楊 紅，呂國忠，趙志慧，孫曉東，劉紹芹，蘇 丹

(1.大連民族學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連116605;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 會計學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

外來入侵物種(invasive alien species，IAS)對自然生態(tài)系統(tǒng)、生物多樣性造成了嚴重危害，中國僅幾種主要外來入侵物種所造成的經(jīng)濟損失就高達574 億元［1］。三裂葉豚草(Ambrosia trifida L. )又名大破布草，英文名giant ragweed，是菊科(Compositae)豚草屬植物，原產(chǎn)北美，近年來在中國東北、華北地區(qū)不斷蔓延危害［2］。三裂葉豚草植株的競爭和適應(yīng)能力很強，其產(chǎn)生的花粉嚴重污染環(huán)境，對人類健康和作物生產(chǎn)形成巨大威脅，是高度危險的外來入侵物種。目前，三裂葉豚草的防治方法主要以化學(xué)防治和人工拔除為主，但隨著抗磺草胺類除草劑三裂葉豚草種群的出現(xiàn)［3-4］，使化學(xué)防治也面臨嚴峻挑戰(zhàn)［5］。因此，尋找更為有效的防控方法一直是豚草防治的一項重要工作。專性寄生菌被很多研究者認為是非常好的生防因子［6-9］。早在40 年前北美洲就報道了普通豚草(A. artemisiifolia)上的霜霉?。?0-11］，相繼匈牙利有豚草霜霉病的發(fā)生［12-14］，之后劉紹芹等，報道了中國豚草軸霜霉菌引起的三裂葉豚草霜霉病［15］。從超微結(jié)構(gòu)和分子細胞學(xué)角度研究病菌與寄主的相互關(guān)系是當代植物病理學(xué)中極受重視的研究領(lǐng)域之一［16-18］。蒼耳軸霜霉菌是專性寄生菌，劉紹芹曾對包括玉米、小麥、水稻、大豆等23 種不同寄主接種蒼耳軸霜霉菌，結(jié)果表明，該菌只能成功侵染蒼耳，而對其他寄主無侵染力，因此可作為重要防治三裂葉豚草的生防菌資源［19］。

本文利用生物電鏡技術(shù)和細胞化學(xué)方法對蒼耳軸霜霉菌侵染過程中對寄主葉片中的葉綠體和木質(zhì)素的影響進行初步探索，為深入研究蒼耳軸霜霉菌的致病機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將2012 年秋季于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園采集的健康、飽滿的三裂葉豚草種子播種于直徑9 cm 的溫室花盆中，待幼苗長至2 ～4 對葉時接種。蒼耳軸霜霉菌采集于2013 年5 月28 日至6 月15 日，加水配制成100 個·mL-1孢子懸浮液，采用噴霧法接種，保濕培養(yǎng)12 h 后，溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，取發(fā)病葉片進行顯微與超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.2 木質(zhì)素沉積的染色觀察

分別將健康和感病的三裂葉豚草葉片用直徑4 mm 的打孔器打成圓片，置于95 %酒精和冰醋酸(體積比1∶1)的混合液中固定24 h，再將材料放于飽和水合氯醛中透明一周后再轉(zhuǎn)入無水乙醇中放置2 d，存于蒸餾水中。用1 mL 1 %間苯三酚(溶于70 %乙醇中)處理透明過的葉片組織3～6 min，吸干水，用1 mol·L-1的鹽酸處理2 ～5 min，在恒溫展臺加熱95 ℃30 min 以上，待葉片透明變色后觀察［20］。

1.3 透射電鏡樣品的制備及觀察

透射電鏡樣品的制備參考付洪蘭的方法［21］。取新鮮的帶有霜霉菌的病葉，將其切成1 ～2 mm的樣品。用1 % ～5 %戊二醛前固定、1 %鋨酸后固定，經(jīng)丙酮逐級脫水、環(huán)氧樹脂浸透、包埋劑包埋，通過超薄切片機制作5 ×10-1～7 ×10-1nm 的切片，自然干燥。用4 % 醋酸雙氧鈾與枸椽酸鉛滴染后，進行JEM -2000EX 透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 霜霉菌侵入后三裂葉豚草木質(zhì)素沉積情況觀察

經(jīng)制片觀察，霜霉菌侵染三裂葉豚草葉片后，正常葉片葉脈導(dǎo)管界限清晰(如圖1a)，霜霉菌侵入葉片后導(dǎo)管間木質(zhì)素沉積量明顯增多，這表明霜霉菌的侵入，激發(fā)了三裂葉豚草葉片防御反應(yīng)，侵染部位開始有木質(zhì)素的沉積。由圖1b 可以看到被侵染部位已嚴重木質(zhì)化。

圖1 病菌侵染對三裂葉豚草葉片木質(zhì)素的影響

2.2 霜霉菌侵入后三裂葉豚草葉綠體的超微結(jié)構(gòu)觀察

通過對霜霉菌侵染的三裂葉豚草葉片的超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)正常細胞中的細胞器較多，葉綠體形狀完整(如圖2a);而霜霉菌可以破壞葉片組織，使葉綠體膜破碎，內(nèi)含物流失而中空，從而導(dǎo)致葉片的光和能力降低，營養(yǎng)物質(zhì)下降，植株生長受到抑制，但對線粒體無明顯破壞作用(如圖2b)。

圖2 霜霉菌侵染對三裂葉豚草葉片葉綠體的影響

3 討 論

木質(zhì)素是植物體內(nèi)一種重要的物理抗菌物質(zhì)，在與病原菌相互作用中，寄主細胞壁木質(zhì)化是抗病反應(yīng)的特征之一，有強固細胞壁、保護細胞免受病原菌侵害的作用［22］。本研究中，霜霉菌侵染三裂葉豚草后，出現(xiàn)木質(zhì)素明顯沉積。這與黃瓜霜霉病菌侵染黃瓜葉片后木質(zhì)素含量提高有相似之處［23］。木質(zhì)素含量的提高可以提高葉片細胞壁的木質(zhì)化程度，從而提高細胞壁的機械強度，阻止水分和營養(yǎng)向霜霉菌流動，在一定程度上限制霜霉菌侵染點向外擴散，控制病斑發(fā)展，同時大量木質(zhì)素積累也阻止了葉片其他部位對受侵染部位水分和營養(yǎng)的供給，致使豚草葉片的光能利用率降低，產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)的能力下降，三裂葉豚草的有效供給養(yǎng)分降低，從而抑制其營養(yǎng)生長及生殖生長。

通過對霜霉菌侵染后三裂葉豚草葉片結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)霜霉菌侵染對三裂葉豚草葉片光合代謝產(chǎn)生了較大影響。霜霉菌可以破壞葉片組織，使葉綠體膜破碎，內(nèi)含物流失而中空，導(dǎo)致葉片的光和能力降低，但對線粒體無明顯破壞作用，這說明霜霉菌侵染三裂葉豚草后，先以破壞植物葉綠體為主。而蒼耳柄銹菌侵染三裂葉豚草后，當葉片細胞即將壞死時，一些細胞器如線粒體、高爾基體等已先于葉綠體解體，使葉綠體中的淀粉粒逐漸減少，最終隨葉綠體的解體而迅速消失，進而改變了細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)容物流失，最后導(dǎo)致細胞崩解，嚴重破壞三裂葉豚草的生長發(fā)育［24］，這與本研究中葉綠體先于線粒體受損的結(jié)果不一致。病菌侵入植物葉片后，往往都會不同程度造成寄主細胞器結(jié)構(gòu)、功能上的損傷［18，25，26］，但致病菌及寄主互作機制卻會存在一定差異。由于豚草霜霉菌目前只能利用寄主繁殖，其發(fā)病條件會受到各種環(huán)境因子的影響，因此，有關(guān)霜霉菌侵染三裂葉豚草的組織細胞學(xué)變化還需深入研究，特別是有關(guān)蒼耳軸霜霉菌與三裂葉豚草之間的互作關(guān)系，將是充分發(fā)揮霜霉菌作為三裂葉豚草生物防治潛力因子的重要研究內(nèi)容。

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