馬金龍，姜國斌，金 華，郭 鵬，吳 懿

(大連民族學(xué)院a. 生命科學(xué)學(xué)院;b.環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連116605)

Kemble 和Macpheson 在研究黑麥時(shí)發(fā)現(xiàn)，干旱條件下游離脯氨酸大量積累［1］，脯氨酸在滲透調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著細(xì)胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑的作用。從遺傳角度看，植物的抗?jié)B透脅迫功能是一種數(shù)量性狀，是由多種基因控制的綜合反應(yīng)，脯氨酸積累只是植物細(xì)胞對(duì)滲透脅迫反應(yīng)的一種［2］。將脯氨酸作為一種滲透保護(hù)劑的觀點(diǎn)是由Csonka 等在研究細(xì)菌抵抗?jié)B透脅迫時(shí)提出的［3］。Handa 等 和Rhodes 等 都曾報(bào)道過馬鈴薯培養(yǎng)細(xì)胞在滲透脅迫下能迅速積累脯氨酸，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透脅迫表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)能力［4－5］。植物的組織、器官和全株試驗(yàn)中，同樣也發(fā)現(xiàn)了眾多的事例說明脯氨酸的積累與抗?jié)B透脅迫之間有顯著的正相關(guān)［6］。

在滲透脅迫條件下，植物中有10 類基因被誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生的物質(zhì)與植物抗脅迫密切相關(guān)［7］。脯氨酸能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)或通過滲透調(diào)節(jié)維持細(xì)胞膨壓或氧化還原代謝恢復(fù)細(xì)胞的氧化還原平衡，研究植物抗逆性時(shí)，也是重要的研究指標(biāo)［8］。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸［9］，也是抗?jié)B透壓的小分子物質(zhì)。在發(fā)生干旱、鹽漬時(shí)，植物周圍環(huán)境滲透壓發(fā)生變化，大部分植物會(huì)積累大量的脯氨酸，從而抵制高滲環(huán)境對(duì)植物生存和生長的影響［10－12］。

植物質(zhì)外體是溶質(zhì)和水分運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抵抗逆境等許多重要生理生化過程的動(dòng)態(tài)空間，植物質(zhì)外體各項(xiàng)指標(biāo)的研究技術(shù)和方法亟待解決和突破。本研究在前期建立的植物嫩莖質(zhì)外體汁液微透析技術(shù)以及對(duì)鹽脅迫下楊樹嫩莖質(zhì)外體離子等的微透析和光合生理影響研究的基礎(chǔ)上，建立了微透析嫩莖質(zhì)外體中脯氨酸含量鑒定體系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)植物質(zhì)外體滲透脅迫生理機(jī)制研究技術(shù)和理論的創(chuàng)新。

1 材料與方法

1.1 材料

盆栽試驗(yàn)所采用的“吳屯楊”(Populus wutunensis)、“歐美楊”(中荷64)(P. euramericana)及“小美旱楊”［P. simonii ×(P. pyramidalis +Salix matsudana)］由遼寧省阜新縣林業(yè)局提供。在4月上旬進(jìn)行插條盆栽(內(nèi)徑20 cm、高16 cm)，每隔5 ～7 d 澆0.5 L Hoagland 營養(yǎng)液1 次，注意防雨及植株病蟲害防治。微透析MD 取樣后進(jìn)行高效液相色譜HPLC 分析，每個(gè)樣品均重復(fù)3 次。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(日本島津，LC －20A)，配有LC－20AT 泵、LC－20AB 二極管陣列檢測器和島津液相色譜工作站，島津Inertsil ODS －SP 色譜柱(250mm×4.6 mm，5μm)，柱溫31℃，流動(dòng)相A:0.05 mol·L－1醋酸鈉溶液，流動(dòng)相B∶乙腈－流動(dòng)相A(1∶1)，洗脫條件:A∶B(50∶50)，流速:1.0 mL·min－1，檢測波長:254 nm，進(jìn)樣量20 μL［13］;微透析MD 儀(瑞典CMA －400);微透析微量注射泵(美國BASi)。

1.3 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制［14］

(1)儲(chǔ)備液配制:取脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海生工)適量，精密稱量，加0.1 mol·L－1的鹽酸溶液制成每1 mL 含脯氨酸0.1 mg 的溶液，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)液:精密量取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL 玻璃試管中，精密加入1.2 %苯異硫氰酸酯PITC －乙腈溶液及14 %的三乙胺－乙腈溶液各2 mL，漩渦混勻1 min，室溫放置20 min 后，加入正己烷15 mL 萃取，精密移取下層液4 mL，置于5 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 定容，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得標(biāo)準(zhǔn)液。

(3)空白液:取0.1 mol·L－1的鹽酸溶液置于10 mL 玻璃試管中，后續(xù)步驟同(1)。

1.4 植物質(zhì)外體透析液樣品的獲取

微透析體系由導(dǎo)引管、微透析探針、連接管、灌注介質(zhì)、微量注射泵和樣品收集器組成。由于楊樹莖組織相對(duì)動(dòng)物組織較硬，為防止損傷探針，先用導(dǎo)引管插入幼嫩莖的取樣部位，然后再植入探針。探針與嫩莖呈30° ～45°角植入。為防止灌流液損失和探針脫落，采用牙托水(取少許自凝粉，吸取適量義齒基托樹脂液劑攪拌至黏糊狀)將探針插入部位密封好;灌流速度為1 μL·min－1，灌流液為Millipore－Q 超純水。選取截留量為30 kD 的探針［15］。

1.5 微透析探針體外回收率和加標(biāo)回收率的測定

體外相對(duì)回收率:在與微透析取樣楊樹嫩莖相同的條件下，將微透析探針放入已知濃度的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液中進(jìn)行取樣，每次取樣前平衡30 min。測定質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度之比就是體外相對(duì)回收率。試驗(yàn)重復(fù)3 次，得到的體外相對(duì)回收率為9.5 %。

汁液濃度計(jì)算公式:

式中，C 為質(zhì)外體汁液中某離子濃度，C1 為原子吸收分光光度計(jì)測定的質(zhì)量濃度值，10 為稀釋倍數(shù)，0.095 為體外相對(duì)回收率。

加標(biāo)回收率:將微透析儀速度設(shè)為1 μL·min－1，選取吳屯楊嫩莖進(jìn)行微透析取樣，獲取4份透析液待測。在每份透析液中準(zhǔn)確吸取300 μL于4 支小離心管內(nèi)，分別加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定脯氨酸質(zhì)量濃度，根據(jù)測定結(jié)果換算成透析液中加標(biāo)前后脯氨酸的質(zhì)量值。重復(fù)3 次，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007 預(yù)處理后，采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行分析，Sigma plot10.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品定性分析

脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 圖譜如圖1，60 μL 透析液中脯氨酸HPLC 圖譜如圖2。從兩圖中可以看出，二者的脯氨酸出峰時(shí)間均為20.8 min，峰形尖銳，表明60 μL 微透析樣品完全可以檢出脯氨酸。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)方法衍生化脯氨酸HPLC 圖

圖2 60μL 標(biāo)準(zhǔn)品透析液中脯氨酸HPLC 圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限的測定

為了繪制脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制10 mg·L－1脯氨酸的儲(chǔ)備液，分成5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，標(biāo)準(zhǔn)溶液在確定的色譜條件下分別進(jìn)樣。以峰面積為縱座標(biāo)，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫座標(biāo)，將相關(guān)數(shù)據(jù)輸入Excel 2003 進(jìn)行運(yùn)算，得到脯氨酸的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)(見表1)。從表1 可以看出，各標(biāo)樣溶液的質(zhì)量濃度與其峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.998 5 ～1.000 0。

表1 脯氨酸的線性回歸方程數(shù)據(jù)

根據(jù)以上色譜條件作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3)，可以看出，脯氨酸質(zhì)量濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖3 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 透析液脯氨酸樣品的測定

取透析液60 μL，置于0.5 mLTube 管中，加入0.1 mol·L－1PITC － 乙腈溶液25 μL，1.0 mol·L－1三乙胺－ 乙腈溶液25 μL，混勻，室溫放置1 h 后，加50 % 乙腈溶液100 μL，混勻，加入正己烷100 μL，漩渦混勻1 min，放置10 min，取下層溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)液。所用試劑和超純水均經(jīng)過微孔濾膜(0.45 μm)濾過。同時(shí)需要配制空白液:取0.1 mol·L－1的鹽酸溶液置于0.5 mL Tube 管中，后續(xù)步驟同透析液衍生化方法。

將微透析樣品在確定的色譜條件下直接進(jìn)樣，測得的峰面積代入回歸方程計(jì)算出測定值，再依據(jù)探針的體外回收率對(duì)測定值進(jìn)行修正。試驗(yàn)過程中每隔60 min 收集透析液進(jìn)一次樣，透析液樣品色譜如圖4。3 種楊樹(吳屯楊、歐美楊、小美旱楊)的微透析液中脯氨酸的測定結(jié)果見表2。

圖4 3 種楊樹透析液中脯氨酸紫外吸收?qǐng)D譜

表2 3 種楊樹透析液中脯氨酸質(zhì)量濃度 mg·L －1

2.4 透析液樣品加標(biāo)回收率的測定

透析液樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 脯氨酸加標(biāo)回收結(jié)果

3 結(jié)論與討論

脯氨酸是抗?jié)B透壓的最重要的小分子物質(zhì)之一，在發(fā)生干旱、鹽漬時(shí)，植物周圍環(huán)境滲透壓明顯發(fā)生變化，而大部分植物會(huì)積累大量的脯氨酸，抵制高滲環(huán)境對(duì)植物生存和生長的影響。傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法選取植物部分組織破碎后再提取脯氨酸，一方面破壞了植株，無法進(jìn)行持續(xù)研究;另一方面只能測得部分組織中脯氨酸的含量［9，12］。本研究采取微透析法，完全克服了這些缺點(diǎn)，而且可以精準(zhǔn)定位質(zhì)外體中的脯氨酸，還可以在以后的逆境脅迫研究中，與脅迫同步進(jìn)行楊樹質(zhì)外體中脯氨酸含量變化研究，保證研究的準(zhǔn)確、及時(shí)和定位。因微透析法本身就是對(duì)樣品的一種高倍數(shù)稀釋，雖然透析液中脯氨酸含量較少，但通過衍生化方法［14］，再結(jié)合高精度的HPLC 儀器，完全可以準(zhǔn)確檢測楊樹嫩莖質(zhì)外體中脯氨酸的含量。

微透析取樣樣品量少，衍生化是一個(gè)難點(diǎn)。本研究最終確定，樣品體積為60 μL 時(shí)進(jìn)行衍生化可得到較好的結(jié)果。從研究結(jié)果可以看出，通過微透析取樣，將樣品進(jìn)行PITC 衍生化，得到吳屯楊、歐美楊和小美旱楊3 種楊樹嫩莖脯氨酸的質(zhì)量濃度分別為0.341，0.365，0.254 mg·L－1，結(jié)果可靠，重復(fù)性好。試驗(yàn)證明，微透析法是研究植物抗逆生理的有效方法。

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