崔妍，高會曉，仇雪梅、2，楊潤清，劉海金

(1．大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;2．大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023;3．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141)

牙鲆Paralichthys olivaceus隸屬于硬骨魚綱、鰈形目、鰈亞目、牙鲆科、牙鲆屬，屬暖溫性底層海魚，體側(cè)扁，呈長卵圓形［1］。牙鲆具有個體碩大、肉質(zhì)細嫩鮮美、易消化、營養(yǎng)價值高的特點，深受消費者的喜愛。目前，牙鲆的自然資源衰退嚴重，因此，進行大規(guī)模的人工養(yǎng)殖勢在必行［2-3］。從20世紀(jì)60年代起，牙鲆的大規(guī)模養(yǎng)殖技術(shù)逐漸由日本發(fā)展到其他亞洲國家，如中國和韓國等［4］。在中國，牙鲆的人工繁殖發(fā)展迅速，在山東、河北、遼寧等地均實現(xiàn)了規(guī)?；娜斯ゐB(yǎng)殖。牙鲆養(yǎng)殖在快速發(fā)展的同時，高密度集約化方式使得牙鲆的死亡率增加，生長速度下降，造成了產(chǎn)業(yè)的停滯。因此，進行牙鲆優(yōu)良品種和家系的選育，對于進一步提高產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。

魚類育種中所研究的經(jīng)濟性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等大多數(shù)的性狀屬于數(shù)量性狀，由多基因控制，易受環(huán)境影響。通常利用表型選擇和分子標(biāo)記輔助選擇 (marker-assisted selection，MAS)技術(shù)來提高質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀的選擇效率。MAS技術(shù)可以從分子水平上快速準(zhǔn)確地分析個體的遺傳組成，從而實現(xiàn)對基因型的直接選擇，進行分子育種。數(shù)量性狀位點 (quantitative trait locus，QTL)能在應(yīng)用MAS技術(shù)分析性狀時識別控制目標(biāo)性狀的基因在基因組中的位置。進行QTL定位之前需要一個由大量且密集的分子標(biāo)記繪制的遺傳連鎖圖譜。2003年，Coimbra等［5］繪制出了第一個牙鲆回交群體的基因圖譜，該圖譜包括111個微衛(wèi)星標(biāo)記和346個擴增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP)標(biāo)記。隨后，Kang等［6］于2008年利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記 (simple sequence repeats，SSR)構(gòu)建了褐牙鲆的遺傳連鎖圖譜。目前，牙鲆的二代遺傳連鎖圖譜已經(jīng)完成，平均標(biāo)記距離在2 cm以下［7-8］。遺傳連鎖圖譜在基因定位，檢測基因與性狀之間的關(guān)系，研究基因組結(jié)構(gòu)、組織和進化功能等方面有很大作用［9］。

數(shù)量性狀的遺傳結(jié)構(gòu)包括QTL的數(shù)目、位置、主效應(yīng)、上位顯性效應(yīng)和QTL與環(huán)境的互作效應(yīng)。由于對QTL數(shù)量的未知和上位顯性效應(yīng)的巨大，使得對數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)的剖析變得非常復(fù)雜。為了解決這個難題，可以在這些未知參數(shù)基礎(chǔ)上，通過聯(lián)合后驗分布產(chǎn)生后驗樣本，再利用Bayesian定位方法來估計這些參數(shù)。作為Bayesian定位方法中的一種，Bayesian模型選擇方法在解決復(fù)合空間的問題方面有一定的效果［10-11］。Bayesian模型選擇方法是一種有效并且相對簡單的識別復(fù)雜性狀上位QTL定位方法。該方法除了可以用來分析主效應(yīng)QTL之外，還可以用來剖析互作效應(yīng)QTL。Liu等［12］在2013年構(gòu)建了一個通過有絲分裂雌核發(fā)育而得到牙鲆的雙單倍體 (Doubled haploids，DH)群體，同時測量了2齡時每個牙鲆個體的體質(zhì)量和多個形態(tài)性狀。理論上，由雌核發(fā)育制備的雙單倍體會受近交導(dǎo)致的有害純合突變的影響，這些突變通常會在胚胎的早期發(fā)育過程中顯現(xiàn)出來，導(dǎo)致DH后代的存活率較低［13］。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用牙鲆采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心試驗站。數(shù)據(jù)的收集 (包括體質(zhì)量和形態(tài)性狀的測量，基因型的篩選)也是由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心試驗站完成。

1.2 方法

1．2．1 DH群體 用經(jīng)過紫外線 (UV)照射的紅鯛魚 (真鯛魚)精子激活牙鲆卵細胞，然后靜水壓處理 (以阻止第一次有絲分裂)，進而得到雙單倍體的牙鲆受精卵［14］。選取理想的牙鲆個體，雜交產(chǎn)生F1代，再選取一尾雌魚作為誘導(dǎo)DH群體的親本進行有絲分裂雌核發(fā)育。該試驗群體包含157個DH個體，都是由該雌魚的卵子培育而成。在雌核發(fā)育中，精子可以正常的鉆入和刺激卵細胞，但由于精子是經(jīng)過處理的，精子的細胞核并未參與卵細胞的發(fā)育，不會對后代有遺傳貢獻。本試驗中，用紅鯛精子代替牙鲆精子來激活鲆卵的發(fā)育，可以確保存活的后代都屬于真正意義上的雌核發(fā)育。

1．2．2 性狀測量 在牙鲆2齡時，測量牙鲆DH群體中157個個體的體質(zhì)量和形態(tài)性狀。用2-苯氧基乙醇麻醉每個個體，分別移到同一個板上稱重并記錄，確保所有數(shù)據(jù)的真實性且誤差最小，同時測量每條魚的實際長度。測量結(jié)果包括體質(zhì)量和全長、體長、頭長、尾柄長、背鰭基長、腹鰭基長等11個形態(tài)性狀，測量的位置示意圖見圖1。

圖1 牙鲆體尺性狀測量標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Measurement standards of morphological traits in Japanese flounder Paralichthys olivaceus

1．2．3 遺傳連鎖圖譜 遺傳連鎖圖譜有助于深入開展各生物種類的分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究。本研究中，用622個 (481個 II型 SSRs和 141個EST-SSRs)多態(tài)性SSR標(biāo)記，并利用Joinmap 4．0軟件來構(gòu)建牙鲆遺傳連鎖圖譜。圖譜總長度為1214．7 cm，相鄰的單一標(biāo)記位點之間的平均間隔為2．65 cm。該圖譜中有574個標(biāo)記定位在458個單一位置上，并且分布在24個連鎖群上，同時還有48個標(biāo)記沒有定位到任何連鎖群上。用卡方檢驗統(tǒng)計推斷這些標(biāo)記，50%左右的標(biāo)記表現(xiàn)出偏分離，不符合1∶1的Mendelian分離比。偏分離對QTL的顯性效應(yīng)有較大影響，但不總是影響QTL的加性效應(yīng)［15］。由于所分析的DH牙鲆群體只有加性效應(yīng)，因此，在進行QTL定位和互作分析時，將所有的標(biāo)記考慮在內(nèi)。

1．2．4 QTL定位 在牙鲆DH群體中，每個位點只有加性效應(yīng)和不同位點之間的互作效應(yīng)。假設(shè)每個位點的兩種基因型分別用QQ和qq表示，在Cockerham's遺傳模型［16］基礎(chǔ)上建立一個遺傳定位模型，用來分析單性狀中QTL和互作的QTL，模型如下:

其中:yi為DH群體的第i個個體的表型值;μ為群體平均值;q為QTL的個數(shù);aj為第j個QTL的加性效應(yīng) (j=1，2，…，q);zij為第i個個體的第j個位點的基因型指數(shù);aa為第j個和第k個QTL加性效應(yīng)的乘積;xijk=zij×zik;ei為剩余誤差。

在上述模型的基礎(chǔ)上，利用 R/qtlbim(www．qtlbim．org)安裝包［17］，采用 Bayesian 模型選擇方法［10-11］，對體質(zhì)量和形態(tài)性狀進行全基因組的互作分析。根據(jù)2013年Liu等［12］區(qū)間作圖的結(jié)果，分別將主效應(yīng)QTL和上位QTL的預(yù)期數(shù)目設(shè)定為4和5，因此，QTL數(shù)目的上限為9+3 9=18。在對每個性狀應(yīng)用MCMC算法時，第10 000輪作為burn-in被去掉，以使Markov鏈正確混合。然后，對每個觀測值跑40輪，產(chǎn)生3000個相對獨立的樣本后，推斷所分析性狀的遺傳結(jié)構(gòu)，總共跑1．3×105輪。

2 結(jié)果與分析

用Bayesian因子BF［18］作為推斷每個位點的主效應(yīng)，在顯著性水平0．05上，BF的閾值為3或2lnBF值超過2．1即為主效應(yīng)。表1和表2分別為體質(zhì)量和11個形態(tài)性狀的主效應(yīng)QTL和互作QTL的定位結(jié)果及其遺傳參數(shù)。

2.1 體質(zhì)量

體質(zhì)量性狀中檢測到了一個主效應(yīng)QTL，該QTL對體質(zhì)量性狀具有負向加性作用，它解釋的表型變異的聯(lián)合效應(yīng)為1．6%(表1);體質(zhì)量性狀中還檢測到5對互作效應(yīng)，其中3對互作效應(yīng)表現(xiàn)出非常強的加加上位性效應(yīng)，說明這3對互作QTL對體質(zhì)量影響最大，分布在21和23號染色體上的一對互作QTL貢獻率較大 (23．1%)，而其他互作QTL的貢獻率較低 (7．0%～8．7%)(表2)。

2.2 縱向性狀

全長、頭長、體長、尾柄長、尾長、腹鰭基長、背鰭基長7個形態(tài)性狀都屬于縱向性狀。根據(jù)其主效應(yīng)QTL的個數(shù)，將其分為三類:

(1)尾長 (CL)、全長 (TL)和腹鰭基長(PFL)中各自檢測到兩個主效應(yīng)QTL，其中，全長和腹鰭基長性狀中分別都有一個位于6號染色體上的QTL，且效應(yīng)都為負 (表1)。3個性狀的互作結(jié)果表明，只有尾長中的兩對互作效應(yīng)較小，其他均在10%左右 (表2)。

(2)體長 (BL)和背鰭基長 (DFL)，在這兩個性狀的6、9、22號染色體上各發(fā)現(xiàn)了1個主效應(yīng)QTL，除了位于22號染色體上的QTL外，其他QTL對所在性狀產(chǎn)生負的加性效應(yīng)，這些QTL所解釋的表型方差在2．3%～8．6%(表1)。在這2個性狀中分別檢測到4對和5對互作QTL，只有分布在6號和17號染色體上的一對互作QTL對背鰭基長有較高的加加上位性效應(yīng) (表2)。

(3)頭長 (HL)和尾柄長 (CPL)中檢測主效應(yīng)QTL的個數(shù)都≥4個，它們所解釋的表型變異聯(lián)合效應(yīng)值都在17%左右 (表1)。頭長和尾柄長中各發(fā)現(xiàn)3對和4對互作QTL，互作貢獻率都為10%左右 (表2)。

表1 利用Bayesian模型選擇法分析牙鲆體質(zhì)量和形態(tài)性狀的主效應(yīng)QTL及其遺傳參數(shù)Tab.1 Main effect QTL and genetical parameters of body weight and morphobological traits in Japanese flounder Paralichthys olivaceus detected by Bayesian model selection

表2 牙鲆體質(zhì)量和形態(tài)性狀的上位顯性基因互作效應(yīng)Tab.2 Epistatic effects for body weight and morphobological traits in Japanese flounder

2.3 垂直性狀

除了上述性狀外，頭高、體高、尾高、尾柄高4個形態(tài)性狀都屬于垂直性狀。

(1)在頭高 (HW)和體高 (BD)中，各發(fā)現(xiàn)了兩個主效應(yīng)QTL，其中3個為正的加性效應(yīng)，1個為負的加性效應(yīng) (表1);在這2個性狀中共檢測到10對互作QTL(表2)。

(2)控制尾高 (CW)性狀的4個主效應(yīng)QTL分別位于5、7、8、13號染色體上，單個QTL貢獻率分別為 2．1%、1．6%、0．7%、0．8%(表 1);在尾高中檢測到5對互作QTL，它們的互作貢獻率為 7．6%～13．3%。

(3)所分析的性狀中，尾柄高 (CPW)中所檢測到的QTL個數(shù)最多，共有6個，單個QTL解釋的表型方差為0．5%～8．9%(表1);同時還發(fā)現(xiàn)了4對互作的QTL，每對互作QTL的貢獻率都在10%左右 (表2)。

2.4 多效性的QTL

在定位結(jié)果中可見多個 QTL共定位現(xiàn)象，位于6［0．0］的主效應(yīng) QTL分別控制體質(zhì)量、全長、體長、尾柄長、背鰭基長、體高、尾柄高、頭高，且大部分的效應(yīng)方向相同，另外還發(fā)現(xiàn)了8個主效應(yīng)QTL表現(xiàn)出多效性 (表1)。同時，在互作分析結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)了多效性，分布在6［61．0］×9［93．3］的互作 QTL，在全長、體長、頭長、腹鰭基長、尾柄高、頭高、尾長中都發(fā)揮了重要的作用(表 2)。

3 討論

目前，關(guān)于牙鲆QTL定位方面的研究還比較少。Song等［8］于2012年建立了一個半年生的全同胞牙鲆家系群體，并對所有個體的體質(zhì)量和體寬兩個性狀值進行了測量。隨后選用WinQTLCart 2．5軟件的復(fù)合區(qū)間作圖 (CIM)方法對該群體進行了QTL定位研究，在兩個性狀中分別定位了1個和3個主效應(yīng)QTL，并且都位于14號連鎖群上。2013年，Liu等［12］應(yīng)用MapQTL軟件的多QTL定位模型(MQM)［19-20］對2齡DH牙鲆群體的體質(zhì)量和形態(tài)性狀進行了QTL定位研究。本研究中，利用R/qtlbim(www．qtlbim．org)安裝包［17］，采用 Bayesian模型選擇方法［10-11］，對2齡DH牙鲆群體的體質(zhì)量和11個形態(tài)性狀進行QTL定位分析。雖然Song等［8］和本研究中都對體質(zhì)量性狀進行了QTL研究，然而定位到的QTL并不相同。與Liu等［12］的定位分析相比，本研究與Liu等［12］所研究的都是2齡DH牙鲆群體，同時在兩種定位分析中，都對頭長、尾柄長、尾柄高這3個性狀進行了分析，都在這3個性狀中分別定位到了相同的主效應(yīng)QTL(位于相同染色體上的同樣的位置)，說明這些主效應(yīng)QTL對相應(yīng)性狀的效應(yīng)極其顯著且易被檢測到。綜上，在QTL定位研究中，研究群體的不同及所使用定位軟件的不同都會造成定位結(jié)果的差異。

本研究中同時發(fā)現(xiàn)了50對上位互作效應(yīng)，所解釋的表型方差范圍為2．3%～23．1%，這個結(jié)果比主效應(yīng)所解釋的百分比要高，說明這些性狀的遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。本研究中發(fā)現(xiàn)主效應(yīng)和互作效應(yīng)有以下規(guī)律:

(1)主效應(yīng)中檢測到QTL參與上位性互作效應(yīng);

(2)主效應(yīng)中未檢測到的QTL出現(xiàn)在上位性互作效應(yīng)中，但發(fā)現(xiàn)一個QTL與多個QTL有互作關(guān)系。

關(guān)于互作QTL的定位方面的研究會增加對于遺傳標(biāo)記與所研究性狀之間相關(guān)信息的了解，也可以提高鑒定生長基因的效率［21］。在牙鲆育種過程中，通過標(biāo)記輔助選擇，有用的遺傳變異可以推進遺傳研究的進展。

相關(guān)的性狀一般共定位在同一個連鎖群或同一個聯(lián)鎖區(qū)間上。多數(shù)情況下，相關(guān)性狀出現(xiàn)共定位的QTL可能是一因多效的結(jié)果，也可能是由于性狀之間相互依賴的結(jié)果［22］。關(guān)于多效性的分子機制的研究結(jié)果表明，多效基因主要是基因產(chǎn)物等單個分子活動的結(jié)果，而不是同一個基因產(chǎn)物參與多個分子過程［22］。本研究中，利用Bayesian模型選擇方法分析12個性狀后，發(fā)現(xiàn)8個主效應(yīng)QTL和7對互作效應(yīng) QTL具有多效性。此外，在應(yīng)用Bayesian模型選擇方法分析多個性狀時，如何更有效、準(zhǔn)確地定位QTL還需進一步研究。

目前，關(guān)于如何應(yīng)用QTL定位和互作效應(yīng)分析來選擇遺傳穩(wěn)定、貢獻率高的QTL以提高牙鲆經(jīng)濟性狀的穩(wěn)定遺傳和表達的研究越來越多。優(yōu)先選擇與主效應(yīng)QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記進行標(biāo)記輔助選擇，對有效地認識數(shù)量性狀的遺傳機制，進一步精細定位、克隆與分子設(shè)計育種可提供便利［23］。隨著分子標(biāo)記和QTL分析技術(shù)的不斷成熟與發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種在牙鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用也展現(xiàn)出誘人的前景。

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