王釗，王好，錢愛東，周井祥，馬悅，祖岫杰，李改娟，劉慧吉，劉艷輝

(1．吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118;2．吉林省水產科學研究院，吉林長春130033)

異育銀鯽Carassius auratus gibelio是由方正銀鯽為母本與興國紅鯉為父本雜交得到的一種重要經濟魚類，經過人工培育近30年，年產量近2億t，全國范圍內均有飼養(yǎng)，具有重要的經濟價值。由于異育銀鯽幼魚對洪湖碘泡蟲的侵襲缺乏抗性［1］，因此，由洪湖碘泡蟲引起的碘泡蟲病嚴重影響了該經濟魚類的商品價值。洪湖碘泡蟲Myxobolus honghuensis首次報道于洪湖市，而且南方地區(qū)為洪湖碘泡蟲病的高暴發(fā)區(qū)，給南方淡水魚養(yǎng)殖造成了巨大的經濟損失。碘泡蟲種類繁多，其屬下的諸多種類碘泡蟲均能引起魚類寄生蟲疾病，治療的方法也不盡相同;此外，碘泡蟲感染部位與引起的患病外觀變化大同小異，而且不同種類的蟲體外觀又比較相似，在沒有分子生物學數據作為佐證的前提下，形態(tài)學鑒定與發(fā)病外觀觀察不足以確診病原［2］。目前，很多學者開始重視并研究這種寄生蟲，早在1991年，Landsberg等首次報道了444種碘泡蟲［3］，2005年 Erias等［4］報道了 744種，2006年 Lom等［5］報道了792 種，2011 年 Molnár［6］報道了近 850種碘泡蟲。碘泡蟲的種類繁多表明了這一屬的物種具有多樣性［7］，同時給該病的診斷也帶來了一定的困難。

近年來，通過免疫學方法對該病病原的檢測已經有所研究。早在 2003年，Lu等［8］使用一種MAb2D12單克隆抗體對圓形碘泡蟲不同發(fā)育期分別進行了ELISA、斑點免疫、間接免疫熒光抗體檢測，均獲得較高的陽性率，這表明使用單抗對黏孢子蟲進行早期檢測是可行的。張晉勇等［9］應用噬菌體展示技術成功獲得一株對圓形碘泡蟲可溶性抗原具有特異性結合能力的單克隆抗體PCAN-H69，對該抗體和其他幾株篩選后的單克隆抗體進行競爭ELISA試驗，表明只有該抗體擁有很高的抑制率(88．17%)，證明這種抗體具有很強的特異性，適合用作早期感染的特異性診斷。賈洛等［10］研究了洪湖碘泡蟲的免疫原性并研制了相關的多抗與三株單抗，經過試驗證明，這些抗體均具有很強的診斷意義。這些研究表明，采用免疫學檢測技術對黏孢子蟲進行早期診斷是可行的。但由于黏孢子蟲的種類繁多，種間的相似抗原較多，容易引起大量的交叉反應［11］，影響檢測結果的特異性，目前對該病的早期免疫檢測僅停留在試驗階段。而采用分子生物學方法對碘泡蟲的鑒定則顯得更為精確可行［12］，通過分析病原體的18S rDNA序列特異性，再與其他已知種類序列進行比對，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，得到的生物信息學數據可為形態(tài)鑒定結果提供重要佐證［13］。

2015年6月初，由于東北地區(qū)氣溫升高降雨頻繁，位于吉林省境內的查干湖某淡水魚養(yǎng)殖基地有異育銀鯽魚苗出現游動乏力、攝食減少、浮頭消瘦等現象。吉林農業(yè)大學動物科學技術學院重點實驗室研究人員從該養(yǎng)殖基地采集病魚，經過初步觀察發(fā)現，病魚眼球突出，鰓蓋下近眼端位置的咽部充血腫大，可見白色腫塊。該養(yǎng)殖基地水體混濁，水溫為24．3℃，初步確定為寄生蟲感染所致。為進一步診斷該病病原，筆者對蟲體進行了形態(tài)學觀察、可量形狀測定、生物信息學分析，旨在為東北地區(qū)碘泡蟲病的發(fā)現與防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

異育銀鯽病魚采自吉林省境內的查干湖某淡水魚養(yǎng)殖基地，共20尾，體質量為5～10 g，暫養(yǎng)在吉林農業(yè)大學動物科學技術學院消毒水族室中。

1.2 方法

1．2．1 病魚體外癥狀觀察 觀察病魚整體發(fā)病狀態(tài)。將病魚鰓蓋沿鰓弓線慢慢剪開，使整個鰓弓暴露在外，觀察咽部病變狀態(tài)。

1．2．2 蟲體形態(tài)學觀察及可量形狀測定 參照Zhang等［14］的方法從異育銀鯽魚苗咽部采集碘泡蟲的包囊，再將分離后的蟲體進行固定保存［15］，對蟲體進行形態(tài)學觀察［16］，隨機選取20個成熟孢子進行測量，使用裝有微米標尺的奧林巴斯E-330顯微鏡數碼照相機的奧林巴斯IX51顯微鏡進行測量與觀察，獲取成熟孢子的數字化照片與孢子尺寸數值。所得測量結果與Liu等［17］報道的洪湖碘泡蟲進行對比，并參照照片繪制蟲體圖片。

1．2．3 蟲體基因組提取及目的片段的克隆、測序 采用腦穿刺法迅速將魚處死，將分離的包囊進行勻漿，采用蔗糖密度梯度離心法制得純化的蟲體［18］，置于1．5 mL 離心管中，加入 500 μL 裂解液 (100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris pH 7．6，10 mmol/L EDTA，0．2%SDS)煮沸10 min，使大部分蟲體脫殼后冷卻至室溫，再加入500 μL新鮮的裂解液與20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，55℃下水浴12 h以上，使用酚-氯仿-異戊醇法抽提基因組。使用的引物為碘泡蟲18S rDNA通用引物MX3/MX5(CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA/CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT)。PCR反應體系:10×buffer 2．5 μL，引物 (20 μmol/L)各 0．5 μL，dNTP(40 μmol/L)1 μL，模板 DNA 2 μL(100 ng)，Ex Taq DNA 聚合酶 (TaKaRa)0．2 μL，最后加滅菌雙蒸水使反應總體積為25 μL(膠回收反應體系以上各試劑用量加倍，使終體積為50 μL)。反應在Eppendorf AG 22331 Hamburg梯度PCR儀中進行，PCR反應程序:95℃下預變性5 min;95℃下變性30 s，63．7℃下退火復性30 s，72℃下延伸1 min，共進行35個循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存。膠回收產物經過10 g/L瓊脂糖充分分離后，切下目的條帶使用AxyGen膠回收純化試劑盒純化后連接至PMD-18T載體中，經酶切鑒定后提交至上海生物工程股份有限公司進行測序，結果在GenBank上進行序列比對。

1．2．4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用DNAStar Lasergene 7．1軟件分析序列相應屬性，采用 ClustalⅣ對GenBank中已知洪湖碘泡蟲18S rDNA保守序列與本試驗克隆的序列進行對比分析，應用MegAlign模塊構建該分離株與15種常見碘泡蟲的系統(tǒng)進化關系樹，分析待鑒定碘泡蟲與其他碘泡蟲的系統(tǒng)進化關系。

2 結果與分析

2.1 病魚體外癥狀觀察

病魚外觀消瘦，體表粗糙，顏色蒼白，黏液分泌較少，眼球外凸。鰭條和腹部鱗片等處有出血點與潰瘍。鰓蓋下鰓弓近眼端的咽喉部存在大片乳白色囊腫，囊腫質地較軟易破，囊膜較薄，內含干酪樣黏稠包囊液。病魚癥狀詳見圖1。

圖1 病魚臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of sick fish

2.2 蟲體形態(tài)學觀察及可量形狀測定

孢子正面觀呈梨形，縫面觀呈梭形，擁有兩個極囊，大小不一，少數存在尾突 (圖2)。孢子的形態(tài)測量數據見表1，根據顯微圖繪制的模擬圖見圖3。

圖2 蟲體形態(tài)圖Fig.2 The morphology of the parasite

2.3 生物信息學分析

克隆所得的片段大小約為750 bp(圖4)，測序結果顯示，其大小為727 bp。Blast比對分析結果顯示，與GenBank登錄號為JF340216的洪湖碘泡蟲的同源性達到99%。使用DNAStar中的ClustalⅣ對克隆片段與已知洪湖碘泡蟲的基因序列進行比對分析，結果顯示，同源性為99．3%，發(fā)現第697號堿基發(fā)生突變，第14號堿基處發(fā)生缺失，第704號位置增多一個堿基 (圖5)。

圖3 蟲體模擬圖Fig.3 The simulated diagram of the parasite

圖4 蟲體18S rDNA PCR產物電泳圖Fig.4 The 18S rDNA electrophoretogram of the parasite

圖5 蟲體18S rDNA保守序列比對結果Fig.5 The 18S rDNA conservative sequence alignment of the parasite

表1 待檢寄生蟲與洪湖碘泡蟲顯微測量數據對比Tab.1 The morphometric comparison of the parasite sample with Myxobolus honghuensis μm

采用MegAlign模塊構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該碘泡蟲分離株與GenBank中登陸號為JF340216的洪湖碘泡蟲位于同一進化分支 (圖6)。

圖6 基于該寄生蟲18S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequence of the parasite

3 討論

通過觀察病魚外觀，得出發(fā)病癥狀與碘泡蟲感染相同。經過對蟲體的形態(tài)學分析，進一步得出該蟲與洪湖碘泡蟲的顯微結構極為相似，其尺寸數據與洪湖碘泡蟲也較為接近，可以初步診斷為洪湖碘泡蟲感染。采用該蟲的18S rDNA序列對其進行分子生物學分類研究與鑒定，基于18S rDNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，得出該蟲與洪湖碘泡蟲的遺傳距離最為接近，位于進化樹的同一分支，進一步確診為洪湖碘泡蟲感染。

碘泡蟲早期感染較為隱蔽，常規(guī)的檢測并不能充分確診感染病原體［11］。在寄生蟲領域內，應用分子生物學技術對病原進行詳細分析在近些年頗為流行，得到的結果較為客觀、可靠，尤其對于外觀難以鑒別、品種繁多的黏孢子蟲來說，可以作為鑒定試驗中的有力證據，為常規(guī)的鑒定提供了重要的輔助手段［19］。洪湖碘泡蟲多寄生于南方地區(qū)異育銀鯽上，常引起大規(guī)模碘泡蟲疾病。本實驗室研究人員首次在東北地區(qū)確診一例早期感染洪湖碘泡蟲的異育銀鯽病例，這表明洪湖碘泡蟲可跨地域傳播，并具有較強的環(huán)境適應能力。本研究中的鑒定結果可為東北地區(qū)碘泡蟲的防治提供參考資料。

目前，對于碘泡蟲的感染機制與生活史尚不清楚，對處于孢子期的蟲體仍無有效的殺滅藥物。但魚類在發(fā)生疾病后，免疫系統(tǒng)會發(fā)生一系列應激反應，其中非特異性免疫系統(tǒng)是機體抵抗疾病的第一道防線［20］。因此，增強魚類非特異性免疫力與感染的早期診斷對于該病的防治來說同樣重要。筆者建議東北地區(qū)飼養(yǎng)異育銀鯽時每年入春與入冬前期定期殺滅養(yǎng)殖池內的螺類與寡毛類中間宿主，改良水質，定期飼喂免疫增強劑，盡量將蟲體遏制在感染的早期，并保持養(yǎng)殖環(huán)境良好，避免交叉感染。

［1］李林思，黃麗萍，邵汝強．異育銀鯽粘孢子蟲病調查［J］．水產養(yǎng)殖，2008(5):40-42．

［2］Liu Y，Whipps C M，Nie P，et al．Myxobolus oralis sp．n．(Myxosporea:Bivalvulida)infecting the palate in the mouth of gibel carp Carassius auratus gibelio(Cypriniformes:Cyprinidae)［J］．Folia Parasitologica，2014，61(6):505-511．

［3］Eiras J C，Zhang J，Molnar K．Synopsis of the species of Myxobolus Bütschli，1882(Myxozoa:Myxosporea:Myxobolidae)described between 2005 and 2013［J］．Systematic Parasitology，2014，88(1):11-36．

［4］Eiras J C，Molnár K，Lu Y S．Synopsis of the species of Myxobolus Bütschli，1882(Myxozoa:Myxosporea:Myxobolidae)［J］．Syst Parasitol，2005，61(1):1-46．

［5］Lom J，Dyková I．Myxozoan genera:definition and notes on taxonomy，life cycle terminology and pathogenic species［J］．Folia Parasitol，2006，53(1):1-36．

［6］Molnár K．Remarks to the validity of GenBank sequences of Myxobolus spp．(Myxozoa，Myxosporidae)infecting Eurasian fishes［J］．Acta Parasitol，2011，56(3):263-269．

［7］Szekely C，Molnár K，Cech G．Description of Myxobolus balatonicus n．sp．(Myxozoa:Myxobolidae)from the common carp Cyprinus carpio L．in Lake Balaton［J］．Systematic Parasitology，2015，91(1):71-79．

［8］Lu Y S，Nie P，Sun B J．Detection of Myxobolus rotundus(Myxozoa:Myxosporea)in skin mucus of crucian carp Carassius auratus auratus using a monoclonal antibody［J］．Diseases of Aquatic Organisms，2003，54(2):171-173．

［9］章晉勇，汪建國，李明，等．圓形碘孢蟲單鏈抗體庫的篩選與陽性克隆特征分析［J］．水生生物學報，2008，32(4):568-578．

［10］賈洛，翟艷花，柳陽，等．洪湖碘泡蟲(粘體動物門、粘孢子綱)單克隆抗體的制備及免疫原性分析［D］．?？?海南大學，2013:206．

［11］Gomez D，Bartholomew J，Sunyer J O．Biology and mucosal immunity to myxozoans［J］．Developmental and Comparative Immunology，2014，43(2):243-256．

［12］Vasoo S，Pritt B S．Molecular diagnostics and parasitic disease［J］．Clinics in Laboratory Medicine，2013，33(3):461-503．

［13］Szekely C，Borkhanuddin M H，Cech G，et al．Life cycles of three Myxobolus spp．from cyprinid fishes of Lake Balaton，Hungary involve triactinomyxon-type actinospores［J］．Parasitology Research，2014，113(8):2817-2825．

［14］Zhang J Y，Wang J G，Wu Y S，et al．A combined phage display ScFv library against Myxobolus rotundus infecting crucian carp，Carassius auratus auratus(L．)，in China［J］．Journal of Fish Diseases，2006，29(1):1-7．

［15］竹攸汀．異育銀鯽皮膚粘孢子蟲病的病原和組織病理研究［D］．上海:上海海洋大學，2012．

［16］Lom J，Dyková I．Fine structure of Triactinomyxon early stages and sporogony:myxosporean and actinosporean features compared［J］．Protozool，1992，39(1):16-27．

［17］Liu Y，Whipps C M，Gu Z M，et al．Myxobolus honghuensis n．sp．(Myxosporea:Bivalvulida)parasitizing the pharynx of allogynogenetic gibel carp Carassius auratus gibelio(Bloch)from Honghu Lake，China［J］．Parasitology Research，2012，110(4):1331-1336．

［18］吳英松，汪建國．圓形碘泡蟲免疫原性的研究［J］．水生生物學報，2000，24(3):246-251．

［19］Vasoo S，Pritt B S．Molecular diagnostics and parasitic disease［J］．Clinics in Laboratory Medicine，2013，33(3):461-503．

［20］陸宏達，張連義，王建國，等．患上皮瘤病異育銀鯽幾種免疫相關酶活性的變化［J］．大連海洋大學學報，2010，25(4):343-347．