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貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對衰老模型小鼠Trx含量及肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響*

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1921.026.html

申雪慧子1， 姬曉云2, 岳蘭2， 劉華1， 吳寧1，3**

(1.貴陽醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽醫(yī)學院 藥學院， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽醫(yī)學院 理化實驗中心， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對衰老模型小鼠硫氧還原蛋白(Trx)含量及肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響，探討富鋅富硒綠茶保肝抗衰老的機制。方法： 昆明雄性小鼠70只均分為正常對照組、衰老模型組、陽性對照組、富鋅富硒綠茶高、中、低劑量組和普通綠茶組，除正常對照組給予腹腔注射生理鹽水外，其余6組均給予腹腔注射0.2 mg/(g·d)D-半乳糖制備衰老模型；造模第3周正常對照組和衰老模型組均給予蒸餾水灌胃，其余5組分別給予維生素C，高、中、低3種濃度富鋅富硒綠茶及普通綠茶灌胃，1次/d，連續(xù)4周；最后1次灌胃后2 h取小鼠眼眶血，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測小鼠血清Trx的含量，電鏡下觀察小鼠肝臟組織的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果： 與正常對照組相比，衰老模型組Trx含量明顯降低(P<0.01)，說明造模成功；與衰老模型組相比，富鋅富硒綠茶組及普通綠茶組Trx含量升高(P<0.01，P<0.05)；與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組Trx含量升高(P<0.05)，說明富鋅富鋅綠茶抗氧化作用強于普通綠茶；富鋅富硒綠茶高劑量組Trx含量高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；電鏡結(jié)果示衰老模型組肝細胞體積縮小，細胞核和細胞器損傷嚴重；富鋅富硒綠茶組肝細胞體積正常，細胞核和細胞器接近正常；普通綠茶組肝細胞胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張；陽性對照組胞質(zhì)內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)接近正常，胞漿輕微腫脹疏松，肝細胞核形態(tài)基本接近正常細胞核。結(jié)論： 貴州鳳岡富鋅富硒綠茶能明顯增加衰老模型小鼠血清Trx含量，具有延緩衰老的作用。

[關(guān)鍵詞]小鼠； 細胞結(jié)構(gòu)； 硫氧還蛋白； 衰老模型；富鋅富硒綠茶

衰老是生物隨著時間的推移而表現(xiàn)出的機能退行性變[1]。雖不可違背，但可以延緩[2]。肝臟是研究機體衰老的重要器官，其衰老主要表現(xiàn)在超微結(jié)構(gòu)的改變。硫氧還原蛋白(Trx)參與了機體的氧化還原反應(yīng)，能減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的細胞損傷[3]。有研究報道，貴州富鋅富硒綠茶中所含有的天然物質(zhì)成分對延緩衰老、殺菌、消炎等均有特殊效果[4]。本研究以腹腔注射D-半乳糖制備的衰老模型小鼠為研究對象，觀察貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對衰老小鼠血清中Trx含量的變化及肝臟超微結(jié)構(gòu)的改變，探討鳳岡富鋅富硒綠茶保肝抗衰老的機制。

1材料及方法

1.1材料

昆明雄性小鼠70只，體重18~25 g，購自貴陽醫(yī)學院動物中心[SCXK(貴)2007-004]。富硒富鋅綠茶由貴州鳳岡縣永安鎮(zhèn)田壩村生產(chǎn)，D-半乳糖(上海恒信化學試劑廠)，TRX ELISA (E03T0336，上海藍基生物科技有限公司)，透射電子顯微鏡(日本，HITACHI7650),酶標儀(北京新風，ZS-3型)，臺式高速冷凍離心機(湘儀貝克，TGL-20M)，37 ℃恒溫箱(天津泰斯特，202-2AB)。

1.2方法

1.2.1分組及造模70只小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)3 d，隨機均分為7組，正常對照組、衰老模型組、陽性對照組、富鋅富硒綠茶(高、中、低)組及普通綠茶組。正常對照組給予腹腔注射0.9%生理鹽水(0.01 mL/g)，其他各組腹腔注射D-半乳糖0.2 mg/(g·d)，連續(xù)6周復(fù)制小鼠衰老模型[5-6]，造模第3周正常對照組和衰老模型組均給予蒸餾水灌胃，其余5組分別給予維生素C(1 g/L)，高、中、低3種濃度富鋅富硒綠茶及普通綠茶灌胃，1次/d，連續(xù)4周。富鋅富硒綠茶按0.1 g/mL沸水沖泡30 min，過濾即為高濃度綠茶，對倍稀釋為中濃度綠茶，再次對倍稀釋即為低濃度綠茶；普通綠茶按0.1 g/mL沸水沖泡30 min即可。

1.2.2觀察指標最后1次灌胃后2 h處死小鼠，取眼眶血分離血清，用ELISA方法檢測Trx含量，電鏡觀察小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)[7]。小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察：取小鼠肝臟組織約1 mm3，4%戊二醛磷酸緩沖溶液固定， EPON-812環(huán)氧樹脂包埋、切片、甲苯胺藍染色、光鏡下定位、超薄切片、透射電子顯微鏡觀察。

1.3統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1血清Trx水平

與正常對照組相比，衰老模型組Trx含量明顯降低(P<0.01)，表明造模成功；與衰老模型組相比，富鋅富硒綠茶組及普通綠茶組Trx含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，提示綠茶均有抗氧化作用；與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組除低劑量組外Trx含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明富鋅富鋅綠茶抗氧化作用強于普通綠茶；富鋅富硒綠茶高劑量組Trx含量高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠血清Trx含量

(1)與正常對照組相比,P<0.01；與衰老模型組相比,(2)P<0.01，(3)P<0.05；(4)與普通綠茶組相比,P<0.05

2.2小鼠肝超微結(jié)構(gòu)

電鏡顯示正常對照組肝細胞核呈橢圓形，核膜平整光滑，無變形，細胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體，線粒體內(nèi)外膜及線粒體嵴較完整清晰可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有豐富核糖體附著(圖1-A)。衰老模型組肝細胞核體積較正常略有縮小且不規(guī)則，細胞核染色質(zhì)濃縮，電子密度增加，厚薄不均，細胞核異染色質(zhì)增多，染色加深；細胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，并有少量脂滴，可見細胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，并有輕度脫顆?，F(xiàn)象(圖1-B)。富鋅富硒綠茶高劑量(圖1-C)與陽性對照組(圖1-G)胞質(zhì)內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)接近正常，胞漿輕微腫脹疏松，肝細胞核形態(tài)基本接近正常細胞核。富鋅富硒綠茶中劑量組肝細胞胞質(zhì)內(nèi)部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，細胞核染色質(zhì)較均勻分布，余細胞質(zhì)中細胞器無明顯變化(圖1-D)。富鋅富硒綠茶低劑量(圖1-E)和普通綠茶組(圖1-F)肝細胞胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張。

A為正常對照組，B為衰老模型組，C、D、E分別為富鋅富硒綠茶高、中、低劑量組， F為普通綠茶組，G為陽性對照組圖1　各組小鼠肝組織電鏡下超微結(jié)構(gòu)Fig.1　EM pictures of liver tissue ultrastructure of mice in different groups

3討論

Trx是一類分布廣泛的小分子多功能蛋白，它的抗氧化作用是清除過氧化氫，也是GSH-PX的有效電子傳遞體，還能將被氧化的過氧化氫酶還原成單體[8]。硫氧還原蛋白還原酶(TrxR)是一種NADPH依賴的包含黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，分為TrxR-1～3，可催化NADPH 將Trx上的-S2還原成(-SH)2的反應(yīng)，維持Trx的還原型[3]。TrxR每個單體都含有1個調(diào)節(jié)氧化還原活性的二硫化物和1個FAD；TrxR在NADPH 的參與下調(diào)節(jié)多種底物的還原反應(yīng)，在氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中起重要的作用，TrxR和還原型TRX形成了一個有效的蛋白還原系統(tǒng)，具有重要的抗氧化損傷作用[9]，Trx功能如果受到抑制，就會導(dǎo)致氧化還原失衡，最終引起細胞凋亡[10]。本實驗中ELISA的實驗結(jié)果顯示與正常對照組相比，衰老模型組Trx含量明顯降低(P<0.01)，與本課題組前期研究抗氧化損傷指標一致[7]，表明該指標亦可用于鑒定衰老模型造模是否成功。本研究還發(fā)現(xiàn)，富鋅富硒綠茶組及普通綠茶組Trx含量均高于衰老模型組 (P<0.01，P<0.05)，說明綠茶有抗氧化損傷作用；而富鋅富硒綠茶組Trx含量高于普通綠茶組 (P<0.05)，證實了富鋅富鋅綠茶抗氧化作用強于普通綠茶；但在富鋅富硒綠茶，雖然高劑量組Trx含量高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

肝臟是機體物質(zhì)代謝的關(guān)鍵器官，肝細胞的損傷和凋亡是機體衰老的重要標志[11]。線粒體作為細胞內(nèi)能量合成的主要場所，產(chǎn)生的ATP是細胞內(nèi)的主要能量來源，其性狀改變與衰老過程密切相關(guān)。有研究報道，隨著年齡的增長，多種組織中線粒體功能都出現(xiàn)了衰退、包括線粒體數(shù)量的減少[12]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞中合成蛋白質(zhì)的主要場所，表面附著大量核糖體顆粒，細胞核內(nèi)的遺傳信息被帶到這里進行“翻譯”而合成蛋白質(zhì)。其數(shù)量及形態(tài)的改變標志著細胞衰老、損傷的程度[13]。本研究電鏡觀察結(jié)果顯示，衰老模型組肝臟超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯異常改變，主要表現(xiàn)為細胞核染色質(zhì)濃縮，體積相對縮小，細胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少。而富鋅富硒綠茶低劑量和普通綠茶組肝細胞胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，富鋅富硒綠茶中劑量組肝臟超微結(jié)構(gòu)明顯改善，高劑量組肝細胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常水平。說明貴州鳳岡富鋅富硒綠茶能明顯抑制衰老小鼠肝臟組織中細胞器的衰老、損傷改變，可能通過抗氧化機制發(fā)揮延緩衰老作用。

綜上所述，富鋅富硒綠茶能明顯增加衰老模型小鼠血清Trx含量，并抑制衰老導(dǎo)致的小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的異常變化，具有延緩衰老的作用。

參考文獻4

[1] 劉禮軍，杜萬紅.茶葉抗衰老機制研究進展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學, 2014(4)：2537-2539.

[2] 耿廣琴，楊雅麗,王晶，等. 黨參水提物對D-半乳糖致衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中醫(yī)研究, 2014(7)：70-73.

[3] 余燕,梅妍,田潤.硫氧還原蛋白在視網(wǎng)膜病變中的神經(jīng)保護作用[J].眼科新進展， 2013(9)：898-900.

[4] 侯彥喜. 綠茶與健康[J].開封大學學報, 1997 (3)：75-77.

[5] 朱慶磊,楊契,薛橋,等. 人工致衰老和自然衰老小鼠抗氧化能力改變的對比研究[J]．中國老年學雜志, 2003(7)：448-450．

[6] 余資江,應(yīng)大君,董世武,等. D-半乳糖急性致衰老動物模型劑量的探討[J]．解剖學雜志， 2005 (4):422-424．

[7] 申雪慧子,聶蘭,劉華,等.貴州鳳崗富鋅富硒綠茶對小鼠抗氧化能力的影響[J].貴陽醫(yī)學院學報, 2014(10)：642-651.

[8] 黃從發(fā),張文峰.硫氧還蛋白及其還原酶與腫瘤的關(guān)系[J].國際口腔醫(yī)學雜志, 2010(1)：59-64.

[9] 郁海靜, 丁士剛，張靜，等.血清硫氧還蛋白-1水平與幽門螺桿菌感染及胃粘膜病理改變的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學, 2012(9)：3015-3017.

[10]顏明，趙冰海,張春雷,等. 黃芩苷通過硫氧還原蛋白介導(dǎo)對SH-SY5Y 細胞保護作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報, 2013(10)：1278-1280.

[11]石變?nèi)A,莊曉燕,白秀珍.墨旱蓮水煎劑延緩肝臟衰老作用的研究[J].數(shù)理醫(yī)藥學雜志， 2010(3)：337-338

[12]趙金釵，黃向華．線粒體異常及損傷與衰老的相關(guān)性研究進展[J]．中國老年學雜志， 2013(22)：5767-5769．

[13]白瑜，周忠友, 張玉玲,等.中藥對衰老大鼠免疫功能的影響及肝細胞的電鏡觀察[J].新中醫(yī)， 2007(11)：104-106.

(2014-10-22收稿，2014-11-12修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

·基礎(chǔ)研究·

Influences of Green Tea with Rich Zn and Se from Fenggang County, Guizhou

Province on Trx Content and Liver Ultrastructure of Aging Model Mice

SHENXUE Huizi1, JU Xiaoyun2, YUE Lan2, LIU Hua1, WU Ning1,3

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;

2.SchoolofPharmacy,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.ExperimentCenterof

PhysicsandChemistry,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study the effect of Fenggang tea with rich Zn and Se on thioredoxin (Trx) content and liver ultrastructure of D-galactose-induced aging mice and to explore the mechanism of protecting liver and anti-aging of the tea. Methods: Seventy Kunming male mice (15~18 g) were randomly divided into control group, positive control group (Vitamin C), high, middle and low dose groups of zinc-rich and selenium-rich green tea (RZS tea groups), ordinary green tea group, and aging model group. Except control group, mice in all groups received intraperitoneal injection of 0.2 mg/(g·d) D-galactose to become aging mice model. In 3 weeks after model construction, RZS tea groups received intragastric administration of preset high, middle and low doses of zinc-rich and selenium-rich green tea. While positive control group, and ordinary green tea group received intragastric administration of Vitamin C and ordinary green tea respectively, and control group and aging model group received the same amount of saline. All intragastric administrations lasted four consecutive weeks, once per day. In 2 hours after the last administration, the orbital blood was taken for detection of Trx content by ELISA, and liver ultrastructure of mice was examined by electron microscope. Results: Compared with the control group, serum Trx content of aging model obviously decreased (P<0.01), which indicated the model was built successfully. Serum Trx contents in RZS tea groups were obviously higher than those of aging model group (P<0.01，P<0.05). Compared with ordinary green tea group, Trx content increased in RZS tea groups, showing the anti-oxidation effect of RZS tea was higher than that of ordinary tea. Among RZS tea groups Trx content in high dose group was higher than that in middle and low dose groups, but the differences were not significant (P>0.05). In aging model group, the volume of liver cells decreased. The cell nucleus and organelle of liver cell was seriously injuried. On the contrary, in RZS tea groups, the volume of liver cells was normal. The shape of cell nucleus and organelle of liver cell were close to that of normal control group. In ordinary green tea group, part of mitochondria in liver cytoplasm swelled and the endoplasmic reticulu expanded slightly. In positive control group, the structure of mitochondria and endoplasmic reticulu of liver cells was close to normal, and cytoplasm swelled and loosen slightly. The shape of liver cell nuclei was close to that of normal liver cell. Conclusions: Zinc-rich and selenium-rich green tea from Fenggang can increase serum Trx content in aging mice model and has some effects of anti-aging.

[Key words]mice; cellular structures; thioredoxin; aging model; green tea with rich Zn and Se

[中圖分類號]R151

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0013-04

通信作者**E-mail:1638210715@qq.com網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-01-13

[基金項目]*國家自然科學 (81260417)；貴州省科學技術(shù)基金[黔科合J字(2010)2216號，黔科合LG(2012)019號]