馮　海，張　瑩，俞　潔，榮　慧，朱俐俐

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

抗壞血酸作為還原劑制備免疫檢測(cè)用膠體金的工藝研究

馮海，張瑩，俞潔，榮慧，朱俐俐

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：探究了以抗壞血酸(AA)還原氯金酸(HAuCl4)來制備免疫檢測(cè)用膠體金的工藝條件.以粒徑及其分布為主要指標(biāo)，對(duì)制備過程中反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、溶液pH和n(AA)∶n(HAuCl4)四個(gè)影響因素進(jìn)行了研究，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到最優(yōu)制備工藝：n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，反應(yīng)時(shí)間為2 h，溫度為20 ℃，溶液pH=11.該條件下制得膠體金的粒徑為(45.73±2.41) nm，PDI=0.207±0.013.該制備條件溫和，所得膠體金的粒徑分布較窄，可以用于免疫檢測(cè).

關(guān)鍵詞：膠體金；抗壞血酸；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：O611.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2015)01-0083-04

The study of preparation technique of colloidal gold used in immunoassay

using ascorbic acid as a reducing agent

FENG Hai, ZHANG Ying, YU Jie, RONG Hui, ZHU Lili

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:The synthesis of colloidal gold used in immunoassay via the reduction of HAuCl4by ascorbic acid (AA) has been studied, with focus on the optimization of preparation technique. The effects of reaction time, temperature, pH and n(AA)∶n(HAuCl4) that influence the size and its distribution of colloidal gold have been studied by optimizing the preparation parameters through Box-Behnken Design RSM. The optimal conditions were found as follows: n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1, pH=11, and reacting under 20 ℃ for 2 hours. The size of gold nanoparticle we prepared was (45.73±2.41) nm, and PDI was 0.207±0.013. The colloidal gold nanoparticles are synthesized under mild condition and have a narrow size distribution, and can therefore be used for immunoassay.

Keywords:colloidal gold; ascorbic acid; RSM

金納米粒子(Gold nanoparticles, GNPs)，也叫膠體金，因其特殊的穩(wěn)定性、小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)及生物親和性等使之成為光學(xué)[1]、電子[2]、催化[3]、生物醫(yī)藥[4]和免疫檢測(cè)[5]等方面研究和應(yīng)用的熱點(diǎn).膠體金的這些應(yīng)用大多依賴于它們的粒徑、粒徑分布和形狀.如用于免疫層析檢測(cè)的膠體金為球形顆粒，粒徑通常在40 nm左右，粒徑分布窄[6].

迄今為止，已有多種金納米粒制備方法，包括化學(xué)還原法、相轉(zhuǎn)移法和反膠束法等.其中，化學(xué)還原法是可控制備各種尺寸和形狀的膠體金的方法，常用的還原劑有硼氫化鈉、檸檬酸鈉和鞣酸-檸檬酸鈉等.抗壞血酸與其他還原劑相比具有生物相容性好、毒性低等特點(diǎn)，但其制備免疫層析檢測(cè)用膠體金的報(bào)道較少.以AA作為還原劑制備膠體金，探究反應(yīng)條件對(duì)膠體金粒徑及其分布的影響.

1材料與方法

1.1試劑與儀器

氯金酸(上海三愛思試劑有限公司，AR)；抗壞血酸(廣東光華化學(xué)有限公司，AR)；恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；Zetasizer Nano ZS90納米激光粒度儀(英國馬爾文公司)；SpectraMax M2酶標(biāo)儀(美國分子儀器公司)；Tecnai G2透射電子顯微鏡(FEI公司).

1.2方法

1.2.1單因素考察

以抗壞血酸作為還原劑制備膠體金[7]，對(duì)反應(yīng)時(shí)間(0~180 min)、溫度(10~100 ℃)、溶液pH(3，6，7，8，11，12)及抗壞血酸與氯金酸摩爾比(n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)單因素進(jìn)行考察，每個(gè)水平重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次.

1.2.2制備工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度、n(AA)∶n(HAuCl4)和溶液pH為試驗(yàn)因素，以粒徑為指標(biāo)利用響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝.根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，按表1設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值.

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)的變量和水平

1.2.3分析方法

用酶標(biāo)儀記錄膠體金的可見光吸收光譜，用激光粒度儀測(cè)定膠體金的粒徑和粒徑分布，并用透射電子顯微鏡(TEM)表征膠體金的形貌和粒徑.

2結(jié)果與討論

2.1單因素考察

2.1.1反應(yīng)時(shí)間

由于膠體金的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)與粒徑相關(guān)，λmax越大平均粒徑越大，吸收峰寬越窄粒徑分布越窄.因此在反應(yīng)過程中，隔一定時(shí)間取1 mL反應(yīng)液測(cè)定可見光吸收光譜，光譜的峰形基本不變，可認(rèn)為已形成穩(wěn)定的膠體金.

1-0.5 min;2-1 min;3-2 min;4-4 min;5-6 min;6-8 min;7-10 min;8-30 min;9-60 min;10-120 min;11-180 min;12-0 min圖1　膠體金制備過程中可見光吸收光譜隨的變化Fig.1　Temporal evolution of UV-vis spectra of colloidal gold

從圖1可以看出：加入還原劑前，在可見光波長(zhǎng)范圍內(nèi)溶液無吸收峰.加入還原劑后立即出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰，λmax在550~600 nm之間，峰寬較寬.隨著反應(yīng)的進(jìn)行，吸收峰藍(lán)移，λmax落在500~550 nm范圍內(nèi)，同時(shí)峰寬不斷減小.120 min后λmax、峰寬基本不變，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為120 min.

2.1.2反應(yīng)溫度

溫度對(duì)金顆粒的成核、生長(zhǎng)，以及最終顆粒的穩(wěn)定都有影響.固定n(AA)∶n(HAuCl4)=2∶1，pH=7，反應(yīng)時(shí)間為2 h，以水浴控制溫度，研究10~100 ℃范圍內(nèi)溫度對(duì)抗壞血酸法制備膠體金的粒徑及其分布的影響.如圖2所示，反應(yīng)溫度為10 ℃時(shí)，粒徑最小，但PDI(即多分散性指數(shù))較大.隨著溫度的增加，膠體金的粒徑增大，30 ℃之后，溫度升高粒徑變化不大，而PDI增加.因此反應(yīng)溫度低于30 ℃較好.

2.1.3抗壞血酸與氯金酸的摩爾比

固定溫度為20 ℃，pH=7，反應(yīng)時(shí)間為2 h，探究n(AA)∶n(HAuCl4)對(duì)膠體金粒徑的影響.如圖3所示，n(AA)∶n(HAuCl4)對(duì)粒徑的影響顯著，n(AA)∶n(HAuCl4)增大，粒徑顯著增大(p<0.05)，但PDI無顯著差異.

2.1.4溶液pH

固定n(AA)∶n(HAuCl4)=2:1，反應(yīng)溫度為20 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH，探究其對(duì)膠體金粒徑的影響.如圖4所示，pH的影響比較復(fù)雜.當(dāng)pH=3時(shí)，粒徑較小，但PDI較大.pH增加，粒徑增大，但當(dāng)pH=11時(shí)，粒徑有所減小.

圖2　反應(yīng)溫度對(duì)膠體金粒徑及粒徑分布的影響Fig.2　Size and size distribution of colloidal gold prepared with different temperature

圖3　n(AA)∶n(HAuCl4)對(duì)膠體金粒徑及粒徑分布的影響Fig.3　Size and size distribution of colloidal gold prepared with different n(AA)∶n(HAuCl4) ratios

圖4　pH對(duì)膠體金的粒徑及其分布的影響Fig.4　The variation in the size and size distribution of colloidal gold as a function of the pH

2.2制備工藝優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

利用Design-Export 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析，以粒徑R為主要響應(yīng)指標(biāo)，結(jié)合PDI的大小綜合評(píng)價(jià)膠體金的質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示.

表2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及響應(yīng)值結(jié)果

Table 2The experiment design and result of response surface method

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABC/℃R/nmPDI1231035.070.3342133041.790.3663273083.370.1564273088.030.1855371072.400.2056375091.380.21671113055.260.1908333059.000.3189235058.280.242102115081.400.202112111049.730.164123113072.910.23113273089.310.16814175066.690.24115171049.280.22316273086.410.17417273087.100.191

結(jié)果經(jīng)二次多項(xiàng)式擬合，并對(duì)各項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.最終擬合方程為

R=-76.417 98+41.125 50A+20.185 03B+1.698 11C+0.027 500AB+0.019 625AC+0.026 438BC-7.893 25AA-1.356 92BB-0.022 533CC

方程擬合顯著(p<0.000 1)，失擬值和純誤差較小，R2=0.981 9，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.72，變異系數(shù)小(5.42%)，說明該模型可靠，可用于抗壞血酸法制備條件的優(yōu)化.

圖5為以粒徑為響應(yīng)值時(shí)各因素的響應(yīng)面圖，n(AA)∶n(HAuCl4)和pH及n(AA)∶n(HAuCl4)和溫度交互作用顯著，pH和溫度交互作用不明顯.

2.2.2最優(yōu)工藝的確定

通常用于免疫層析檢測(cè)的膠體金直徑在40 nm左右，因此選擇粒徑30~50 nm且PDI<0.25為條件，同時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性，最終優(yōu)化結(jié)果是：n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，pH=11，反應(yīng)溫度為20 ℃.在該條件下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，所得膠體金粒徑為(45.73±2.41) nm，PDI=0.207±0.013，與預(yù)測(cè)值(47.81 nm)相差不大.樣品的TEM照片如圖6所示，膠體金顆粒多為球形，平均粒徑為39.82 nm，RSD為8.8%.

表3　響應(yīng)值R的二次多項(xiàng)式模型的方差分析1)

注：1)**為p<0.01,***為p<0.001.

圖5　n(AA)∶n(HAuCl4)，pH和溫度對(duì)膠體金粒徑影響的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface plots for the effect of n(AA)∶n(HAuCl4), pH and temperature on the size of colloidal gold

圖6　膠體金的TEM照片及其粒徑分布Fig.6　TEM images and size distribution diagrams of colloidal gold

3結(jié)論

以抗壞血酸作為還原劑，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、溶液pH、n(AA)∶n(HAuCl4)等都會(huì)影響膠體金的質(zhì)量.在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇n(AA)∶n(HAuCl4)、溫度、pH進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到最優(yōu)制備工藝：n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，反應(yīng)時(shí)間為2 h，溫度為20 ℃，pH=11.最優(yōu)條件下制得的膠體金粒徑為(45.73±2.41)nm，PDI=0.207±0.013，TEM觀察到金顆粒粒徑均一，顆粒形狀多為球形.該方法簡(jiǎn)便、條件溫和，制得的膠體金粒徑分布較窄，可用于免疫層析檢測(cè).

參考文獻(xiàn)：

[1]JING Li, YU Zhangbin, DU Weidong, et al. Development of a fluorescent and colorimetric detection methods-based protein microarray for serodiagnosis of TORCH infections[J]. Biosensors and Bioelectronics,2008,24(3):376-382.

[2]倪哲明,張峰,胡軍,等.具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬軟磁納米復(fù)合材料的研究進(jìn)展[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,37(3):246-250.

[3]WITTSTOCK A, ZIELASEK V, BIENER J, et al. Nanoporous gold catalysts for selective gas-phase oxidative coupling of methanol at low temperature[J]. Science,2010,327(5963):319-322.

[4]袁巨龍,劉盛輝.納米技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展動(dòng)向[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,28(3):243-249.

[5]張紹庚,段躍強(qiáng),張德璽，等.膠體金免疫層析試紙條快速檢測(cè)乙型流感病毒[J].免疫學(xué)雜志,2012,28(11):981-984.

[6]CHANDLER J, GURMIN T, ROBINSON N. The place of gold in rapid tests[J]. IVD Technology,2000,6(2):37-49.

[7]TYAGI H, KUSHWAHA A, KUMAR A, et al. pH-dependent synthesis of stabilized gold nanoparticles using ascorbic acid[J]. International Journal of Nanoscience,2011,10(4/5):857-860.

(責(zé)任編輯：劉巖)

作者簡(jiǎn)介：馮海(1973—)，男，浙江杭州人，副教授，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬团c新技術(shù)，E-mail:fenghai289289@163.com.

收稿日期：2014-10-20