姜夢云，洪濱，楊曉霞，高玉琛，趙鵬，馬永生，劉俊榮

(1．大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023;2．中華人民共和國大連出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116600)

2013年中國魚類海洋捕撈量達871．77萬 t，其中海產(chǎn)低值魚 (鳀、藍(lán)圓鲹、金線魚等)總產(chǎn)量為 223．5 萬 t，約占 25．64%［1］。低值魚的利用主要是針對魚蛋白，主要有食用和飼用兩種途徑，其共同目的是提高低值魚蛋白原料的附加值。吳忠等［2］對低值魚分離蛋白的凝膠性進行了綜述。而就飼用而言，主要有兩種途徑，一是用于養(yǎng)殖業(yè)直接投喂，二是加工成魚粉、魚油后，經(jīng)飼料加工業(yè)再用于養(yǎng)殖業(yè)。

鳀是鳀屬Engraulis魚類的統(tǒng)稱，根據(jù)FAO［3］公布的《The State of World Fisheries and Aquaculture 2014》數(shù)據(jù)表明，在海洋捕撈量前十的魚種中，秘魯鳀Engraulis ringens和日本鳀Engraulis japonicus分別位列第一和第九。鳀主要分布于南北半球溫帶水域，中國黃海和東海海域含有豐富的鳀魚資源。近30年來，隨著魚粉工業(yè)的快速發(fā)展，鳀大多被加工成普通魚粉作為魚禽飼料［4］。目前中國鳀魚捕獲量逐年下降，且幼魚比例越來越高，趨于崩潰態(tài)勢;此外，魚粉作為魚蛋白的大宗利用形式，其對低值魚蛋白資源價值的挖掘極其有限，因此，進一步開發(fā)高附加值功能性生物蛋白制品，將有利于中國鳀魚資源的高效利用。

國際上，一般利用低值魚、水產(chǎn)加工副產(chǎn)物制備生物蛋白制劑來提高魚蛋白附加值。法國學(xué)者Ghorbel等［5］以沙丁魚為原料，使用堿性蛋白酶、中性蛋白酶制備的脫脂沙丁魚肉蛋白水解物，可以為米曲霉的生長提供氮源并且產(chǎn)生脂肪酶。巴西學(xué)者Vieira等［6］研究了巴西異鱗石首魚的魚片廢棄物，水解后冷凍干燥，凍干產(chǎn)物可以作為大腸桿菌培養(yǎng)基。本研究中，從中國鳀魚資源的高附加值利用為出發(fā)點，以開發(fā)生物蛋白制品為目標(biāo)，對功能性生物魚蛋白制品進行初步探索，對于實現(xiàn)海洋資源高效利用具有重要的研究價值，對于尋找海洋動物源培養(yǎng)基具有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用原料為鳀Engraulis ringens魚蛋白濃縮制品即蒸汽魚粉，由秘魯Copeinca公司生產(chǎn)。

試劑主要有:MRS培養(yǎng)基、牛肉膏、LB培養(yǎng)基 (北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)、酵母膏、胰蛋白胨 (英國Oxoid公司)、商品魚蛋白胨 (國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、堿性蛋白酶 (美國Genencor公司)和風(fēng)味蛋白酶 (丹麥Novozymes公司)。

設(shè)備與儀器主要有:SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、ZWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智城分析儀器制造有限公司)、LDZX-30FB立式壓力蒸汽滅菌器 (上海申安醫(yī)療器械廠)、PHS-3C精密pH計 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司)、JJ-1精密增力電動攪拌器 (常州國華電器有限公司)、GL-21M高速冷凍離心機 (長沙湘儀離心機儀器有限公司)、721型可見分光光度計 (上海光譜儀器有限公司)、QZR-5移動式高速離心噴霧干燥機 (江蘇省無錫市林州干燥機)。

1.2 方法

1．2．1 水解魚蛋白的制備 準(zhǔn)確稱取魚粉100 g，按1∶4加入蒸餾水，添加風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶各0．5%，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8后，置于55℃水浴中酶解6 h;再將酶解產(chǎn)物置于85℃水浴中15 min后，于10 000 g下離心10 min，棄上層漂浮油脂及底部沉淀，采用硅藻土對所得酶解液過濾兩次后得到水解魚蛋白 (hydrolyzed fish protein，HFP)，進一步經(jīng)噴霧干燥得到濃縮分離的水解魚蛋白 (hydrolyzed fish protein isolate，HFPI)。

(1)水解度。酶解起始和結(jié)束時分別取酶解產(chǎn)物15 mL，滅酶活后離心，取酶解液5 mL，加蒸餾水定容至100 mL，根據(jù)甲醛滴定法測定酶解液中氨基態(tài)氮的含量［7］，用凱氏定氮法測定魚粉的總氮含量。水解度的計算公式為

(2)得率。酶解產(chǎn)物滅酶活后，分別取離心前后各2 mL進行水分含量的測定。水解魚蛋白得率計算公式為

(3)蛋白質(zhì)回收率。計算公式為

1．2．2 水解魚蛋白分析

(1)溶解性。將用硅藻土處理后得到的水解魚蛋白 (HFP)用蒸餾水稀釋至1%。取稀釋液10 mL用0．5 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH為3、4、5、6、7、8、9、10，每個 pH組設(shè)3個平行。靜置30 min后，以蒸餾水為空白，用721型可見分光光度計測量410 nm處的吸光度。

(2)一般化學(xué)組成。采用GB 5009．3—2010直接干燥法測定水分含量，采用GB 5009．4—2010測定灰分含量，采用GB/T 5009．6—2003索氏抽提法測定脂肪含量，采用GB 5009．5—2010凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量。

(3)色度。使用CR-410色彩色差儀來測定水解魚蛋白 (HFPI)以及魚粉 (FM)的色度，每個樣品測量3次。白度計算公式為

其中:L為樣品的亮度，即從黑 (0)到白 (100)的顏色;a為紅度 (+)或綠度 (-);b為黃度(+)或藍(lán)度 (-)。

(4)礦物質(zhì)與重金屬。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法，對最終產(chǎn)物即水解魚蛋白 (HFPI)中的Zn、Cu、Ca、Na、Mg、K和 Mn等礦物質(zhì)元素含量，以及Pb、Cr和Cd等重金屬元素的含量進行分析。

1．2．3 微生物培養(yǎng) 選擇牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、商品魚蛋白胨和所制備的水解魚蛋白 (HFPI)做對比，培養(yǎng)菌分別為大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、保加利亞乳酸桿菌Lactobacillus bulgaricus和釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae。用LB培養(yǎng)基先對大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌隔夜振蕩培養(yǎng)，用MRS培養(yǎng)基對乳酸桿菌隔夜振蕩培養(yǎng)，各取1 mL 4種菌的菌懸液接種到100 mL自制水解魚蛋白濃縮產(chǎn)物培養(yǎng)基中，35 ℃下振蕩培養(yǎng)，在 0．5、1、1．5、2、3、4、5、6、7、8、24 h時測定OD600nm值。同樣方法繼續(xù)用其余4種市購蛋白胨對微生物進行培養(yǎng)，繪制出生長曲線，并計算比生長速率以及代時［8］。比生長速率 (μmax)、代時 (td)計算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用Excel 2007軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解魚蛋白的理化特性

2．1．1 基本化學(xué)組成 在設(shè)定條件下，經(jīng)6 h酶解處理，得到水解產(chǎn)物的水解度為6．55%，水解魚蛋白 (HFPI)得率為59．53%，蛋白回收率為64．61%(表1)。從表1可見，殘渣中仍然殘留很多蛋白質(zhì) (59．08%)，可以通過對試驗中的酶解條件進行優(yōu)化解決，或者針對酶解殘渣尋求新的利用途徑;殘渣中的脂肪含量過高 (15．82%)，可能是由于對酶解產(chǎn)物離心后，部分脂肪懸掛在離心管內(nèi)壁上，和殘渣一起被取出。而水解蛋白濃縮產(chǎn)物中的脂肪含量最低 (0．52%)，證明了酶解脫油效果強，用硅藻土脫油效果好，這點在實際試驗過程中也能通過肉眼判斷。Shahidi等［9］在研究毛鱗魚水解產(chǎn)物時也發(fā)現(xiàn)，使用堿性蛋白酶酶解可以使油脂含量顯著下降。然而，本試驗中水解魚蛋白(HFPI)的粗蛋白質(zhì)、灰分和脂肪相加不足100%，這是由于水解魚蛋白吸水性強，與空氣接觸后立即聚集成結(jié)塊，從而導(dǎo)致干基質(zhì)量變大。與魚粉相比，水解魚蛋白 (HFPI)的粗蛋白質(zhì)含量升高，雜質(zhì)明顯下降。

表1 魚粉、殘渣、水解魚蛋白 (HFPI)的基本成分Tab.1 Proximate composition of fish meal，residues，and hydrolyzed fish protein isolate(HFPI) %

2．1．2 水解魚蛋白色度分析 圖1為魚粉和水解魚蛋白 (HFPI)，表2為色差分析結(jié)果。由此看出，水解魚蛋白較魚粉白度有較大提高，這可能是因為脫脂使其中的色素被去除，從而使顏色變淺。

2．1．3 礦物質(zhì) 水解魚蛋白 (HFPI)的礦物質(zhì)和重金屬元素組成中，K、Ca、Na、Mg、Zn、Cu、Mn、Pb、Cd、Cr 濃 度 分 別 為 235．00、9．80、540．90、19．09、1．75、0．17、0．03、0．16、0．12、0．18 mg/L?？梢园l(fā)現(xiàn)，所制備的功能性水解魚蛋白 (HFPI)不僅含有 K、Ca、Na、Mg、Zn、Cu和Mn等礦物質(zhì)元素，還含有微量的Pb、Cd和Cr等重金屬元素，這可能是由原料魚粉中存留所致。

圖1 鳀分離魚蛋白 (HFPI)Fig.1 Anchovy fish protein isolate(HFPI)

表2 水解魚蛋白 (HFPI)和魚粉色差分析Tab.2 Color analysis of fish meal and hydrolyzed fish protein isolate(HFPI)

圖2 pH對水解魚蛋白 (HFP)溶解度的影響Fig.2 Effects of pH on solubility of hydrolyzed fish protein(HFP)

2.2 水解魚蛋白對微生物的促生長特性

2．2．1 對微生物的適應(yīng)范圍 圖2為水解魚蛋白(HFP)在不同pH條件下的溶解度曲線。從圖2可見:在低 pH范圍內(nèi) (pH＜5)，水解魚蛋白(HFP)開始出現(xiàn)渾濁，溶解性明顯下降;當(dāng)pH＞5時，水解魚蛋白 (HFP)保持穩(wěn)定狀態(tài)。理論上，水解魚蛋白是兩性的，在極端pH條件下應(yīng)促進溶解性，這里出現(xiàn)反常，據(jù)推測可能是由于離子強度的干擾所致，在pH調(diào)節(jié)過程中，酸性范圍離子強度逐漸增加，從而導(dǎo)致水解魚蛋白 (HFP)發(fā)生聚集且呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)。Klompong等［10］在研究黃色條紋鲹的蛋白水解產(chǎn)物時也發(fā)現(xiàn)了水解物的溶解度在低pH時較差。由此可以推斷，此水解魚蛋白產(chǎn)物不適宜用來培養(yǎng)嗜酸微生物。

2．2．2 對4種微生物的促生長作用 為驗證水解魚蛋白 (HFPI)是否具備微生物促生長功能，以水解魚蛋白 (HFPI)為對照樣與商品微生物培養(yǎng)基進行比較，選用的4種商品微生物培養(yǎng)基包括牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨和商品魚蛋白胨。

選擇大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、保加利亞乳酸桿菌和釀酒酵母菌4個菌種進行微生物效應(yīng)分析。其中圖3～圖6分別為4種菌的生長曲線，表4為根據(jù)生長曲線計算出的代時比生長速率。從圖3～圖6可見，與4種商品培養(yǎng)基相比，水解魚蛋白(HFPI)具有同樣的促微生物生長特性;4種菌均在2 h左右進入指數(shù)增長期，8 h左右進入穩(wěn)定期。從圖4和圖6的生長曲線不難發(fā)現(xiàn):水解魚蛋白(HFPI)在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌及釀酒酵母上和商品魚蛋白胨接近;在培養(yǎng)保加利亞乳酸桿菌上，水解魚蛋白 (HFPI)與其他商品蛋白相比效果較優(yōu)(圖5)。Safari等［11］在利用黃鰭金槍魚頭部廢棄制備微生物培養(yǎng)基的研究中發(fā)現(xiàn)，利用堿性蛋白酶酶解得到的水解魚蛋白可以作為保加利亞乳酸桿菌等乳酸菌的氮源。從代時和比生長速率可以看出(表4)，水解魚蛋白(HFPI)與4種商品培養(yǎng)基均有相同效果。這與Aspmo等［12］利用大西洋鱈魚內(nèi)臟水解物作為微生物培養(yǎng)基成分的研究結(jié)果相似。

表4 4種微生物生長的代時和比生長速率Tab.4 Specific growth rate and generation time of 4 species of microorganisms

圖3 大腸桿菌生長曲線Fig.3 Growth curves of Escherichia coli

圖4 枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.4 Growth curves of Bacillus subtilis

圖5 保加利亞乳酸桿菌生長曲線Fig.5 Growth curves of Lactobacillus bulgaricus

圖6 釀酒酵母菌生長曲線Fig.6 Growth curves of Saccharomyces cerevisiae

3 結(jié)語

基于酶解修飾的功能性鳀分離魚蛋白，得到的濃縮水解魚蛋白 (HFPI)具備以下幾個優(yōu)勢:蛋白純度明顯提高，脫脂效果良好，白度提高，且質(zhì)地細(xì)膩。就微生物生長來看，除嗜酸微生物外，該水解魚蛋白對枯草芽孢桿菌、保加利亞乳酸桿菌、大腸桿菌和釀酒酵母菌等微生物的促生長效果均顯著。因此，具有微生物培養(yǎng)基功能的分離魚蛋白，是提高低值魚類附加值的有效解決途徑之一。本研究表明，對鳀魚粗分離蛋白進一步進行功能性修飾，可以獲得具有更高附加值的功能性魚蛋白制品。本研究的出發(fā)點在于探索具有促微生物生長功能性的魚蛋白，并未針對酶解條件進行優(yōu)化，今后應(yīng)在此方面進一步探討。

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