席慶凱，張穎，劉曉勇，潘鵬，孫大江

(1．上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306;2．中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070;3．中國水產(chǎn)科學研究院，北京100141)

施氏鱘Acipenser schrenckii隸屬于鱘形目Acipenseriformes、鱘科 Acipenseridae、鱘屬 Acipenser，在黑龍江、烏蘇里江和松花江等地均有分布［1］，目前已成為中國主要的鱘魚養(yǎng)殖種類［2-3］。近年來，中國鱘魚苗種孵化率降低，品質(zhì)衰退日益成為苗種培育的制約因素。由于養(yǎng)殖環(huán)境的惡化、品質(zhì)衰退等原因，施氏鱘胚胎發(fā)育階段死亡率較高，造成的損失較大。眾多研究表明:可溶性蛋白、性激素水平、非特異性免疫機制對維持幼魚正常發(fā)育，提高成活率和苗種質(zhì)量等均具有重要的作用［4-10］。關于施氏鱘胚胎發(fā)育過程中可溶性蛋白、性激素水平和免疫相關指標的研究目前尚未見報道。本研究中，采用生物化學方法對施氏鱘胚胎發(fā)育過程中可溶性蛋白濃度、性激素水平和抗氧化酶活性等相關免疫指標進行了研究，旨在探討施氏鱘胚胎發(fā)育與可溶性蛋白、性激素和抗氧化酶等免疫相關指標之間的關系，為提高其孵化率及苗種質(zhì)量提供基礎數(shù)據(jù)，進而為中國鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

施氏鱘各發(fā)育時期的胚胎取自中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚繁育技術工程中心，為全人工繁殖受精卵，在孵化車間內(nèi)常規(guī)孵化，孵化水溫為16～17℃，溶氧＞6．0 mg/L。孵化期內(nèi)用解剖鏡觀察胚胎的形態(tài)變化，每2 h觀察一次，在卵裂期、卵黃栓期、神經(jīng)胚期、視泡期、心搏期、孵出前期、孵出期等7個發(fā)育時期取樣 (取3對親本的受精卵，每對親本10 g左右)。用濾紙吸干其水分后，放入5 mL的采樣管中，于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1．2．1 樣品的制備 取不同發(fā)育時期的施氏鱘胚胎樣品，設3個平行，分別稱重 (約1．5 g，精確到0．01 g)，分別加入3倍體積的PBS緩沖液，冰浴勻漿5 min，4℃下以3000 r/min離心10 min，取上清液分裝，于超低溫冰箱 (-80℃)中保存，用于可溶性蛋白濃度、免疫酶活性等相關指標的測定。

1．2．2 可溶性蛋白濃度的測定 采用南京建成生物工程研究所的考馬斯亮藍試劑盒測定施氏鱘胚胎的可溶性蛋白濃度。

1．2．3 性激素的測定 采用甲醇提取法［11］提取胚胎17β-雌二醇 (E2)和雄激素睪酮 (T)，使用BECKMAN ACESSⅡ放免儀及BECKMAN ACESSⅡE2和T試劑盒進行測定。

1．2．4 酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性和還原型谷胱甘肽 (GSH)、過氧化反應產(chǎn)物丙二醛 (MDA)含量的測定 采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，參照各種酶活檢測試劑盒的操作進行酶活性測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差 (mean±S．D．)表示。采用 SPSS 18．0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan法進行多重比較分析，顯著性水平設為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時期施氏鱘胚胎的可溶性蛋白濃度

施氏鱘胚胎發(fā)育過程中，可溶性蛋白濃度的變化規(guī)律見圖1。從圖1可見:整個胚胎發(fā)育過程中，不同發(fā)育時期的可溶性蛋白濃度變化較大;視泡期和孵出前期胚胎的可溶性蛋白濃度較高，在視泡期達到最高值，為5．20 mg/mL，均顯著高于其他發(fā)育時期 (P＜0．05);卵黃栓期和心搏期胚胎的可溶性蛋白濃度較低，且顯著低于其他發(fā)育時期(P＜0．05)，卵黃栓期達到最低值，為 2．62 mg/mL;孵出期蛋白濃度比孵出前期略有降低(P＞0．05)，為 4．10 mg/mL。

圖1 不同發(fā)育時期施氏鱘胚胎可溶性蛋白濃度的變化Fig.1 Contents of soluble proteins during embryonic development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii

2.2 不同發(fā)育時期施氏鱘胚胎的非特異性免疫指標

從表1可見:胚胎發(fā)育各時期，ACP活性均高于AKP活性;卵黃栓期ACP活性 (34．66 U/g)較卵裂期 (47．75 U/g)顯著降低 (P＜0．05)，孵出前期、孵出期ACP活性又顯著升高 (P＜0．05);與ACP相比，AKP活性變化較小，由卵裂期到心搏期，AKP活性逐漸降低，孵出前期較心搏期又顯著升高 (P＜0．05)。總體來說，ACP活性均隨胚胎的發(fā)育先降低后上升，且孵出期仔魚的ACP活性顯著高于卵裂期 (P＜0．05)，而孵出期仔魚的AKP活性則顯著低于卵裂期 (P＜0．05)。

從表1可見:胚胎發(fā)育過程中，CAT和SOD活性的變化規(guī)律有所不同，CAT活性除在孵出前期略有降低外，總體呈逐漸升高的趨勢，由卵裂期的1．46 U/mg逐漸升高至孵出期的 2．57 U/mg;SOD活性則由卵裂期的最高值 (3．19 U/mg)顯著降低為心搏期的最低值 (1．74 U/mg)(P＜0．05)，隨后在孵出前期略升高，至孵出期SOD活性為2．12 U/mg。

從表1還可見:GSH含量在胚胎發(fā)育階段呈先緩慢降低后急劇升高的趨勢，心搏期GSH含量最低，為1．47 μmol/g，孵出期GSH含量最高，為3．52 μmol/g;MDA含量在胚胎發(fā)育階段的變化趨勢為先升高后降低又升高，神經(jīng)胚期含量最高，為0．17 nmol/mg，心搏期含量最低，為0．07 nmol/mg，孵出前期至孵出期又顯著增加 (P＜0．05)，孵出期 MDA 含量達 0．16 nmol/mg。

表1 不同發(fā)育時期施氏鱘胚胎ACP、AKP、CAT、SOD活性及GSH、MDA含量的變化Tab.1 Changes in ACP，AKP，CAT，and SOD activitise and GSH and MDA contents during embryonic development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii

2.3 不同發(fā)育時期施氏鱘胚胎的性激素水平

從圖2可見:整個胚胎發(fā)育期間，施氏鱘胚胎的T含量呈降低趨勢，而在孵出前期又顯著升高形成峰值 (260 pg/g)后迅速降低 (P＜0．05)，至孵出期降低至120 pg/g;與 T含量變化不同，17β-E2含量隨胚胎的發(fā)育在心搏期逐漸降低至44．38 pg/g，但均無顯著性變化 (P＞0．05)，但至孵出前期17β-E2含量又顯著升高 (P＜0．05)，達最高峰值498．52 pg/g，之后又顯著降低至孵出期的 58．42 pg/g(P＜0．05)。

圖2 不同發(fā)育時期施氏鱘胚胎雌二醇、睪酮含量的變化Fig.2 Changes in 17β－E2and T levels during embryonic development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii

3 討論

3.1 胚胎發(fā)育過程中可溶性蛋白濃度的變化

胚胎發(fā)育期是魚類個體發(fā)育的重要階段，此階段胚胎的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能均存在顯著變化［12-13］?？扇苄缘鞍鬃鳛轸~類胚胎發(fā)育的重要物質(zhì)基礎，可以作為酶、調(diào)控蛋白、信號蛋白和運輸?shù)鞍椎葏⑴c個體組織構(gòu)建、機體新陳代謝等活動［8-10，14-16］。

本研究中，施氏鱘胚胎期的可溶性蛋白濃度在視泡期、孵出前期和孵出期較高。施氏鱘胚胎期可溶性蛋白濃度呈先升高后降低再升高的趨勢，這與河川沙塘鱧［14］和長蛸［8］胚胎期可溶性蛋白濃度呈先升高后降低的變化趨勢不同，差異體現(xiàn)在施氏鱘胚胎從卵黃栓期到視泡期可溶性蛋白濃度有一上升的過程。本研究中通過觀察發(fā)現(xiàn)，卵黃栓期到視泡期歷時16 h，主要為神經(jīng)板等神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，外觀總體變化不大，推測可溶性蛋白消耗低于卵黃蛋白分解為可溶性蛋白的速度，因此，可溶性蛋白總量呈上升趨勢。而視泡期到心搏期歷時47 h，期間形成大量的器官原基，如眼原基、咽弧原基、腦室、心臟原基、尾芽、嗅板、聽泡等結(jié)構(gòu)［17］，并在后期出現(xiàn)肌肉效應，這些變化均需要消耗大量的可溶性蛋白來提供物質(zhì)基礎和能量［8，14］，因此，這一階段可溶性蛋白濃度有較大幅度下降。由于心搏期開始出現(xiàn)心跳，血液循環(huán)系統(tǒng)初步形成，使蛋白的分解轉(zhuǎn)運效率顯著提高并遠大于消耗速度，所以形成心搏期至孵出期可溶性蛋白濃度的升高。

3.2 胚胎發(fā)育過程中免疫相關酶的變化

胚胎發(fā)育過程中，活躍的細胞代謝活動會產(chǎn)生大量的活性氧，可引起細胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物的增加，產(chǎn)生細胞毒性，導致胚胎發(fā)育阻滯或延遲［4-5］。魚類的抗氧化酶系和非酶抗氧化小分子對維持胚胎期發(fā)育過程中產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物水平具有重要的作用［5-6，18］。

ACP、AKP是兩種重要的機體功能調(diào)節(jié)酶，大量研究表明，其活力指標與細胞免疫、體液免疫活動密切相關，反映了機體的防御能力［19］。本研究中，自卵黃栓期之后ACP活性逐漸升高，心搏期后增加尤為明顯，在孵出期顯著升高，這與貽貝早期發(fā)育過程中的ACP活力隨胚胎的發(fā)育逐漸升高［20-21］的狀況一致，說明ACP在破膜時要發(fā)揮重要作用。這種趨勢的形成，推測原因可能是與心搏期后胚胎血液循環(huán)系統(tǒng)開始形成，自體產(chǎn)生ACP有關。有研究表明，溶酶體酶主要來源于血淋巴和血細胞，血細胞吞噬過程中會釋放出 ACP。與ACP相比，AKP活性較低且有所下降，也與對貽貝的研究結(jié)果一致。這可能與施氏鱘發(fā)育早期時肝臟與骨骼系統(tǒng)不完善、骨化作用較弱有關。ACP與AKP活性的差異，說明施氏鱘在胚胎發(fā)育時期ACP要比AKP發(fā)揮更重要的作用。

生物體在長期的進化過程中形成了一套完整的抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)多余的活性氧，抗氧化系統(tǒng)包括非酶類抗氧化劑和酶類抗氧化劑，CAT、SOD均屬于酶類抗氧化劑，有研究表明，這兩種酶的活性與魚體細胞免疫防御能力密切相關。通過對幼魚期施氏鱘抗氧化能力的研究表明，SOD、CAT能有效地對抗機體的氧化損傷［13］。本研究中，SOD活性在施氏鱘胚胎發(fā)育階段顯著降低，這與對金魚胚胎的研究結(jié)果一致［6］，推測原因可能是胚胎時期自身合成SOD能力較弱，母源性SOD隨著氧化損傷的加重而逐漸消耗所致。與SOD不同，CAT活性變化呈明顯升高的趨勢，這說明在胚胎發(fā)育過程中受到過氧化氫損傷，胚胎產(chǎn)生CAT分解過氧化氫，緩解其造成的損傷。Rudneva［22］研究發(fā)現(xiàn)，CAT活性增強與其應對活性氧對機體造成的損傷有關。

GSH屬于抗氧化系統(tǒng)中的非酶類抗氧化分子，具有抗氧化和解毒功能，通過參與氧化還原反應，清除自由基［23］。本研究中，GSH含量在心搏期前下降，心搏期后顯著升高，推測可能是發(fā)育初期受精卵合成GSH的能力較弱，而母源性GSH逐漸消耗，心搏期后血液循環(huán)系統(tǒng)形成，自身具備合成GSH能力所致。還有一種可能即觀察發(fā)現(xiàn)，胚胎在神經(jīng)胚期與心搏期死亡率較高，而心搏期之后死亡率變低，這說明胚胎在心搏期前受到的損傷較大，部分胚胎處于脅迫狀態(tài)，故GSH消耗較大。

過氧化反應產(chǎn)物MDA的含量可反映機體過氧化的程度，間接地反映出組織細胞受自由基損傷的嚴重程度［24］。本研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)胚期MDA含量有一峰值，這與神經(jīng)胚期胚胎死亡率較高的現(xiàn)象相一致，印證了胚胎在神經(jīng)胚期受過氧化損傷較嚴重的猜測。心搏期后MDA含量又顯著升高，與豐程程等［25］及 Díaz等［13］的研究結(jié)果一致。說明隨著發(fā)育時間的延長，胚胎所受的氧化損傷逐漸加重。這也解釋了生產(chǎn)中施氏鱘胚胎孵化時間越長死亡率越高的現(xiàn)象。

綜合分析，ACP、AKP、SOD活性和GSH含量在施氏鱘胚胎發(fā)育初期均有所降低，表明機體受到了一定的氧化損傷，間接說明了胚胎發(fā)育初期體內(nèi)存在母源性的免疫相關酶。胚胎發(fā)育中ACP、CAT活性和GSH含量都有升高的趨勢，說明胚胎在免疫等各組織器官發(fā)育完全之前就能夠通過自身合成而具備一定的免疫能力。MDA含量在胚胎發(fā)育后期明顯增加，說明胚胎自身的抗氧化能力依然不足以抵消過氧化損傷，因此，在生產(chǎn)實踐中要細心管理，努力降低外界環(huán)境的應激，以提高施氏鱘出苗率。

3.3 胚胎發(fā)育過程中性激素水平的變化

研究表明，魚類排卵前卵母細胞的雙層濾泡膜產(chǎn)生性類固醇激素，以供其在胚胎發(fā)育過程中進行生理代謝［26］以及胚后發(fā)育。根據(jù)學者對虹鱒［27-28］、羅非魚［12］、銀鮭［29］、中華鱘［30］和斑馬魚［31］等胚胎期性激素變化水平的研究結(jié)果，性激素在魚類胚胎發(fā)育過程中具有重要的生物學功能。本研究中，施氏鱘胚胎期T含量在孵出期較卵裂期顯著降低，與中華鱘、虹鱒、羅非魚等硬骨魚類胚胎期性類固醇激素的變化規(guī)律基本相同。施氏鱘胚胎期T和17β-E2含量在心搏期前呈逐漸下降趨勢，這與羅非魚［12］、虹鱒［27-28］魚卵剛受精后的性類固醇激素含量很高、發(fā)育期間逐漸降低一致。原因是母源性類固醇激素在發(fā)育過程中不斷代謝，使這些激素水平下降。

與以往研究不同的是，在本研究中孵出前期17β-E2和T含量均出現(xiàn)濃度高峰，而虹鱒、羅非魚是在仔魚出膜后才逐漸上升，施氏鱘提前了至少一個時期，這與母源性激素在胚胎期逐漸消耗的猜測不符，與中華鱘17β-E2水平在一定范圍內(nèi)波動［30］也不同。施氏鱘17β-E2和T含量高峰出現(xiàn)的原因尚無類似先例可以參照，可能的原因是在胚胎發(fā)育后期胚胎自身已經(jīng)可以合成類固醇激素。吳湘香等［30］對中華鱘早期類固醇激素的研究中提到類固醇合成的時期有爭議，一般認為，類固醇激素的合成要在魚類性別分化完成后［26］，但也有學者認為，性腺分化過程存在性類固醇激素的誘導作用［32］。施氏鱘與中華鱘都為性腺分化時間較晚的晚成熟魚類，有研究表明，施氏鱘組織學性腺分化起始于6月齡［3］，因此，本研究中孵出前期17β-E2和T水平升高的原因歸結(jié)為自身合成性類固醇激素，這表明施氏鱘在性別分化之前即可自身合成性類固醇激素。孵出前期為個體由胚胎期向仔魚期轉(zhuǎn)化的重要階段，而性類固醇激素在多種生理功能、多種器官發(fā)育中具有的重要調(diào)控功能［25］也印證了孵出前期17β-E2和T高水平的結(jié)果。

綜上所述，施氏鱘在胚胎發(fā)育時期可溶性蛋白濃度在心搏期到孵出前期這一階段存在一個上升的趨勢，且在心搏期均處于較低水平，這與ACP活性和GSH、17β-E2、T含量的變化規(guī)律一致，表明此時期這幾項指標存在某種必然的聯(lián)系，也間接證明了孵出前期這一階段的重要性。ACP、CAT活性和GSH含量在整個發(fā)育過程中增加，表明其是胚胎發(fā)育階段的主要免疫因子，發(fā)揮的作用大于AKP、SOD、MDA含量的變化，與胚胎在各時期的死亡率存在一定關系。胚胎發(fā)育是魚類生長發(fā)育最脆弱的階段，如何滿足其蛋白需求，提高胚胎的免疫能力，維持適宜的性激素水平，是提高施氏鱘苗種孵化率及苗種品質(zhì)的關鍵問題。因此，進一步研究胚胎時期的營養(yǎng)需求與免疫能力的關系，減少環(huán)境引起的應激因素，均有助于施氏鱘苗種的培育，從而促進其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

［1］孫大江，曲秋芝，王丙乾，等．施氏鱘不同年齡性腺發(fā)育與性類固醇激素濃度關系［J］．中國水產(chǎn)科學，2004，11(4):307-312．

［2］孫大江，曲秋芝，張穎，等．中國的鱘魚養(yǎng)殖［J］．水產(chǎn)學雜志，2011，24(4):68-70．

［3］張穎，孫慧武，劉曉勇，等．施氏鱘的性腺分化及養(yǎng)殖水溫對其性腺分化的影響［J］．中國水產(chǎn)科學，2012，19(6):1008-1017．

［4］莊利利，胡德寶，蔡麗娟，等．哺乳動物胚胎的活性氧來源及其抗氧化機制［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(3):173-176．

［5］楊維維，劉文斌，沈美芳，等．海帶粉對克氏原螯蝦生長、非特異性免疫和肝胰臟抗氧化能力的影響［J］．大連海洋大學學報，2014，29(1):40-44．

［6］孔祥會，王書平，江紅霞，等．金魚胚胎發(fā)育過程中免疫相關酶活性及丙二醛含量的變化［J］．中國水產(chǎn)科學，2011，18(6):1293-1298．

［7］Ciulei I．Phyothemical and pharmacological research on anthocyanin for obtaining new natural drugs［J］．An R Acad Farm，1990，56(4):531-537．

［8］詹萍萍，王春琳，張曉梅，等．長蛸胚胎發(fā)育過程中可溶性蛋白含量及組成變化［J］．海洋學研究，2010，28(4):65-69．

［9］王曉燕，常亞青，丁君，等．降溫對刺參免疫酶、可溶性蛋白及可溶性糖影響的初步研究［J］．農(nóng)學學報，2012，2(4):44-49．

［10］孔祥會，張紅緒，王桂忠，等．鋸緣青蟹可溶性蛋白與可溶性糖的季節(jié)變化［J］．河南師范大學學報，2008，36(1):99-102．

［11］宮瑋．鴨胚蛋中激素檢測方法的研究［D］．泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2007．

［12］Hines G A，Boots L R，Wibbels T，et al．Steroid levels and steroid metabolism in relation to early gonadal development in the tilapia Oreochromis niloticus(Teleostei Cyprinoidei)［J］．Gen Comp Endocrino，1999，114(2):235-248．

［13］Díaz M E，F(xiàn)urné M，Trenzado C E，et al．Antioxidant defences in the first life phases of the sturgeon Acipenser naccarii［J］．Aquaculture，2010，307(1/2):123-129．

［14］胡先成，羅穎，趙云龍，等．河川沙塘鱧胚胎發(fā)育過程中可溶性蛋白組成及含量的變化［J］．淡水漁業(yè)，2008，38(1):20-22．

［15］姚俊杰，胡先成，趙云龍，等．羅氏沼蝦胚胎發(fā)育過程中蛋白質(zhì)含量及氨基酸的組成［J］．上海師范大學學報:自然科學版，2004(S):26-32

［16］何登菊，姚俊杰，趙云龍，等．甌江彩鯉胚胎發(fā)育過程中脂蛋白及碳水化合物水平的變化［J］．動物學雜志，2011，46(2):102-107．

［17］劉洪柏，宋蘇祥，孫大江，等．施氏鱘胚胎及胚后發(fā)育研究［J］．中國水產(chǎn)科學，2000，7(3):5-10．

［18］黃勇，繆彪．超氧化物歧化酶在斑馬魚早期胚胎中的表達特點［J］．陜西理工學院學報，2008，24(3):90-94．

［19］孫紅梅，黃權，叢波．饑餓對黃顙魚血液中幾種免疫相關因子的影響［J］．大連水產(chǎn)學院學報，2006，21(4):307-310．

［20］孫虎山，王宜艷，梁建光，等．貽貝(Mytilus edulis)發(fā)育早期酸性和堿性磷酸酶活性［J］．海洋與湖沼，2008，39(1):42-48．

［21］Sarosiek B，Wysocka J，Wysocki P，et al．Characteristics of acid phosphatase from Russian sturgeon(Acipenser gueldenstaedtii)spermatozoa［J］．J Appl Ichthyol，2006，22(S1):375-379．

［22］Rudneva I I．Antioxidant system of Black Sea animals in early development［J］．Comp Biochem Physiol，1999，122(2):265-271．

［23］柳海星．GSH和過氧化氫對小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響［J］．延邊大學農(nóng)學學報，2010，32(4):281-284．

［24］魯疆，王占洋，袁玉婷，等．氯化鎘對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性［J］．生態(tài)毒理學報，2013，8(3):381-383．

［25］豐程程，張穎，張永泉，等．哲羅魚胚胎至仔稚幼魚期主要免疫指標和抗氧化酶的活性變化［J］．淡水漁業(yè)，2013，43(6):35-38

［26］林浩然．魚類生理學［M］．廣州:廣東高等教育出版社，1999:190-196．

［27］Yeoh C G，Schreck C B，F(xiàn)itzpatrick M S，et al．In vivo steroid metabolism in embryonic and newly hatched steelhead trout(Oncorhynchus mykiss)［J］．Gen Comp Endocrino，1996，102(2):197-209．

［28］Feist G，Schreck C B．Brain-pituitary-gonadal axis during early development and sexual differentiation in the rainbow trout，Oncorhynchus mykiss［J］．Gen Comp Endocrinol，1996，102(3):394-409．

［29］Feist G，Schreck C B，F(xiàn)itzpatrick M S，et al．Sex steroid profiles of coho salmon(Oncorhynchus kisutch)during early development and sexual differentiation［J］．Gen Comp Endocrinol，1990，80(2):299-313．

［30］吳湘香，陳細華，劉鑒毅，等．中華鱘早期發(fā)育中17β-雌二醇和睪酮水平變化的初步觀察［J］．淡水漁業(yè)，2007，37(2):3-7．

［31］Hao R X，Mail M B，Singh A V，et al．Identification of estrogen target genes during zebrafish embryonic development through transcriptomic analysis［J］．PLoS One，2013，8(11):1-18．

［32］Nakamura M，Bhandari R K，Higa M．The role estrogens play in sex differentiation and sex changes of fish［J］．Fish Physiology and Biochemistry，2003，28(1):113-117．