王姣姣，李丹，王軼南，王俊杰，劉艷萍，常亞青

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

刺參Apostichopus japonicus是中國重要的海水養(yǎng)殖種類，養(yǎng)殖區(qū)域分布于遼寧、山東和河北等地沿海，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益［1］。動物腸道內(nèi)的菌群是腸道的重要組成部分，水生動物的腸道菌群與宿主以及所處的水生環(huán)境存在相互依賴和相互制約的關(guān)系，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收等方面具有重要作用［2］。刺參營底棲生活并以沉積物為食，細(xì)菌在刺參的食物中占據(jù)較大的比例［3］，刺參腸道內(nèi)細(xì)菌群落組成直接受到養(yǎng)殖環(huán)境中菌群變化的影響［4］。目前，有關(guān)刺參腸道內(nèi)細(xì)菌群落的研究報(bào)道已有不少，張文姬等［5］分析了刺參腸道內(nèi)可培養(yǎng)微生物的種類，楊志平等［6］利用點(diǎn)種法篩選和鑒定了刺參潛在產(chǎn)酶益生菌。但是由于在自然界中85%～99%的細(xì)菌不可分離培養(yǎng)，傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法難以全面反映刺參腸道內(nèi)細(xì)菌群落組成的情況［7］，丁君等［8］利用 PCR-DGGE 技術(shù)分析了刺參腸道內(nèi)的細(xì)菌種類。分子技術(shù)在刺參腸道菌群研究中的應(yīng)用，為深入了解刺參腸道內(nèi)的菌群組成提供了幫助，李彬等［4］運(yùn)用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，對刺參腸道內(nèi)的細(xì)菌菌群進(jìn)行了分析?，F(xiàn)已開展的研究主要集中在刺參腸道細(xì)菌種類的分析，而關(guān)于刺參腸道菌群季節(jié)性變化的研究卻鮮有報(bào)道。有關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物消化道菌群季節(jié)性變化的研究已引起重視［9-10］。本研究中，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對不同養(yǎng)殖時(shí)期刺參腸道內(nèi)的細(xì)菌群落進(jìn)行了分析，探討其演替規(guī)律，以期為深入了解刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)和刺參腸道微生態(tài)研究提供更為詳盡的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參采自遼寧省大連市瓦房店仙峪灣養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1．2．1 樣品采集 每次采集9頭健康的2齡刺參(約100 g)，采樣時(shí)間為2009年6月、2009年9月、2009年 10月、2010年 3月、2010年 4月、2010年5月，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，在無菌條件下解剖刺參，取腸道內(nèi)含物混合后于-20℃下保存［11］。按采樣時(shí)間將樣品編為WI6、WI9、WI10、WI3、WI4、WI5號。

1．2．2 DNA提取 將刺參腸道內(nèi)含物樣品與Tris-HCl buffer、超純水和Al2(SO4)3渦旋混勻后，用NaOH調(diào)pH至8，離心，棄上清，置于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩＠萌芫阜ǎ?2］進(jìn)行粗提，再利用苯酚抽提法［13］進(jìn)行提取，作為PCR反應(yīng)的模板，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 細(xì)菌16S rDNA-V3可變區(qū)域的 PCR擴(kuò)增采用特異性引物:F341(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG)和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG)，并在F341的5'端加入一段長為40 bp的富含 GC的 片 段(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG-GCACGGGGGG)［14-15］，對細(xì)菌16S rDNA基因V3可變區(qū)PCR后［12］，產(chǎn)物于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．4 變性梯度凝膠電泳及分析 采用 D-Code System(Bio-Rad)按下列條件進(jìn)行:8%的聚丙烯酰胺，變性劑濃度為30%～60%，電壓為75 V，溫度為60℃，電泳時(shí)間為12 h。用SYBR-Green I染色，經(jīng)UVP凝膠系統(tǒng)成像后，采用凝膠分析軟件Quantity One對DGGE圖譜各樣品條帶的遷移率、灰度和數(shù)量進(jìn)行數(shù)字化處理，然后進(jìn)行多樣性和相似性分析［16］。

1．2．5 DGGE條帶的測序分析 在紫外燈下對DGGE凝膠中主要條帶 (優(yōu)勢條帶、共有條帶等具有代表性的特殊條帶)切割、回收并擴(kuò)增。經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物連接到載體pMD19-T中，采用T載體通用引物M13進(jìn)行菌落PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為陽性克隆，將陽性克隆對應(yīng)的白色轉(zhuǎn)化子于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng) (37℃)，進(jìn)行質(zhì)粒提取。取上述質(zhì)粒5 μL經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否含有質(zhì)粒DNA?？寺∵^程中每個(gè)條帶選擇多個(gè)轉(zhuǎn)化子，確保每個(gè)條帶達(dá)到3～5個(gè)陽性克隆。將回收質(zhì)粒交由寶生物工程(大連)有限公司測序。測序獲得的序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性比較(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖時(shí)期刺參腸道內(nèi)菌群DGGE圖譜的構(gòu)建與分析

圖1 刺參腸道菌群16S rDNA-V3可變區(qū)PCR-DGGE圖譜Fig.1 PCR-DGGE profiles of the 16S rDNA V3 region of the bacterial flora in intestines of sea cucumber Apostichopus japonicus

不同養(yǎng)殖時(shí)期刺參腸道內(nèi)菌群的16S rDNAV3可變區(qū)片段的變性梯度凝膠電泳指紋圖譜見圖1-A，3月 (WI3)、4月 (WI4)、5月 (WI5)、6月 (WI6)、9月 (WI9)、10月 (WI10)的條帶數(shù)目分別為49、49、54、53、52、51。運(yùn)用Quantity One軟件，以5月份為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建模式圖譜 (圖1-B)，分析出3月、4月、5月、6月、9月和10月6個(gè)不同時(shí)期刺參腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的相似性結(jié)果(表1)。從表1可見，WI3和WI9的菌群結(jié)構(gòu)相似度最高，為 67．9%，WI4與 WI10次之，為63．8%，WI3與WI6的菌群結(jié)構(gòu)相似度最小，為21．6%。刺參腸道各樣品的多樣性指數(shù)均在2．0左右，均勻度為 0．20～0．24，差異不明顯 (表 2)。經(jīng)UPGMA聚類分析 (圖2)表明，WI3和WI9聚為一支，WI4和WI10聚為另一支。

表1 刺參腸道內(nèi)菌群的相似性矩陣圖Tab 1 Similarity matrix of DGGE patterns in bacterial flora in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus %

表2 刺參腸道內(nèi)菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度Tab 2 Shannon-Wiener index(H)，evenness(EH)and richness(S)of the bacterial flora in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus

圖2 PCR-DGGE圖譜聚類分析Fig.2 Cluster analysis of PCR-DGGE

2.2 刺參腸道內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)及變化

對不同位置刺參腸道內(nèi)含物圖譜條帶進(jìn)行切膠回收，由主要條帶示意圖 (圖1-C)可知，3月、4月、5月、6月、9月、10月樣品的可切膠回收條帶數(shù)分別為18、17、20、14、16、14條。序列通過NCBI中BLAST進(jìn)行同源性比對分析 (表3)，11個(gè)條帶與未培養(yǎng)菌同源性達(dá)到98%以上，其余32個(gè)條帶明確分類的菌種與7個(gè)細(xì)菌類群相似，其中 7條序列 (AgcW20、AgcW23、AgcW28、AgcW31、AgcW34、AgcW37、AgcW42)與 α-變形菌綱Alpha proteobacteria相似，18條序列 (Agc W02、 AgcW03、 AgcW04、 AgcW08、 AgcW09、AgcW10、AgcW12、AgcW13、AgcW14、AgcW16、AgcW19、AgcW21、AgcW30、AgcW32、AgcW33、AgcW35、AgcW36、AgcW41)與γ-變形菌綱Gamma proteobacteria相似，1條序列 (AgcW17)與δ-變形菌綱 Delta proteobacteria相似，3條序列(AgcW15、AgcW26、AgcW39)與黃桿菌綱 Flavobacteria相似，1條序列 (AgcW01)與藍(lán)藻綱Cyanobacteria相似，1條序列 (AgcW05)與綠彎菌門Chloroflexi相似，1條序列 (AgcW06)與疣微菌門Verrucomicrobia相似。各時(shí)期存在一些共有條帶，如 AgcW05、AgcW25、AgcW26、AgcW27、AgcW29、AgcW30、AgcW39、AgcW40、AgcW42、AgcW43。 其 中， AgcW25、 AgcW27、 AgcW29、AgcW40、AgcW43號條帶為未培養(yǎng)細(xì)菌。

對克隆得到的序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到不同月份刺參腸道內(nèi)細(xì)菌的群落組成 (圖3)。不同月份刺參腸道內(nèi)細(xì)菌群落均包含α-變形菌綱、γ-變形菌綱、黃桿菌綱，但相對含量各不相同。在3月份時(shí)，γ-變形菌綱 (27．78%)＞α-變形菌綱(22．22%)＞黃桿菌綱 (11．11%);在 4月份時(shí)，γ-變形菌綱 (29．41%)＞黃桿菌綱 (11．76%)=α-變形菌綱 (11．76%);在5月份時(shí)，γ-變形菌綱 (30．00%)＞α-變形菌綱 (10．00%)=黃桿菌綱 (10．00%);在 6月份時(shí)，γ-變形菌綱(35．71%)＞黃桿菌綱 (21．42%)＞α-變形菌綱(7．14%);在9月份時(shí)，γ-變形菌綱(25．00%)＞α-變形菌綱 (18．75%)＞黃桿菌綱 (12．50%);在10月份時(shí)，γ-變形菌綱 (35．71%)＞黃桿菌綱(14．28%)= α-變形菌綱 (14．28%)。不同月份刺參腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群均為γ-變形菌綱。

3 討論

刺參營底棲生活，攝食無選擇性［17］，多以沉積物為食，攝入大量的底泥、有機(jī)物質(zhì)和細(xì)菌，腸道的菌群結(jié)構(gòu)與底泥較為相近［18］，并且刺參的腸道中存在定植菌群輔助消化［19］。與此一致，不同

時(shí)期刺參腸道內(nèi)細(xì)菌16S rDNA-V3序列DGGE圖譜包含50個(gè)左右的可見條帶，表明刺參腸道內(nèi)均存在豐富菌群。高菲等［20］利用PCR-DGGE技術(shù)研究了刺參腸道內(nèi)的細(xì)菌群落組成，共得到13條序列，將其歸類于α-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、擬桿菌綱和柔膜菌綱等5大類群，γ-變形菌綱為其優(yōu)勢菌群。李彬等［4］所認(rèn)定的刺參腸道內(nèi)8株優(yōu)勢菌中，有7株菌屬于變形菌門的γ-變形菌綱。Huaide等［21］研究顯示，中國對蝦Fenneropenaeus chinensis腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌也屬于γ-變形菌綱。本研究中，在不同養(yǎng)殖時(shí)期共獲得43個(gè)主要的DGGE條帶序列，獲得的條帶數(shù)量較多，可較全面地反映刺參腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)。除未培養(yǎng)菌外，獲得的條帶序列可歸屬為α-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、黃桿菌綱、藍(lán)藻綱、綠彎菌門、疣微菌門7個(gè)細(xì)菌類群，其中優(yōu)勢菌群為γ-變形菌綱，與以上研究學(xué)者得出的結(jié)論相同。然而，本研究中獲得了與黃桿菌綱、藍(lán)藻綱、綠彎菌門、疣微菌門等菌種相似的條帶，與高菲等［20］的研究存在差異，這可能與樣品來源不同有關(guān)。

表3 刺參腸道內(nèi)細(xì)菌PCR-DGGE代表?xiàng)l帶的測序結(jié)果Tab 3 Sequencing results of PCR-DGGE bands in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus

圖3 不同養(yǎng)殖月份刺參腸道內(nèi)細(xì)菌群落組成Fig.3 Bacterial flora in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus in different culture months

受水溫影響，刺參的攝食和生理活動在周年養(yǎng)殖期內(nèi)存在2個(gè)升降周期［22］。冬季冰封期，水溫較低，刺參攝食量減少，處于半休眠狀態(tài);春季隨水溫回升，刺參攝食量增加進(jìn)入快速生長期;進(jìn)入6月下旬，海水溫度上升，刺參活動減弱，攝食量又下降，當(dāng)水溫超過21℃時(shí)刺參則進(jìn)入夏眠，夏眠期間，刺參的腸道衰竭、停止攝食、基礎(chǔ)代謝下降，黃、渤海區(qū)刺參的夏眠期大約可持續(xù)100 d左右［3］;秋季水溫下降后，刺參結(jié)束夏眠，生長出新的腸道并重新運(yùn)動和覓食，進(jìn)入第二個(gè)生長期。本研究中，采集養(yǎng)殖刺參的腸道內(nèi)容物時(shí)間段為3月—6月和9月—10月，基本涵蓋了刺參兩個(gè)攝食旺盛的時(shí)期。本研究中結(jié)果顯示，不同時(shí)期刺參腸道內(nèi)菌群中均存在α-變形菌綱、γ-變形菌綱和黃桿菌綱，但不同時(shí)期其相對含量不同，除3月和9月外，黃桿菌綱的相對含量均高于α-變形菌綱。3月至4月，α-變形菌綱所占比例急劇下降，由22．22%下降至 11．76%，之后兩個(gè)月均未超過10%。與此同時(shí)，γ-變形菌綱所占比例逐漸上升，由27．78%(3月)上升至35．71%(6月);黃桿菌綱所占比例前期較穩(wěn)定，6月明顯提高。表明3月至6月刺參腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)變化較大，且呈現(xiàn)出明顯的演替變化規(guī)律，即α-變形菌綱下降，而γ-變形菌綱與黃桿菌綱比例上升。9月至10月期間菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了與此相似的變化趨勢，其中γ-變形菌綱所占比例由25．00%升至35．71%?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝［9］、草魚［10］等消化道內(nèi)細(xì)菌的群落組成相對穩(wěn)定，細(xì)菌多樣性季節(jié)變化并不明顯。本研究中，得出的結(jié)果與之不同。推測刺參腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化可能與刺參的攝食和生理活動特點(diǎn)有關(guān)，在刺參由攝食停止或較弱狀態(tài)發(fā)展至攝食旺盛狀態(tài)的過程中，刺參腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)呈規(guī)律性演替，并且在兩個(gè)攝食旺盛生長快速的時(shí)期都表現(xiàn)出類似的過程。春秋兩季刺參腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)經(jīng)歷類似的變化，聚類分析顯示，3月和9月的菌群結(jié)構(gòu)相似，而4月和10月的菌群結(jié)構(gòu)相似，結(jié)果也與此一致。此外，刺參腸道細(xì)菌菌群平衡破壞易引發(fā)疾?。?3］，腸道菌群結(jié)構(gòu)的這種變化也可能是春秋季節(jié)疾病多發(fā)的原因之一。

刺參腸道內(nèi)存在一定量的潛在致病菌，其與腸道內(nèi)的其他細(xì)菌形成平衡的菌群系統(tǒng)，僅在特定條件下大量增殖并使刺參患病。李彬等［4］研究發(fā)現(xiàn)，正常刺參腸道中存在可引起刺參腐皮綜合征的燦爛弧菌，而刺參腸道內(nèi)還存在對致病燦爛弧菌具有拮抗作用的微生物［24］。本研究中，3月和6月在刺參腸道中亦發(fā)現(xiàn)燦爛弧菌，除3月外，不同時(shí)期腸道內(nèi)均存在Tenacibaculum sp．，且為優(yōu)勢條帶。根據(jù)張瑩等［25］的發(fā)現(xiàn)，腐皮綜合征刺參病灶處存在優(yōu)勢菌Tenacibaculum sp．，推測其可能亦為刺參腸道內(nèi)的潛在致病菌。

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