徐進(jìn)，仇雪梅，高長(zhǎng)富，王秀利

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，誘發(fā)了“超級(jí)細(xì)菌”［1］等多抗性細(xì)菌和抗生素殘留等一系列問(wèn)題，對(duì)人類的健康以及生態(tài)平衡造成了嚴(yán)重影響。因此，開(kāi)發(fā)生產(chǎn)新型的抗菌、抗病原微生物制品具有深遠(yuǎn)的意義。

防御素 (defensin)是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，是一種富含半胱氨酸的小分子陽(yáng)離子多肽，相對(duì)分子質(zhì)量為2000～6000。根據(jù)其分子內(nèi)二硫鍵的不同，將其分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆蟲(chóng)防御素和植物防御素［2］。防御素廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，在抵抗體外病原微生物入侵方面起著重要作用，對(duì)細(xì)菌［3］、真菌［4］和包膜病毒［5］等具有廣譜抗性。魚(yú)類的防御素對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌都有較好的抑菌殺菌功效［6］，同時(shí)還可以增強(qiáng)魚(yú)體的免疫反應(yīng)［7］，提高免疫力。魚(yú)類防御素本身是一種魚(yú)源多肽，無(wú)耐藥性［8］，也不會(huì)引發(fā)生態(tài)問(wèn)題，是海洋魚(yú)類中值得開(kāi)發(fā)的一種資源。然而，從魚(yú)體中直接提取該蛋白操作復(fù)雜、成本高、產(chǎn)量少，不能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，限制了此類蛋白的拓展應(yīng)用前景。

本研究中，通過(guò)原核表達(dá)方法在大腸桿菌中高效表達(dá)紅鰭東方鲀Takifugu rubripes防御素db-1基因，可快速、高效、大量獲得這種重組防御素蛋白，該蛋白可作為殺菌抑菌制劑和免疫增強(qiáng)劑，為魚(yú)類的健康養(yǎng)殖、可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用健康紅鰭東方鲀?nèi)∽源筮B海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

試驗(yàn)用Taq酶，限制性內(nèi)切酶 NcoI和XhoI，T4 DNA連接酶，pMD-19T載體，DNA DL2000 Maker，蛋白Maker等均購(gòu)自寶生物 (TaKaRa)公司;pET32a+原核表達(dá)載體和Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保藏;DH5α感受態(tài)細(xì)胞以及Ni-NTA柱等購(gòu)自北京全式金公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，鼠抗His-Tag抗體、HRP-兔抗鼠IgG，Western Bloting膜封閉液，沉淀型TMB顯色液等均購(gòu)自北京天根 (Tiangen)公司;Anti-Mus Defensin Beta2抗體 (羊源)、HRP-羊抗鼠IgG購(gòu)自上海華壹生物公司;切膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek公司;其他常規(guī)試劑由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1．2．1 紅鰭東方鲀總RNA的提取 采集紅鰭東方鲀新鮮皮膚組織樣本，迅速凍存于液氮中，于冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆?。采用Trizol法提取紅鰭東方鲀皮膚組織總RNA。

1．2．2 紅鰭東方鲀防御素蛋白編碼區(qū) (CDS)片段的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中紅鰭東方鲀防御素基因 (GI:295293014)序列和pET32a+載體多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性引物:

DB-1cF:5'ATGGCCTCTTACCGAGCT 3';

DB-1cR:5'TCATAGAAAATGAGACACGCAG 3'。

以紅鰭東方鲀皮膚總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈;以cDNA第一鏈為模板，用DB-1cF/DB-1cR引物PCR擴(kuò)增防御素CDS片段。

1．2．3 原核表達(dá)載體pET32a-mDB-1的構(gòu)建 根據(jù)紅鰭東方鲀防御素基因CDS序列和pET32a+載體多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性引物:

mDBeF:5'CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG3'(劃線部分為NcoI酶切位點(diǎn));

mDBeR:5'CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT3'(劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))。

以cDNA第一鏈為模板，用mDBeF/mDBeR引物PCR擴(kuò)增防御素成熟肽編碼區(qū)mDB-1片段。將pET32a+載體和mDB-1片段同時(shí)用NcoI和XhoI進(jìn)行雙酶切，對(duì)雙酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收，并將兩種切膠回收的基因片段用T4 DNA連接酶于16℃下連接過(guò)夜;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于平板 (含100 μg/mL氨芐青霉素)上篩選，用下列通用引物對(duì)單克隆菌液進(jìn)行PCR鑒定:

pETF19:5'TACCGACGACGACGACAAG 3';

pETR19:5'TCTCAGTGGTGGTGGTGGT 3'。

將陽(yáng)性菌株送生工生物工程 (上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1．2．4 轉(zhuǎn)化pET32a-mDB-1載體菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè) 將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-mDB-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選單克隆菌株;挑取單克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD600nm為0．6左右，加入終濃度為0．5 mmol/L的IPTG，于28℃下誘導(dǎo)4 h;參照張峰［9］的SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測(cè)。

1．2．5 融合蛋白的Western Blotting鑒定 參照潘秋麗［10］的Western Blotting方法，將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白上樣10 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將電泳凝膠切下進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，再將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。轉(zhuǎn)印條件為:100 mA下電轉(zhuǎn)印2 h，取出轉(zhuǎn)印NC膜，進(jìn)行封閉、抗體孵育和顯色，最后拍照。

1．2．6 目的融合蛋白的分離純化和Elisa檢測(cè) 根據(jù)Ni-NTA柱試劑盒提供的方法，將100 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行純化。最后將純化的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)和蛋白濃度測(cè)定。根據(jù)李川等［11］的Elisa操作方法，將純化后得到的目的融合蛋白加入酶標(biāo)板孔中，以200倍稀釋的Anti-Mus Defensin Beta2多克隆抗體進(jìn)行Elisa檢測(cè)，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅鰭東方鲀防御素基因CDS片段的擴(kuò)增及序列的生物信息學(xué)分析

采用Trizol法提取紅鰭東方鲀皮膚組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，總RNA中28 S、18 S RNA條帶清晰，且28 S條帶亮度是18 S條帶的2倍。以此總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并用PCR擴(kuò)增防御素DB-1成熟肽區(qū)域片段mDB-1，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，PCR擴(kuò)增出120 bp左右的目的片段。

圖1 紅鰭東方鲀皮膚總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the total RNA in skin of redfin puffer Takifugu rubripes

圖2 紅鰭東方鲀防御素mDB-1片段瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of defensin gene mDB-1 fragment in redfin puffer Takifugu rubripes

通過(guò)對(duì)紅鰭東方鲀防御素db-1基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序，結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀防御素db-1基因CDS為210 bp，編碼66個(gè)氨基酸 (圖3)。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析，結(jié)果顯示，編碼氨基酸中1～26號(hào)為信號(hào)肽區(qū)域，30～61號(hào)為成熟肽區(qū)域，成熟肽相對(duì)分子質(zhì)量Mw=3370，pI=8．30。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)成熟肽基因序列和氨基酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該基因位于紅鰭東方鲀第15號(hào)染色體 (GI:351059498)，屬于β-防御素家族，其中該防御素成熟肽氨基酸序列與大西洋鱈魚(yú)Gadus morhua β-防御素［5］和虹鱒 Oncorhynchus mykiss β 防御素-1［6］相似性都高達(dá)97%。通過(guò)Swiss-modle同源建模分析，其分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)反向平行β折疊結(jié)構(gòu)，為β-防御素典型結(jié)構(gòu)［2］(圖4)。

圖3 紅鰭東方鲀防御素基因db-1的CDS和氨基酸序列Fig.3 CDS and amino acid sequences of defensin db-1 gene from redfin puffer Takifugu rubripes

圖4 紅鰭東方鲀防御素DB-1蛋白同源建模分析Fig.4 Homology modeling analysis of defensin DB-1 protein from redfin puffer Takifugu rubripes

2.2 重組表達(dá)載體pET32a-mDB-1的構(gòu)建

將pET32a+載體和擴(kuò)增的mDB-1片段進(jìn)行雙酶切后的片段用T4 DNA酶連接，連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行篩選，用通用引物pETF19/pETR19對(duì)篩選的單克隆菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。取陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，菌檢PCR中有156 bp左右的條帶，為陽(yáng)性克隆，且測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致，說(shuō)明mDB-1片段成功連入 pET32a+載體，pET32a-mDB-1載體構(gòu)建成功。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)及Western Blotting鑒定結(jié)果

圖5 篩選單克隆菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PCR detection of the screened monoclonal strains

對(duì)成功轉(zhuǎn)入pET32a-mDB-1載體的單克隆菌株和成功轉(zhuǎn)入pET32a+載體的單克隆菌株、Rosetta(DE3)菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，分別進(jìn)行 0．5 mmol/L IPTG誘導(dǎo) (28℃，4 h)，然后對(duì)誘導(dǎo)菌體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)和Western Blotting鑒定。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)入pET32a-mDB-1載體的單克隆菌株在相對(duì)分子質(zhì)量為21 700處有一特異性蛋白條帶，而對(duì)照轉(zhuǎn)入pET32a+載體的單克隆菌株在22 600處有一特異性蛋白條帶，空對(duì)照Rosetta(DE3)菌株則沒(méi)有這兩個(gè)條帶。經(jīng)Western Blotting免疫印跡表明，重組蛋白內(nèi)His的標(biāo)簽得到表達(dá)，重組載體得到正確表達(dá) (圖6)。

2.4 重組蛋白的純化

利用重組蛋白內(nèi)含有的His標(biāo)簽，對(duì)目的融合蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白經(jīng)透析過(guò)夜后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè) (圖7)，經(jīng)測(cè)定，純化后的融合蛋白濃度為0．64 ng/μL。

圖6 融合蛋白12%SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)及Western Blotting鑒定結(jié)果Fig.6 Detection of the fusion protein by 12%SDSPAGE gel electrophoresis and Western Blotting

圖7 經(jīng)純化的融合蛋白15%SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果Fig.7 The 15%SDS-PAGE gel electrophoresis of the purified fusion protein

2.5 目的融合蛋白的Elisa檢測(cè)

以Anti-Mus Defensin Beta2抗體為一抗，以HRP-羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行直接Elisa反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性 ［圖8(a)］，且隨融合蛋白濃度的增加呈遞增趨勢(shì) ［圖8(b)］，說(shuō)明目的融合蛋白為防御素蛋白，防御素db-1基因表達(dá)成功。

3 討論

圖8 目的融合蛋白的Elisa檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Elisa analysis of the target fusion protein

防御素成熟肽蛋白為陽(yáng)離子蛋白，分子內(nèi)普遍含有3～4個(gè)二硫鍵，這對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和行使功能十分重要［12］。作為一種具有殺菌抑菌作用的抗菌肽，原核表達(dá)將會(huì)對(duì)宿主菌產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。本研究中采用融合表達(dá)的方法，將mDB-1片段接入pET32a+原核表達(dá)載體中，使目的蛋白與載體表達(dá)的硫氧還原蛋白TrxA進(jìn)行融合表達(dá)，表達(dá)融合蛋白分子變大，對(duì)其功能的發(fā)揮起到一定的限制作用。同時(shí)，TrxA蛋白為陰離子蛋白 (pI=4．67)，不僅可以中和目的蛋白的電荷，避免目的蛋白對(duì)宿主菌的毒害作用，而且還有利于目的蛋白內(nèi)二硫鍵的形成。通過(guò)融合表達(dá)方法在抗菌類多肽表達(dá)方面已有很多先例，叢瀟［13］、李華［14］分別通過(guò)融合表達(dá)方法表達(dá)了海鱸Lateolabrax japonicus和鯉Cyprinus carpio L．抗菌肽Hepcidin;蘇麗娜等［15］將馴鹿β防御素-1基因與pET32a+載體連接，融合表達(dá)了該蛋白;Cipakova等［16］利用輕酶解肌球蛋白在低離子強(qiáng)度條件下沉降、高離子強(qiáng)度條件下溶解的特性，將輕酶解肌球蛋白的C端片段與β-防御素在大腸桿菌中融合表達(dá)，使表達(dá)蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)沉降并以包涵體形式存在，從而避免了表達(dá)的β-防御素對(duì)宿主菌的影響。另外，鐘志霞等［17］采用融合表達(dá)和多拷貝串聯(lián)表達(dá)方式對(duì)人β-防御素2進(jìn)行了原核表達(dá)。

對(duì)于表達(dá)的融合蛋白的檢測(cè)，通常采用Western Blotting方法［1］檢測(cè)，但是Western Blotting只能證明目的基因按照正確的翻譯框架翻譯，不能夠直接證明翻譯出的蛋白具有正確的結(jié)構(gòu)。因此，本研究中利用抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)，通過(guò)以抗防御素β2抗體為探針的Elisa反應(yīng)，進(jìn)一步證明了表達(dá)的融合蛋白為防御素蛋白。

防御素作為一種小分子陽(yáng)離子穩(wěn)定多肽，具有顯著的抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒活性，可以直接作為殺菌抑菌劑，其作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素有本質(zhì)上的不同，因此，不會(huì)殘留，無(wú)耐藥性，也不會(huì)引發(fā)生態(tài)問(wèn)題。另一方面，根據(jù)防御素可增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)、提高免疫力的作用，可將其作為免疫增強(qiáng)劑，如作為飼料添加劑，可提高畜禽成活率和抗病能力。防御素獨(dú)特的作用機(jī)制和穩(wěn)固的分子結(jié)構(gòu)，為多肽類藥物的開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)理想的分子骨架和模板［18］，為新型藥物和材料的開(kāi)發(fā)可提供借鑒。

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