ、IL-4

甘草干姜湯組和西藥組給藥10、20 d時，與模型組比較，血清IFN-γ水平明顯升高，IL-4水平明顯下降(P<0.01)；用藥30 d時，與模型組比較，甘草干姜湯組和西藥組IFN-γ明顯升高，IL-4明顯下降(P<0.01)，但甘草干姜湯組和西藥組IFN-γ、IL-4與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3大鼠鼻黏膜變化

圖1顯示，正常組大鼠鼻粘膜上皮細胞無增生，排列整齊，杯狀細胞少，固有層無水腫；模型組大鼠鼻粘膜上皮增厚，杯狀細胞增生，固有層水腫，嗜酸細胞浸潤，腺體增生；甘草干姜湯組10 d時，鼻粘膜纖毛排列不整齊，上皮細胞增生，嗜酸細胞浸潤；甘草干姜湯組20 d時，上皮細胞逐漸變薄，嗜酸細胞浸潤變少；甘草干姜湯組30 d時，鼻粘膜纖毛排列整齊，上皮細胞逐漸恢復正常，僅有少量的嗜酸細胞存在；西藥組10 d時，上皮細胞增生，嗜酸細胞浸潤；西藥組20 d時，上皮細胞變薄，嗜酸細胞浸潤變少；西藥組30 d時，纖毛整齊，上皮細胞逐漸恢復正常，嗜酸細胞減少。

表2　各組大鼠干預后血清IFN-γ、IL-4水平

(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01；(3)與正常組比較，P<0.01；(4)與模型組組比較，P<0.01；(5)與正常組比較，P>0.05；(6)與模型組比較，P<0.01

圖1　各組大鼠干預后鼻黏膜病理學觀察(HE,×400)Fig.1　The pathological changes of nasal mucosa of rats in each group after medication

3討論

變應性鼻炎時患者體內(nèi)T淋巴細胞亞群的失衡，尤其是Th1/Th2細胞在數(shù)量、活化及功能方面的比例失衡是其發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)，是導致鼻黏膜慢性炎癥和組織損傷的重要因素[7]。IL-4是Th2細胞釋放的關鍵性細胞因子，對Th2細胞極化有重要的誘導作用，并可抑制Th1細胞的增殖[8]。IFN-γ為Th1細胞的標志性細胞因子，可抑制Th2細胞的增殖活化，減少IL-4的產(chǎn)生，并拮抗IL-4的各種生物學效應，阻止IgE的合成[9]。

本實驗結果證實甘草干姜湯有改善變應性鼻炎的癥狀，對變應性鼻炎細胞因子失衡方面有一定的調(diào)節(jié)作用，作用機制可能是甘草干姜湯可糾正失衡的Th1/Th2細胞因子網(wǎng)絡,使變應性鼻炎大鼠血清中的IFN-γ水平升高、IL-4水平降低，從而使體內(nèi)Th細胞分化偏移發(fā)生逆轉,促使Th1/Th2分泌的細胞因子比值恢復平衡，從而抑制并改善變應性鼻炎臨床癥狀。本實驗結果提示變應性鼻炎大鼠在服用甘草干姜湯治療20~30 d有效，為臨床上服用甘草干姜湯治療變應性鼻炎提供有效的用藥周期。通過觀察病理切片HE染色大鼠鼻粘膜組織結構的改變及炎癥因子數(shù)量變化，說明甘草干姜湯有一定修復鼻粘膜組織損傷的作用，有利于炎癥的消除。本實驗結果初步探討甘草干姜湯治療變應性鼻炎的作用機制，為甘草干姜湯合理運用于臨床提供了一定的實驗理論支持。

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(2014-09-03收稿，2014-10-23修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

Experimental Study on the Role of Licorice and Dried Ginger

in Treating Rats with Allergic Rhinitis

ZHANG Yanping1, WU Ning2, WANG Weiyan1, WANG Shimin2

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550003,Guizhou,China;

2.DepartmentofBiochemistryandMolecularbiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China

[Abstract]Objective: To observe the impact of licorice and dried ginger on peripheral blood levels of γ-interferon (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) as well as nasal tissue of allergic rhinitis rats. Methods: A total of 120 rats were randomly divided into four groups: the normal control group (group C), licorice and dried ginger group (group L), model group (group M), and western medicine control group (group W). Rats in the latter three groups were given ovalbumin (OVA) to establish allergic rhinitis model and were given licorice and dried ginger soup, physiological saline and cetirizine by gavage respectively. On the 10th, 20thand 30thday after administration, 10 rats were sacrificed respectively, and serum levels of IFN-γ, IL-4 were detected, changes of rat behavior and nasal mucosa tissues in each time point were observed. Results: On the 10thday after medication, there was no significant difference in rat behavior among groups L, M and W (P>0.05), while significant difference was found between the three groups and group C (P<0.01). On the 20thday after medication, there were significant differences in rat behavior and serum levels of IFN-γ, IL-4 between groups L, W and groups C, M (P<0.01). On the 30th day after medication, rat behavior and serum levels of IFN-γ, IL-4 in groups L and W were close to group C (P>0.05), and the structure of nasal mucosa gradually repaired, eosinophils significantly reduced in groups L and W. Conclusions: Licorice and dried ginger can improve the symptoms of allergic rhinitis rat and repair the nasal mucosa. The mechanism may relate to regulate the serum levels of IFN-γ and IL-4.

[Key words]rhinitis,allergic; interleukin-4; γ-interferon; nasal mucosa; licorice and dried ginger

[中圖分類號]R34; R765.21

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0036-05

通信作者**E-mail:Zhang＿ypdjl@sina.com

[基金項目]*貴州省科技廳項目[黔科合中藥字(2011)LKZ7012號]