田照輝，徐紹剛，朱華，胡紅霞，王巍，董穎

(北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所暨國家淡水漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 (北京)，漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點實驗室，北京100068)

熱休克蛋白是機體應(yīng)激產(chǎn)生的一組具有高度同源性的蛋白，熱休克蛋白表達(dá)的提高可以減少蛋白錯誤折疊和變性蛋白的數(shù)量，從而增加細(xì)胞的活力［1］。HSP70不僅是分子伴侶，而且和非特異性免疫相關(guān)，可活化CD4+T細(xì)胞，產(chǎn)生1L-10，從而抑制Th-1細(xì)胞介導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)［2］。在免疫過程中，HSP可上調(diào)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分化的標(biāo)記;在宿主細(xì)胞與HSP70結(jié)合時，會識別腫瘤細(xì)胞相關(guān)多肽;可修復(fù)細(xì)胞損傷和防止由于細(xì)胞內(nèi)在防御系統(tǒng)引起的細(xì)胞自溶和凋亡［3］。病原體通過釋放活性氧、陽離子抗菌肽、溶菌酶和細(xì)胞因子等物質(zhì)，破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而改變細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo) HSP 表達(dá)［4］。

鱘魚為古老的軟骨硬鱗類，是大型水生經(jīng)濟動物，具有重要的科研、經(jīng)濟價值。西伯利亞鱘Acipernser baerii隸屬于鱘形目、鱘科、鱘屬，是重要的鱘魚養(yǎng)殖品種，常被作為軟骨硬鱗類生物學(xué)模型動物。西伯利亞鱘在野生狀態(tài)下抗病力很強，生活在西伯利亞勒拿河的鱘魚，幾乎不會被各種病原微生物和寄生蟲感染［5］，但在人工養(yǎng)殖條件下，養(yǎng)殖戶為追求產(chǎn)量，盲目加大養(yǎng)殖密度，同時缺乏科學(xué)管理，鱘魚長期忍受低溶氧、高NH+4-N等因子脅迫，致使其抗病力下降，增加了對病原菌的易感性，病害增加，近年來鱘魚養(yǎng)殖病害問題已經(jīng)凸顯，并造成了巨大的經(jīng)濟損失［5-10］。氣單胞菌是西伯利亞鱘重要的條件致病菌，趙鳳岐等［5］、馬志宏等［6］已從患病鱘魚中分別分離鑒定出嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila和維氏氣單胞菌 Aeromonas veronii。為研究西伯利亞鱘在維氏氣單胞菌感染過程中的生理免疫反應(yīng)，本研究中進行了維氏氣單胞菌攻毒試驗，測定細(xì)菌感染前后鱘魚血清指標(biāo)和hsp70基因表達(dá)的變化，旨在為鱘魚病害研究和抗病選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用西伯利亞鱘由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所國家級鱘魚良種場提供。挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格基本一致的西伯利亞鱘100尾用于試驗，體質(zhì)量為(260．2±37．8)g。試驗魚首先在實驗室玻璃鋼循環(huán)水池中養(yǎng)殖兩周，養(yǎng)殖水體為2 m3，水溫為22℃，每日投喂2次，投飼量為1%。

試驗用維氏氣單胞菌由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所水產(chǎn)動物營養(yǎng)與病害防治研究室提供。

RNeasy Mini Kit、RNase-Free DNase Set 為Qiagen公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒購于Invitrogen公司，實時定量試劑為 AB公司的2×Sybrgreen PCR Master Mix。

1.2 方法

1．2．1 細(xì)菌的培養(yǎng) 將分離到的維氏氣單胞菌X-1-06909菌株活化后接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，28℃下培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水(0．65%)洗下菌苔，制成菌懸液，10倍梯度稀釋，用平板菌落計數(shù)法測定菌液濃度，進行預(yù)試驗，確定攻毒濃度。

1．2．2 感染試驗 取80尾魚，每10尾暫養(yǎng)在一個盛有0．15 m3水的玻璃鋼水槽中，持續(xù)充氣，水溫控制在22．6～24．5℃。暫養(yǎng)2日后進行細(xì)菌人工感染試驗:其中50尾作為處理組，給每尾魚從背部肌肉注射菌液濃度為2．0×107cfu/mL的維氏氣單胞菌，注射劑量為0．1 mL/100 g(體質(zhì)量);30尾作為對照組，注射等量0．65%生理鹽水。暫養(yǎng)期間正常投喂，感染期間停止投喂，盡量減少人為干擾，觀察各組魚的活動情況。

1．2．3 樣品的采集 感染后每隔1 h觀察一次魚的活動情況，注射24 h后開始記錄死亡魚的數(shù)量和時間，試驗共進行10 d，計算累積死亡率。處理組在感染40 h后出現(xiàn)瀕臨死亡個體，即魚體失去平衡，翻白漂浮在水面，呼吸微弱接近死亡，開始采樣。本試驗中研究細(xì)菌感染后敏感個體和正常個體在免疫、生理和hsp70表達(dá)上的變化，因為感染個體的敏感程度難以界定，因此，以“瀕?！弊鳛槊舾袀€體取樣標(biāo)準(zhǔn)，本試驗中40 h時出現(xiàn)瀕危個體，所以從40 h開始取樣。處理組在40、44、53、62、93、168 h取樣，每次取3尾瀕臨死亡魚，分別記為40、44、62、93、168 h處理組;對照組只在有代表性的3個時間節(jié)點即試驗組開始死亡時、停止死亡時和試驗結(jié)束時取樣，即40、93、168 h取樣，分別記為40、93、168 h對照組;為了驗證感染后停止死亡前，活動的正常魚和死亡魚在皮質(zhì)醇含量和各免疫指標(biāo)之間的差異，53 h取感染組活動正常魚3尾，記為53 h處理正常魚組。將采集的樣魚快速深度麻醉后，從尾靜脈采血，血樣于冰箱 (4℃)中靜置2 h，4℃下以3500×g離心10 min，制備血清，將上清液于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩Ｈ?．1 g左右的肝、鰓、脾、后腸在液氮中速凍后于-80℃下保存，用于分子生物學(xué)分析。

1．2．4 引物設(shè)計 根據(jù)西伯利亞鱘HSP70 cDNA全序列 (GenBank:HM348777)，應(yīng)用 Primer 5．0軟件設(shè)計實時定量引物HSP704f、HSP704r，由北京擎科生物工程有限公司合成 (表1)。

表1 實時定量引物Tab.1 Primers of Real-time PCR

1．2．5 hsp70基因的實時定量 使用RNA試劑盒提取總RNA，用RNase-Free DNase Set柱處理基因組，用伯樂紫外分光光度計測定RNA濃度和OD值，保證OD值為1．9～2．0，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照田照輝等［11］的方法進行實時定量，采用SYBR Green法，將待測樣品cDNA經(jīng)過系列稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建相對標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體步驟如下:每個樣品取總RNA 1 μg，用 SuperScript III First—Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)進行反轉(zhuǎn)錄，并進行無反轉(zhuǎn)錄酶 (NRT)和無RNA(NOT)對照。實時定量引物HSP704f、HSP704r的擴增片段為100 bp，預(yù)先采用普通PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證引物的特異性。實時定量時，取魚的肝、鰓、脾、腸4種組織的cDNA等量混合，梯度稀釋30～36倍為模板，假定稀釋36倍的模板的copy值為1，作相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計算擴增效率E=10-1/Slope-1，保證擴增效率在90% ～110%(R2＞0．99)，各組織的cDNA稀釋10倍作為模板，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時定量分析，并與NTC(無模板陰性對照)、NRT、NOT進行對照。反應(yīng)體系 (共20 μL):2 × Sybrgreen PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L HSP704f、HSP704r各 0．7 μL，模板 2 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)程序:95℃下預(yù)變性10 min，95℃下變性15 s，58℃下退火15 s，72℃下延伸45 s并采集熒光信號，共進行40個循環(huán)。每個模板重復(fù)3次，實時定量結(jié)束后立即進行熔解曲線分析。

1．2．6 皮質(zhì)醇含量的測定 取-20℃下保存的血清，由北方生物技術(shù)研究所使用皮質(zhì)醇放射免疫分析試劑盒 (北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字S10940097)進行測定。

1．2．7 溶菌酶 (LZM)、超氧化物歧化酶 (SOD)活力和丙二醛 (MDA)含量的測定 參照宋超等［12］的方法，以溶壁微球菌Micrococcus lysoleikticus凍干粉為底物，將底物用0．1 mol/L、pH 6．4的PBS緩沖液配成 OD540nm=0．3～0．5的懸液。取3 mL該懸液于試管內(nèi)并置于冰浴中，再加入50 μL待測血清，混合，測定OD值A(chǔ)0，將試液移入37℃下溫浴30 min，取出后立刻置于冰浴內(nèi)10 min，以終止反應(yīng)，測定其OD值A(chǔ)。根據(jù)下式計算:

溶菌酶活力=(A0-A)/A。

取-20℃下保存的血清，由北京華英生物技術(shù)研究所使用試劑盒 (南京建成生物工程研究所)測定SOD活性、MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 11．5軟件進行單因素方差分析(One-Way)，方差具有齊次性時采用Duncan法進行多重比較，方差不具齊次性時采用Games-Howell法進行多重比較。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示 (n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工感染后魚體的發(fā)病癥狀

注射維氏氣單胞菌后，每隔1 h觀察一次魚體的活動情況。結(jié)果顯示:對照組活動一直正常，處理組在感染40 h后出現(xiàn)失去平衡且呼吸微弱瀕臨死亡的個體，此時采集的樣本魚鰓發(fā)黑，間或發(fā)白，肝臟呈土黃至紅色，有的樣本肝臟帶有出血點;62 h取瀕死魚樣本，鰓絲中間發(fā)白，表皮已經(jīng)開始潰爛，后腸有膿血，62 h取樣后，處理組不再出現(xiàn)死魚個體;168 h取樣后，停止試驗。人工感染后不同時間試驗魚的死亡率如圖1所示。

2.2 血清皮質(zhì)醇含量

注射維氏氣單胞菌后各試驗組西伯利亞鱘血清皮質(zhì)醇含量如圖2所示，其中40 h對照組和53 h處理正常魚組血清皮質(zhì)醇含量最低，分別為(11．9±1．2)、(11．4±3．4)ng/mL，與不再出現(xiàn)死亡魚后所取樣本即93 h和168 h的對照組與處理組無顯著性差異 (P＞0．05)，與處理患病各組即40 h處理組、44 h處理組、53 h處理組和62 h處理組有顯著性差異 (P＜0．05)。皮質(zhì)醇含量的變化顯示:對照組和處理活動正常魚組的皮質(zhì)醇含量均低于50 ng/mL，而患病魚皮質(zhì)醇的平均含量急劇升高，為124～444 ng/mL。

圖1 注射維氏氣單胞菌后西伯利亞鱘魚的死亡率Fig.1 Mortality rate of Siberian sturgeon Acipenser baerii injected with Aeromonas veronii

圖2 注射維氏氣單胞菌后西伯利亞鱘血清皮質(zhì)醇含量的變化Fig.2 Changes in serum cortisol content of Siberian sturgeon Acipenser baerii injected with Aeromonas veronii

2.3 血清SOD、LZM活力和MDA含量

從圖3可見:各試驗組魚血清SOD活力，62 h處理組最低，與40 h對照組、53 h處理組、53 h處理正常魚組、93 h對照組、93 h處理組有顯著性差異 (P＜0．05)，其他組間均無顯著性差異(P＞0．05);各試驗組魚血清LZM活力，處理組從44 h開始升高，直到62 h，各個處理組均顯著高于40 h的處理組和對照組以及93 h和168 h的對照組和處理組 (P＜0．05)，其中44 h處理組、53 h處理組又顯著高于53 h處理正常魚組和62 h處理組(P＜0．05);各試驗組魚血清MDA含量，93 h處理組最低，與40 h處理組、44 h處理組、53 h處理正常魚組、62 h處理組有顯著性差異 (P＜0．05)，其他組間均無顯著性差異 (P＞0．05)。

圖3 注射維氏氣單胞菌后西伯利亞鱘血清SOD、LZM活力MDA含量的變化Fig.3 Changes in activities of serum SOD，and LZM and serum MDA content in Siberian sturgeon Acipenser baerii injected with Aeromonas veronii

2.4 hsp70基因的組織表達(dá)

從圖4可見:各處理組魚肝臟中，hsp70基因的表達(dá)量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢;40 h對照組表達(dá)量最高，93 h對照組表達(dá)量最低;40 h對照組hsp70的表達(dá)量與93 h對照組、93 h處理組有顯著性差異 (P＜0．05)，但與其他組無顯著性差異 (P＞0．05)。

各處理組魚脾臟中，hsp70基因的表達(dá)在62 h內(nèi)變化不大，93 h明顯升高;40 h對照組表達(dá)量最高，40 h處理組表達(dá)量最低;40 h對照組、44 h處理組、93 h處理組表達(dá)量無顯著性差異 (P＞0．05)，但均與40 h處理組、62 h處理組、93 h對照組有顯著性差異 (P＜0．05)。

各處理組魚后腸中，hsp70基因的表達(dá)量隨時間的延長呈先升高后降低再升高的趨勢;40 h對照組、44 h處理組表達(dá)量較高，與93 h對照組、93 h處理組無顯著性差異 (P＞0．05)，但與40 h處理組、62 h處理組有顯著性差異 (P＜0．05)。

圖4 注射維氏氣單胞菌后西伯利亞鱘肝臟、脾、后腸、鰓中hsp70基因表達(dá)的變化Fig.4 Changes in hsp70 gene expression in live，spleen，intestine，and gill of Siberian sturgeon Acipenser baerii injected with Aeromonas veronii

各處理組魚鰓中，hsp70基因的表達(dá)量隨時間的延長呈先降低后升高的趨勢;40 h對照組、40 h處理組、62 h處理組、93 h處理組表達(dá)量均較高，且組間無顯著性差異 (P＞0．05);44 h處理組、93 h對照組表達(dá)量較低，二者與93 h處理組無顯著性差異 (P＞0．05)，但與其他組有顯著性差異(P＜0．05)。

3 討論

3.1 西伯利亞鱘血清皮質(zhì)醇含量的變化

魚類在感染或損傷等應(yīng)激情況下，體內(nèi)激素如皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素等合成速率加快，其中一些激素可作為誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的介質(zhì)，促進肝內(nèi)急相蛋白的合成，皮質(zhì)醇被認(rèn)為是應(yīng)激反應(yīng)時蛋白合成的主要誘導(dǎo)劑［13］。皮質(zhì)醇還具有促進葡萄糖異生作用，適度和短時增高可幫助機體對抗環(huán)境壓力［14］。

鱘魚在遭遇脅迫時最先產(chǎn)生的和最主要的類固醇激素是皮質(zhì)醇［15］。寄生蟲感染魚體可以成為一種應(yīng)激原，導(dǎo)致魚體血漿皮質(zhì)醇和血糖濃度的大幅度增高［16］。弧菌 Vibrio anguillarum侵染虹鱒 Oncorhynchus mykiss時，導(dǎo)致虹鱒血漿皮質(zhì)醇水平增高［17］。細(xì)菌感染同樣也造成了西伯利亞鱘血清皮質(zhì)醇含量大幅升高，本研究中西伯利亞鱘40 h對照組以及53 h處理正常魚組皮質(zhì)醇含量最低，分別為 (11．9±1．2)、 (11．4±3．4)ng/mL，與停止死亡后的93 h和168 h處理組及對照組皮質(zhì)醇含量無顯著性差異，含量均低于50 ng/mL，93 h處理組血清皮質(zhì)醇已回落到對照組水平，處理瀕臨死亡魚的各組在40 h至62 h皮質(zhì)醇平均含量急劇升高，為124～444 ng/mL，即患病魚血清皮質(zhì)醇含量會急劇升高。水溫17．5℃時，體質(zhì)量為 (155．47±19．50)g的西伯利亞鱘血清皮質(zhì)醇生理水平為12．43 ng/mL，3齡1．5 kg西伯利亞鱘皮質(zhì)醇生理水平為5 ng/mL［18］，所以在疾病流行季節(jié)血清皮質(zhì)醇異常升高有細(xì)菌感染的可能，在沒有其他應(yīng)激條件時，血清皮質(zhì)醇異常升高可作為病害發(fā)生的指標(biāo)之一。

3.2 西伯利亞鱘血清各項免疫指標(biāo)的變化

溶菌酶是一種堿性蛋白，廣泛存在于血細(xì)胞和血液中，能水解細(xì)胞壁而使細(xì)菌溶解，還具有激活補體和促進對細(xì)菌的吞噬作用。水生動物血清LZM活力是衡量機體免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一。給西伯利亞鱘注射維氏氣單胞菌后，血清LZM活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，這與鯽Carassius auratus和團頭魴Megalobrama amblycephala感染嗜水氣單胞菌后LZM活力的變化規(guī)律一致［19-20］。這是因為魚類感染致病菌后，引起魚體的急性應(yīng)激反應(yīng)，通過大量分泌皮質(zhì)醇來促進糖的合成、脂肪的降解獲得能量［21-22］，通過增加特定蛋白 (如溶菌酶、補體和C反應(yīng)蛋白等)的水平來增強機體的免疫力［23-24］，共同抵抗病原菌的侵襲。但是，當(dāng)病原菌的危害超出了魚體的防御能力，導(dǎo)致蛋白的合成水平下降，使LZM活性也受到抑制。斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus在受愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri感染時，第4天時LZM活力顯著提高，且LZM活力同血液中的細(xì)菌水平呈正相關(guān)［25］。Fevolden等［26］認(rèn)為，皮質(zhì)醇和LZM活力的相關(guān)性取決于應(yīng)激源持續(xù)的時間;M?eck等［22］認(rèn)為，急性應(yīng)激可提高LZM活力，持續(xù)的應(yīng)激可降低LZM活力;R?ed等［27］卻得出相反的趨勢，低水平的LZM活力在持續(xù)的應(yīng)激時得到了提高。本研究中，LZM活力在44 h處理組、53 h處理組和62 h處理組表現(xiàn)出與皮質(zhì)醇水平的正相關(guān)性，40 h處理組和53 h處理正常魚組未表現(xiàn)出這種相關(guān)性。

機體在正常狀態(tài)下，自由基產(chǎn)生和清除保持平衡，過多的自由基會造成組織損傷。SOD是最先與活性氧自由基發(fā)生作用的酶，能清除自由基，當(dāng)SOD酶活性降低時，體內(nèi)會出現(xiàn)過多自由基，免疫水平下降。MDA被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的主要分解產(chǎn)物，其含量的高低不僅可以間接反映活性氧自由基含量的多少，而且還可以反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的強度或速率。本試驗中，西伯利亞鱘停止死亡前各處理組SOD有下降趨勢，62 h處理組較53 h處理組顯著下降，說明機體抗氧化能力明顯降低。停止死亡前除53 h處理組外，各處理組MDA含量均高于40 h對照組和停止死亡后各組，進一步說明隨著機體抗氧化能力的下降，機體受到氧化損傷。

3.3 西伯利亞鱘組織中hsp70基因表達(dá)的變化

通常認(rèn)為，熱休克蛋白的大量表達(dá)有助于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，改善細(xì)胞的生存能力和提高對環(huán)境脅迫或傷害的耐受性。魚體被細(xì)菌感染后，一般會引起體內(nèi)hsp70表達(dá)水平升高，且具有組織特異性。虹鱒感染鰻弧菌后，隨著病原菌的擴增，肝臟和腎臟中的hsp70基因表達(dá)量顯著上升［17］，當(dāng)血清中皮質(zhì)醇的水平達(dá)到最高值時，肝臟中hsp70基因的表達(dá)量也有峰值，而腎臟中在24 h時出現(xiàn)峰值。銀大馬哈魚Oncorhyncus kisutch在人工感染沙門氏桿菌Salmonella enterica后，肝臟與腎臟中的hsp70水平呈逐漸上升趨勢［28］。

西伯利亞鱘注射維氏氣單胞菌后，處理組62 h后不再出現(xiàn)死亡，93 h已經(jīng)沒有發(fā)病癥狀，此時皮質(zhì)醇和免疫指標(biāo)已基本恢復(fù)到對照組水平，說明注射維氏氣單胞菌93 h時后存活下來的個體已經(jīng)能夠維持自身的穩(wěn)態(tài)，此時肝、鰓、脾、后腸中hsp70基因表達(dá)量除脾臟外均處于93 h對照組水平，所以93 h后的樣品即168 h的表達(dá)量未進行檢測。93 h對照組較低的熱休克蛋白基因表達(dá)水平應(yīng)該反映了正常的生理狀況。肝、鰓、脾、后腸中hsp70基因表達(dá)量40 h對照組都處在較高水平，高于93 h對照組水平，推測對照組注射生理鹽水40 h后誘導(dǎo)了西伯利亞鱘熱休克蛋白基因的表達(dá)，而血清中的各生理免疫指標(biāo)卻沒有變化，說明組織中熱休克蛋白hsp70基因的誘導(dǎo)表達(dá)反應(yīng)更靈敏。

注射維氏氣單胞菌后，肝、鰓、脾、后腸4種組織中，鰓組織熱休克蛋白基因最先被誘導(dǎo)表達(dá)。說明鰓組織可能最先被感染，這與觀察到的感染過程較一致。肝臟各處理組隨時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但均低于40 h對照組，40 h對照組表達(dá)量高于93 h對照組和各處理組，可能是因為注射生理鹽水引起了對照組hsp70基因的誘導(dǎo)表達(dá)，并且注射維氏氣單胞菌使魚體維持自身穩(wěn)態(tài)的能力受到了抑制，致使處理組的表達(dá)強度低于對照組。脾臟中hsp70基因表達(dá)水平感染初期沒有升高，直到93 h時反而升高，說明93 h時雖然機體各指標(biāo)已達(dá)正常水平，但魚體內(nèi)仍然存在較多細(xì)菌侵染，引起脾臟的應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)細(xì)菌的清除需要較長的時間，例如大黃魚人工感染溶藻弧菌后第11天時體內(nèi)的弧菌才被清除［29］。西伯利亞鱘處理組后腸在40 h和62 h熱休克蛋白基因的表達(dá)受到了抑制，44 h時維持在對照組水平。

4 結(jié)語

維氏氣單胞菌感染西伯利亞鱘后，血清中皮質(zhì)醇含量升高和溶菌酶活力升高可作為機體免疫狀態(tài)的參考指標(biāo);注射生理鹽水引起了對照組hsp70基因的誘導(dǎo)表達(dá);hsp70基因在鰓組織最先有較高的誘導(dǎo)表達(dá)，說明鰓組織可能最先被感染。

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