胡冰，王華，張冬冬，于春艷，劉恒明

(1．大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023;2．國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧大連116023;3．大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連116023)

納米科技的迅猛發(fā)展，推動了納米材料在醫(yī)藥、化工、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用［1］。其中，納米TiO2具有良好的熱穩(wěn)定性、耐化學(xué)腐蝕性、光催化特性和防紫外線功能，成為目前應(yīng)用最廣泛的納米半導(dǎo)體材料之一。但是，納米TiO2在生產(chǎn)和使用過程中可能出現(xiàn)流失，并隨著水的環(huán)境循環(huán)進(jìn)入到水域生態(tài)系統(tǒng)中，對水生生物產(chǎn)生一定的毒害作用［2］。目前，納米TiO2對水生生物的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)已逐漸引起人們的關(guān)注。有研究表明:納米TiO2作用于蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidesa時，由于TiO2極高的比表面積，可以吸附其他污染物并具有運(yùn)載其進(jìn)入生物體內(nèi)的能力，導(dǎo)致其毒性增加［3］;納米TiO2還能促進(jìn)藻細(xì)胞內(nèi)超氧自由基的產(chǎn)生，抑制SOD、CAT等抗氧化酶系的抗氧化能力，并對藻類的光合速率和呼吸速率產(chǎn)生影響［4］。

近年來，沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)和工業(yè)的迅速發(fā)展，有毒重金屬元素隨工農(nóng)業(yè)廢水排放進(jìn)入水環(huán)境，部分近岸海域重金屬污染狀況日益嚴(yán)重。海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重金屬污染可以引起生態(tài)系統(tǒng)中各級生物的不良反應(yīng)，甚至危害生態(tài)系統(tǒng)中各類生物的生存［5］。Zn和Cu是藻類生長所必須的微量元素，但高濃度Zn能導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加并引起細(xì)胞形態(tài)變異［6］，高濃度Cu是一種典型的細(xì)胞抑制劑［7］。

微藻是水生生態(tài)系統(tǒng)中最重要的初級生產(chǎn)者，微藻的種群結(jié)構(gòu)可以影響水域生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動［8］。關(guān)于單一毒物對微藻的毒性作用已有較多研究［9］，但在實(shí)際的水環(huán)境中，微藻可能受到多種毒物的共同作用。當(dāng)納米材料與重金屬污染物在水環(huán)境中共存時，可能對微藻產(chǎn)生聯(lián)合毒性作用，但目前有關(guān)納米材料與重金屬共存對海洋微藻聯(lián)合毒性作用的研究較少。本研究中，以小球藻Chlorella sp．和新月菱形藻Nitzschia closterium為受試生物，選擇TiO2納米顆粒、重金屬Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)作為毒物，考察不同濃度TiO2納米顆粒、重金屬Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的單一急性毒性，以及TiO2納米顆粒和Cu(Ⅱ)、TiO2納米顆粒和Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻的聯(lián)合毒性，研究結(jié)果可為納米材料的環(huán)境安全性評價提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

小球藻 Chlorella sp．和新月菱形藻 Nitzschia closterium由大連海洋大學(xué)藻種間提供。

納米 TiO2(P25，Degussa)，含量＞99．5%，粒徑約為 20 nm，混晶型。CuSO4·5H2O和ZnSO4·7H2O均為分析純 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1．2．1 試驗(yàn)液的配制 納米 TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的儲備液均用超純水配制而成，濃度均為1 g/L，使用時稀釋至試驗(yàn)所需濃度。試驗(yàn)用海水為經(jīng)沙濾的大連市黑石礁近岸表層海水，鹽度為30，pH為8．0，煮沸后使用。本試驗(yàn)中所用自然海水中Cu(Ⅱ)的本底值為 0．16 μg/L，Zn(Ⅱ)的本底值為 0．28 μg/L。

1．2．2 微藻培養(yǎng) 將處于指數(shù)生長期的小球藻與新月菱形藻接種到含有康威營養(yǎng)鹽［10］的海水中，培養(yǎng)溫度為 (20±1)℃，明暗周期為12 h∶12 h，光照強(qiáng)度約為3000 lx，每天搖瓶3次。小球藻起始密度約為1×106cells/mL，新月菱形藻起始密度約為 2×105cells/mL。

1．2．3 納米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的單一毒性試驗(yàn) 參照微型 (單細(xì)胞)藻類毒性試驗(yàn)方法［11］，采用96 h EC50(引起50%微藻生長被抑制的毒物濃度)作為評價指標(biāo)。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將納米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的濃度均設(shè)為 3．0、6．0、9．0、12．0、15．0 mg/L，空白對照組不加任何毒物，每個試驗(yàn)組設(shè)置3個平行。自接種之日起每隔24 h取樣一次，用血球計數(shù)板計數(shù)，記錄96 h的微藻生長情況。

采用SPSS 19．0軟件通過概率單位法［12］計算出各個毒物的 EC50值，通過單因素方差分析法(ANOVA)對3種毒物的EC50數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)為0．05。

1．2．4 納米 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)的聯(lián)合毒性試驗(yàn) 對納米TiO2和重金屬的聯(lián)合毒性評定采用Marking相加指數(shù) AI(Additive index)法［11］。以納米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的單一急性毒性試驗(yàn)為基礎(chǔ)，按TiO2和Cu(Ⅱ)以及TiO2和Zn(Ⅱ)濃度比均為1∶1接種藻液，進(jìn)行聯(lián)合毒性試驗(yàn)。每隔24 h取樣計數(shù)。

用SPSS 19．0軟件的Probit過程計算出TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對兩種海洋微藻的 EC50。計算公式為

其中:M實(shí)際聯(lián)合毒性生物學(xué)作用之和;a1和b1分別為納米TiO2和重金屬Cu(Ⅱ)或Zn(Ⅱ)單獨(dú)暴露時的毒性;am和bm分別為納米TiO2和重金屬混合暴露下，溶液達(dá)到相同毒性時納米TiO2和重金屬的濃度。將M轉(zhuǎn)換為納米TiO2和重金屬聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI，當(dāng)M≤1時，AI=1/M-1;當(dāng)M≥1時，AI=1-M。通過AI可以確定納米TiO2和重金屬聯(lián)合毒性的作用類型，當(dāng)AI=0時，納米TiO2和重金屬聯(lián)合毒性為加和作用;當(dāng)AI＞0時，納米TiO2和重金屬聯(lián)合毒性作用為協(xié)同作用，AI加1即為混合物的毒性增大系數(shù);當(dāng)AI＜0時，表示納米TiO2和重金屬聯(lián)合毒性作用為拮抗作用，AI減1后絕對值的倒數(shù)即為混合毒物的毒性增大系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻的單一毒性

圖1為納米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)對小球藻24 h至96 h的EC50。從圖1可見，3種毒物對小球藻的EC50均隨著暴露時間的延長而降低。在24 h和48 h時，納米TiO2對小球藻的EC50顯著高于Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的 EC50(P＜0．05)，說明在本試驗(yàn)條件下48 h內(nèi)，重金屬Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的毒性強(qiáng)于納米 TiO2;但在 72h時，納米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)對小球藻的EC50值相近，三者的毒性無顯著性差異 (P＞0．05);到96 h時，納米TiO2和Zn(Ⅱ)對小球藻的EC50值相近，兩者的毒性無顯著性差異 (P＞0．05)，但二者對小球藻的EC50值顯著高于Cu(Ⅱ)對小球藻的 EC50值 (P＜0．05)，說明在此時間點(diǎn)上Cu(Ⅱ)的毒性強(qiáng)于納米TiO2和Zn(Ⅱ)。由圖1還可知，從48 h至72 h，納米TiO2對小球藻的EC50值下降極為顯著，表明納米TiO2對小球藻的毒性作用在48 h后表現(xiàn)更為突出。

圖2為納米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)對新月菱形藻在24 h至96 h的EC50。從圖2可見，3種毒物對新月菱形藻的EC50均隨著時間的延長而略有下降。在24 h時，3種毒物對新月菱形藻的毒性強(qiáng)弱順序依次為Cu(Ⅱ)＞Zn(Ⅱ)＞納米TiO2，3種毒物對新月菱形藻的毒性有顯著性差異 (P＜0．05);在48 h時，3種毒物對新月菱形藻的毒性強(qiáng)弱順序與24 h時相同，3種毒物的毒性有顯著性差異(P＜0．05);在 72 h和 96 h 時，納米 TiO2、Zn(Ⅱ)對新月菱形藻的毒性無顯著性差異 (P＜0．05)，但Cu(Ⅱ)對新月菱形藻的毒性明顯強(qiáng)于納米 TiO2和Zn(Ⅱ)(P＜0．05)。

圖1 納米TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)對小球藻的EC50Fig.1 EC50of TiO2nanoparticles，Cu(Ⅱ)and Zn(Ⅱ)to Chlorella sp.

圖2 納米 TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)對新月菱形藻的EC50Fig.2 EC50ofTiO2nanoparticles， Cu(Ⅱ)and Zn(Ⅱ)to Nitzschia closterium

此外，由圖1和圖2還可知，納米TiO2對小球藻和新月菱形藻24 h EC50分別為45．843、17．591 mg/L，48 h EC50分別為 39．973、17．457 mg/L，72 h EC50分別為 11．793、13．406 mg/L，96 h EC50分別為11．655、13．693 mg/L。以上結(jié)果表明，在24 h、48 h，納米TiO2對新月菱形藻的毒性強(qiáng)于對小球藻;但在72 h、96 h，納米TiO2對小球藻的毒性強(qiáng)于對新月菱形藻。張寧等［13］研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2(粒徑為20～35 nm)對小球藻Chlorella sp．、中肋骨條藻Skeletonemaceae costatum、微囊藻Microcystis sp．、斜生柵藻 Scenedesmus obliquus、萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardi的72 h EC50為10～26 mg/L，毒性表現(xiàn)為葉綠素a和可溶性蛋白質(zhì)含量下降，脂質(zhì)氫過氧化物含量積累。朱小山等［14］研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2(粒徑為20 nm，銳鈦礦型)對斜生柵藻的96 h EC50為15．262 mg/L。Hund-Rinke等［15］研究了納米TiO2對近具刺鏈帶藻Desmodesmus subspicatus的毒性，結(jié)果表明，6 h EC50為 14 mg/L。Wang等［16］研究表明，納米 TiO2(平均粒徑為21 nm)濃度≥10 mg/L時會抑制衣藻Chlamydomonas sp．的生長。本試驗(yàn)研究結(jié)果基本與上述研究結(jié)果相類似。

Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)是工業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)近岸海域海水中常見的重金屬污染物。Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)對牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri［17］、三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum［18］、柵藻 Scenedesmus sp．［19］的毒性順序均為Cu(Ⅱ)＞Zn(Ⅱ)。在本試驗(yàn)中，對兩種海洋微藻的毒性強(qiáng)弱順序也均為Cu(Ⅱ)＞Zn(Ⅱ)，與已有的研究報道一致。

2.2 納米 TiO2+Cu(Ⅱ)、納米 TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻的聯(lián)合毒性效應(yīng)

表1為TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻聯(lián)合毒性的 EC50。從表1可見，TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻的96 h EC50分別為9．287、11．084 mg/L，對新月菱形藻的96 h EC50分別為 10．632、12．954 mg/L。對小球藻和新月菱形藻的聯(lián)合毒性強(qiáng)弱順序均為TiO2+Cu(Ⅱ)＞TiO2+Zn(Ⅱ)。這可能是由于納米TiO2粒徑小，有高的表面活性、表面能和比表面積，對Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)具有一定的吸附能力［20］，而Cu(Ⅱ)對海洋微藻的毒性強(qiáng)于Zn(Ⅱ)，導(dǎo)致TiO2+Cu(Ⅱ)的聯(lián)合毒性強(qiáng)于TiO2+Zn(Ⅱ)。同時，在96 h內(nèi)，新月菱形藻對 TiO2+Cu(Ⅱ)或 TiO2+Zn(Ⅱ)聯(lián)合毒性的耐受能力均強(qiáng)于小球藻，這可能與不同微藻種類對聯(lián)合毒物的耐受能力不同有關(guān)。從表1還可知，TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)的聯(lián)合效應(yīng)EC50值隨暴露時間的延長而減小，但減小的幅度低于單獨(dú)TiO2對兩種海洋微藻EC50值隨暴露時間的延長而下降的幅度。

納米TiO2在水中易于吸附其他污染物，使其對水生生物的毒性發(fā)生變化［21-22］。Hartmann等［23］研究發(fā)現(xiàn)，粒徑為30 nm的TiO2能快速吸附水中的Cd(Ⅱ)，并增加對綠藻生長的抑制，說明Cd(Ⅱ)有效濃度的減少不一定意味著重金屬的毒性減弱。但是，辛元元［9］研究發(fā)現(xiàn)，納米 TiO2與重金屬Cd(Ⅱ)共存時，因其可吸附水中的Cd(Ⅱ)，從而降低了對綠藻的毒性。本研究中運(yùn)用Marking相加指數(shù)法求得納米TiO2和重金屬聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI，結(jié)果見表2。由于納米TiO2和重金屬聯(lián)合毒性的AI值均為負(fù)數(shù)，可見 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻24 h至96 h的聯(lián)合毒性效應(yīng)均為拮抗作用，即TiO2+Cu(Ⅱ)和TiO2+Zn(Ⅱ)對海水中小球藻或新月菱形藻的毒性效應(yīng)，均小于它們分別單獨(dú)作用所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。本研究表明，納米TiO2和重金屬離子共同存在于海水中時，對兩種海洋微藻的毒性作用會有所降低。

表1 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻的EC50Tab.1 Joint EC50of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp.and Nitzschia closterium mg/L

表2 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻的聯(lián)合毒性相加指數(shù)AITab.2 Joint AI values of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp.and Nitzschia closterium

表3為TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻聯(lián)合毒性的增大系數(shù)。根據(jù)相加指數(shù)與毒性增大系數(shù)的關(guān)系，96 h時，TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)混合物的毒性增大倍數(shù)均約為0．5。范傳剛［24］研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2與Cd對大腸桿菌的抗氧化酶、蛋白質(zhì)和DNA均有毒性作用，而二者的聯(lián)合作用低于二者毒性的相加作用，表現(xiàn)為拮抗作用。但是，田冰心等［25］研究則發(fā)現(xiàn)，納米TiO2(1 mg/L)與菲、芘的聯(lián)合作用表現(xiàn)出比單一污染物更大的毒性作用;Zhu等［26］研究表明，納米TiO2和三丁基錫的相互作用會對鮑魚胚胎表現(xiàn)出更大的毒性效應(yīng)，兩者表現(xiàn)為協(xié)同作用。由此可見，對于納米TiO2的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)不應(yīng)只關(guān)注其本身的毒性，而應(yīng)關(guān)注納米TiO2與環(huán)境污染物共同作用的結(jié)果，這更能反映納米TiO2的環(huán)境暴露風(fēng)險。

表3 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)對小球藻和新月菱形藻聯(lián)合毒性的增大系數(shù)Tab.3 Joint augmentation coefficient of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp.and Nitzschia closterium

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