向赟，吳宇學，王剛，陳兆明，張銳，孫成波、3

(1．廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東湛江524025;2．廣東海洋大學實驗教學部，廣東湛江524025;3．廣東高校熱帶海產(chǎn)無脊椎動物養(yǎng)殖工程技術研究中心，廣東湛江524025)

凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei為世界主要人工養(yǎng)殖對蝦品種之一［1］，其養(yǎng)殖業(yè)已受到多種細菌病和病毒病的威脅，其中白斑綜合癥病毒作為一種對蝦高致死性病毒，傳染性強，宿主廣泛，危害極大［2］。白斑綜合癥暴發(fā)的原因不僅與蝦體免疫水平、感染方式、病毒數(shù)量、環(huán)境因子有關［3-4］，而且還與其他病原體有關，如副溶血弧菌、哈維氏弧菌等。其中哈維氏弧菌屬革蘭氏陰性，呈弧狀，極生單鞭毛，廣泛分布于近岸溫暖海洋環(huán)境中，能感染多種海洋無脊椎和脊椎動物［5］，主要感染苗期及幼體的動物，如哈維氏弧菌會引起中國對蝦及凡納濱對蝦幼體發(fā)病死亡［6-7］，也會引起成蝦發(fā)病死亡。陳月忠等［8］報道，哈維氏弧菌會引起長毛對蝦、日本對蝦成蝦發(fā)病死亡，嚴重制約了全球對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究中，對攜帶白斑綜合癥病毒 (WSSV)的凡納濱對蝦在不同溫度條件下注射感染不同濃度的哈維氏弧菌，探討哈維氏弧菌對感染W(wǎng)SSV的凡納濱對蝦的影響，旨在為對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

健康凡納濱對蝦取自廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地，體長為 (8．12±0．83)cm。

試驗用哈維氏弧菌Vibrio harveyi由西北農(nóng)林科技大學劉小林教授提供。

1.2 方法

試驗前將凡納濱對蝦暫養(yǎng)5 d，每日投喂對蝦人工配合餌料2次，換水1次，日換水量接近100%。試驗前隨機抽取10尾對蝦進行熒光定量PCR檢測，檢測結果為陰性。

1．2．1 WSSV粗提液的制備 取感染W(wǎng)SSV癥狀明顯的凡納濱對蝦，去除甲殼，按1∶1(g∶mL)加入高鹽PBS，冰浴中勻漿，將勻漿液于4℃下以7000 r/min離心15 min;離心后的上清液加入蔗糖至終濃度為30%(質量分數(shù))，4℃下以16 000 r/min超速離心 50 min，棄上清，沉淀用 PBS(pH 7．4)重懸，將重懸液用 0．22 μm 的濾膜過濾，分裝后于冰箱 (-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 菌懸液的制備 將哈維氏弧菌經(jīng)接種、活化培養(yǎng)24 h后，用無菌PBS緩沖液稀釋，制成菌懸液。

1．2．3 DNA模板提取和引物設計 參照Sun等［9］的方法提取DNA模板，參照You等［10］的方法設計PCR引物，并由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

1．2．4 標準品的制備 參照程曉燕等［11］的方法制備重組質粒標準品，用核酸分析儀測定重組質粒的DNA濃度，根據(jù)下式計算重組質粒的拷貝數(shù):

其中:阿伏加德羅常數(shù)為6．02×1023;重組質粒分子量=1個堿基對的平均分子量 (660 g/mol)×重組質粒的總長度 (bp)。

1．2．5 不同溫度條件下哈維氏弧菌和WSSV對凡納濱對蝦的致病性試驗 采用人工注射感染，在凡納濱對蝦第2腹節(jié)與第3腹肌之間往心臟方向注射40 μL病原緩沖液。

將試驗對蝦放入盛有60 L水的0．1 m3塑料桶中，分別在溫度為(19±1)、(25±1)、(31±1)℃下進行培養(yǎng)。試驗設繼發(fā)感染組、單獨感染組和對照組，各組均設3個平行，每個平行放對蝦30尾。其中，繼發(fā)感染組先注射 40 μL含 1．0×103copy/μL WSSV病毒粗提液稀釋液，一天后再分別注射 40 μL 濃 度 為 1．1 × 105、1．1 × 104、1．1 ×103cfu/mL的哈維氏弧菌菌懸液，分別記為W+V高、W+V中、W+V低組;單獨感染組單獨注射40 μL 含1．0×103copy/μL WSSV 病毒粗提液稀釋液和單獨注射濃度為1．1× 105、1．1 × 104、1．1 ×103cfu/mL的哈維氏弧菌菌懸液，分別記為 W、V高、V中、V低組;對照組注射40 μL PBS緩沖液。試驗過程中，每日投喂對蝦人工配合餌料2次，24 h充氣，定時吸出排泄物，日換水量為20%。及時撈出死亡對蝦放入冰箱 (-20℃)中保存。各組在感染后0、6、12、24、48、72、96 h取樣保存。觀察記錄對蝦發(fā)病及死亡情況，定期檢測對蝦組織中的病毒含量，并對死亡對蝦進行病毒檢測。

1．2．6 病毒的檢測 采用熒光定量PCR方法并參考程曉燕等［11］的方法檢測病毒的含量。

2 結果與分析

2.1 (19±1)℃水溫下感染哈維氏弧菌對攜帶WSSV的凡納濱對蝦的影響

2．1．1 凡納濱對蝦的死亡情況 從圖1可見，溫度為 (19±1)℃時，單獨感染不同濃度的哈維氏弧菌和WSSV與繼發(fā)感染兩種病原對凡納濱對蝦的累積死亡率影響不大，至試驗結束各組累積死亡率均低于8．9%。

圖1 溫度為 (19±1)℃條件下感染哈維氏弧菌和WSSV病毒凡納濱對蝦的累積死亡率Fig.1 Cumulative mortality of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei infected with Vibrio harveyi and WSSV at(19 ±1)℃

2．1．2 凡納濱對蝦的病毒攜帶量 從表1可見:溫度為 (19±1)℃時，整個試驗過程中，單獨感染W(wǎng)SSV組對蝦體內(nèi)攜帶的病毒量在6 h時顯著高于繼發(fā)感染組 (P＜0．05);24、48 h時繼發(fā)感染濃度為1．1×105cfu/mL組的病毒攜帶量明顯高于其他組 (P＜0．05);72 h時各組病毒攜帶量均很高，最大值為3．9×104copy/g。

2.2 (25±1)℃水溫下感染哈維氏弧菌對攜帶WSSV的凡納濱對蝦的影響

2．2．1 凡納濱對蝦的死亡情況 從圖2可見:溫度為 (25±1)℃時，0～24 h時各組的累積死亡率低于13．3%(P＞0．05);至48 h時繼發(fā)感染濃度為1．1×105cfu/mL 組對蝦累積死亡率 (34．3%)明顯高于另外兩個繼發(fā)感染濃度組 (P＜0．05);至72 h時3個繼發(fā)感染組和單獨感染W(wǎng)SSV組對蝦累積死亡率明顯高于單獨感染不同濃度細菌組，且單獨感染W(wǎng)SSV組 (62．2%)和繼發(fā)感染濃度1．1×105cfu/mL 組(65．7%)顯著高于其他組(P＜0．05);至96 h時3個繼發(fā)感染組和單獨感染W(wǎng)SSV組的累積死亡率顯著高于單獨感染不同濃度的細菌組(P＜0．05)。

表1 溫度為 (19±1)℃條件下感染不同濃度哈維氏弧菌對凡納濱對蝦病毒攜帶量的影響 (平均值±標準差)Tab.1 Effects of infected concentrations of Vibrio harveyi on amount of virus in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at(19±1)℃ (mean±S.D.)

圖2 溫度為 (25±1)℃條件下感染哈維氏弧菌和WSSV病毒凡納濱對蝦的累積死亡率Fig.2 Cumulative mortality of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei infected with Vibrio harveyi and WSSV at(25±1)℃

2．2．2 凡納濱對蝦的病毒攜帶量 從表2可見:溫度為 (25±1)℃時，整個試驗過程中，至48 h時單獨感染W(wǎng)SSV組對蝦體內(nèi)攜帶WSSV的病毒量顯著高于3個繼發(fā)感染組 (P＜0．05);72 h時單獨感染W(wǎng)SSV組對蝦體內(nèi)攜帶病毒量顯著低于3個繼發(fā)感染組 (P＜0．05);96 h時繼發(fā)感染濃度1．1×105cfu/mL組的病毒攜帶量明顯高于其他組 (P＜0．05)。

2.3 (31±1)℃水溫下感染哈維氏弧菌對攜帶WSSV的凡納濱對蝦的影響

2．3．1 凡納濱對蝦的死亡情況 從圖3可見:溫度為 (31±1)℃時，0～24 h時各組對蝦的累積死亡率低于12．0%(P＞0．05);至48 h時單獨感染W(wǎng)SSV組的累積死亡率顯著低于繼發(fā)感染濃度1．1×103、1．1×105cfu/mL 組 (P＜0．05);至 72 h時單獨感染W(wǎng)SSV組累積死亡率 (42．3%)明顯高于單獨感染細菌組 (P＜0．05)，但明顯低于3個繼發(fā)感染組 (P＜0．05)，而繼發(fā)感染濃度1．1×105cfu/mL組的累積死亡率最大，為80．0%。

圖3 溫度為 (31±1)℃條件下感染哈維氏弧菌和WSSV病毒凡納濱對蝦的累積死亡率Fig.3 Cumulative mortality of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei infected with Vibrio harveyi and WSSV at(31±1)℃

2．3．2 凡納濱對蝦的病毒攜帶量 從表3可見:溫度為 (31±1)℃時，整個試驗過程中，6 h時繼發(fā)感染濃度1．1×105cfu/mL組與其他組存在顯著性差異 (P＜0．05);12 h時單獨感染W(wǎng)SSV組病毒攜帶量顯著低于濃度為 1．1×105、1．1×104cfu/mL的2個繼發(fā)感染組 (P＜0．05)，隨著細菌濃度的增加病毒攜帶量也增加;24 h時病毒開始加快增殖，繼發(fā)感染濃度1．1×105cfu/mL、1．1×104cfu/mL 組明顯高于另兩組 (P＜0．05);48～72 h時各組病毒攜帶量均很高;72、96 h時單獨感染W(wǎng)SSV組顯著低于繼發(fā)感染組 (P＜0．05)。

表2 溫度為 (25±1)℃條件下感染不同濃度哈維氏弧菌對凡納濱對蝦病毒攜帶量的影響 (平均值±標準差)Tab.2 Effects of different concentrations of Vibrio harveyi on amount of virus in infected Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at(25±1)℃ (mean±S.D.)

表3 溫度為 (31±1)℃條件下感染不同濃度哈維氏弧菌對凡納濱對蝦病毒攜帶量的影響 (平均值±標準差)Tab.3 Effects of different concentrations of Vibrio harveyi on amount of virus in infected Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at(31±1)℃ (mean±S.D.)

3 討論

溫度作為最重要的環(huán)境因子之一，不僅直接影響對蝦的新陳代謝、抗病能力、進食、生存發(fā)育，而且還對病毒在對蝦體內(nèi)增殖有重要影響。李侃等［12］報道，病毒在溫度為21～30℃時增殖最快，而當溫度低于20℃或超過30℃時，病毒的增殖速度受到部分抑制。Du等［13］報道，蝦體內(nèi)病毒攜帶量在低溫 (10±1)℃條件下明顯低于 (24±1)℃條件下，說明低溫可以抑制WSSV在蝦體內(nèi)增殖。Jira等［14］報道，將感染W(wǎng)SSV的垂死小龍蝦從22℃水溫轉移至16℃水溫，可以延緩小龍蝦的死亡，說明低溫可以降低WSSV對小龍蝦的致病性。Rahman等［15］報道，在對蝦感染W(wǎng)SSV前期，高溫33℃可以延緩疾病暴發(fā)，有效降低對蝦死亡率，抑制WSSV在對蝦體內(nèi)增殖;Du等［16］通過試驗也證明，高溫 (33℃)可以延長病蝦存活時間。Sudha等［17］將WSSV與對蝦的關系分為3種:第一種為前期急性感染，機體高度感染W(wǎng)SSV，2～3 d時大面積死亡;第二種為急性和亞急性感染，機體中度或高度感染W(wǎng)SSV，7～10 d時出現(xiàn)高死亡率;第三種為慢性感染 (潛伏感染)，機體輕微感染，15～28 d時出現(xiàn)死亡。蝦體感染細菌后會打破細胞內(nèi)水與離子含量平衡，促使細胞腫大，破壞細胞氧化酶系統(tǒng)，供能不足，引起物質代謝障礙和細胞功能下降［18］，導致抗病能力下降，易引起二次感染。

本研究結果表明，在溫度為 (19±1)℃條件下，各組累積死亡率都很低，低于8．9%。病毒攜帶量檢測結果中也發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，繼發(fā)感染組病毒含量有一個升高趨勢，之后有下降波動，而單獨感染病毒組則沒有，各組的病毒含量均低于3．9×104copy/g，低于簡旭鳳［19］報道的對蝦瀕死時病毒攜帶臨界值1．0×105copy/g，因此，感染W(wǎng)SSV未出現(xiàn)大量對蝦死亡。哈維氏弧菌單獨感染組中各濃度組同樣未出現(xiàn)大量死亡，說明在低溫條件下，兩種病原體處于潛伏感染期。管越強［20］報道，水溫處于低溫 (15℃)對日本對蝦體內(nèi)WSSV的增殖有抑制作用。鐘碩良等［21］報道，當水溫高于32℃或低于28℃時，哈維氏弧菌生長速度降低，仔蝦累積死亡率也隨之降低。本試驗中也證實，在溫度 (19±1)℃下，不僅WSSV在凡納濱對蝦體內(nèi)的增殖受到抑制，而且哈維氏弧菌在對蝦體內(nèi)的生長也受到影響。

在溫度 (25±1)℃條件下，感染哈維氏弧菌后0～24 h，細菌最高濃度繼發(fā)感染組累積死亡率比其他組高，但各組均低于13．4%;至24 h時繼發(fā)感染組病毒攜帶量均低于5．2×103copy/g，但病毒攜帶量高于單獨感染W(wǎng)SSV組;48 h后不同濃度繼發(fā)感染組和單獨感染組之間出現(xiàn)顯著差異，單獨感染W(wǎng)SSV組的對蝦累積死亡率與最高濃度繼發(fā)感染組相似，繼發(fā)感染組的累積死亡率隨細菌感染濃度的增加而升高，但單獨感染W(wǎng)SSV組的死亡率明顯高于另外兩個濃度繼發(fā)感染組的結果與丁燏等［22］報道的繼發(fā)感染累積死亡率要比單獨感染高的結果不相符，可能是因為試驗溫度條件不同所致。目前研究較多的是哈維氏弧菌對凡納濱對蝦仔蝦、日本對蝦成蝦致病性的研究，在低于28℃條件下哈維氏弧菌對凡納濱對蝦成蝦的致病性有待進一步研究。至48 h時單獨感染W(wǎng)SSV組病毒攜帶量比繼發(fā)感染組高，但至72 h時繼發(fā)感染組病毒攜帶量迅速增加，明顯高于單獨感染組。說明隨著時間的延長，哈維氏弧菌對對蝦組織引起損傷，對蝦抗病力下降，為WSSV增殖提供了條件。

在溫度 (31±1)℃條件下，感染哈維氏弧菌后0～24 h，各組的累積死亡率低于12．0%，病毒攜帶量都低于2．3×103copy/g;48 h后繼發(fā)感染組累積死亡率明顯高于獨感染組，而且病毒攜帶量隨著細菌感染濃度的升高而增加。單獨感染W(wǎng)SSV組累積死亡率和病毒攜帶量的研究結果說明，在溫度為(31±1)℃條件下可以減緩WSSV的增殖，推遲了白斑綜合癥暴發(fā)的時間。此結果與Vidal等［23］報道的在高溫 (32．3±0．8)℃ 條件下可推遲攜帶WSSV凡納濱對蝦暴發(fā)白斑綜合癥的結果相符。繼發(fā)感染組累積死亡率和病毒攜帶量的研究結果也證實了鐘碩良等［21］報道的在 (31±1)℃條件下有利于哈維氏弧菌生長的結論。先感染W(wǎng)SSV的對蝦機體已有損傷，抗病能力下降，更加有利于哈維氏弧菌的侵染，隨著細菌數(shù)量的增多，對蝦抗病能力下降更快，加快WSSV在對蝦體內(nèi)增殖，從而加速對蝦死亡。陳細法等［24］認為，攜帶病毒的對蝦生長在良好養(yǎng)殖環(huán)境中，可處于潛伏感染期，但由于抗病能力下降會因外在脅迫因子變化引發(fā)病毒病。所以，給對蝦注射感染細菌后，細菌隨血淋巴循環(huán)擴散至全身，引起細菌大量繁殖，會加快疾病的發(fā)生。

綜上，哈維氏弧菌和WSSV兩種病原體在低溫(19±1)℃條件下，致病力都較低，可能是低溫條件不利于病原體在機體內(nèi)增殖;在溫度 (25±1)℃條件下，WSSV對對蝦的致病力高于哈維氏弧菌的致病力;在溫度為 (31±1)℃條件下，單獨感染W(wǎng)SSV時，WSSV的致病力受到一定抑制，隨著時間的延長，哈維氏弧菌致病力在感染后期引起WSSV致病力提高，使WSSV在對蝦體內(nèi)增殖加快。因此，溫度調控對于對蝦養(yǎng)殖中的病害預防有重要意義。

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