李趙嘉，郭冉，曹英昆，夏輝，申亮，魏旭光，王靜

(河北農業(yè)大學海洋學院，河北秦皇島066003)

2012年，中國淡水養(yǎng)殖甲殼類產量為234．3萬t，對蝦產量占69．5%，為162．87萬 t，其中，凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei的產量又占對蝦產量的38%以上［1］，成為中國重要的水產經濟動物之一。隨著養(yǎng)殖技術的發(fā)展，水產養(yǎng)殖模式也逐漸發(fā)生轉變，配合飼料投喂的比例越來越大，淀粉和含脂類物質 (如玉米、小麥、花生粕、豆粕和棉粕)又是水產配合飼料生產中所必需的營養(yǎng)物質，這些原料在生產、儲存、運輸過程中往往因操作不當，加之周圍相對較高濕度 (濕度65%以上)和不衛(wèi)生的環(huán)境，極易發(fā)生霉變，不僅造成飼料中維生素的降低和脂肪的酸敗，更為嚴重的是可以產生霉菌毒素，水產飼料中植物性組分越大，霉菌毒素含量就越高，對水產動物和食用者健康的危害就越大。黃曲霉毒素B1(AFB1)是霉菌毒素中最有毒的高致癌性化合物［2］，飼料中黃曲霉毒素嚴重危害水生和陸生動物的健康已引起了生產者和養(yǎng)殖者的廣泛關注。

甲殼動物體內存在一種類似于脊椎動物的補體級聯系統——酚氧化酶原激活系統 (proPO系統)，在免疫識別和防御中起著關鍵作用［3-4］。proPO系統中的因子以非活化狀態(tài)存在于血細胞中［5-6］，當受到外源刺激后釋放到血淋巴中［7-8］，在酚氧化酶原激活酶的刺激下變?yōu)橛谢钚缘姆友趸?(PO)，并以多種方式參與宿主細胞的防御反應。國內外已有學者對對蝦的酚氧化酶活力進行了研究，但是，關于AFB1入侵凡納濱對蝦體后，所引起的血淋巴中PO的特性卻鮮有研究。為此，本試驗在總結前人研究成果的基礎之上，探究了AFB1對凡納濱對蝦血淋巴中PO變化的影響。

王靜等［9］報道，隨著飼料中 AFB1濃度的升高，凡納濱對蝦肝胰腺中AFB1的殘留量逐漸增加，2000 μg/kg AFB1濃度組中的殘留量最高(95．49 μg/kg)，因此，AFB1可在水產生物體內(甚至可食用組織)富集［10］;Han 等［11］研究發(fā)現，異育銀鯽Carassius auratus gibelio飼料中AFB1濃度為9．55～28．60 μg/kg時，飼喂3個月后異育銀鯽肌肉中可檢測出2．00～4．08 μg/kg的AFB1;同時黃曲霉毒素M1(AFM1)作為AFB1在組織中的主要代謝產物，其毒性主要表現為致癌性和致突變性，破壞人及動物的肝臟并導致肝癌甚至死亡，不同動物組織以牛奶最容易出現AFM1的殘留量［12］，對消費者的健康構成了潛在的危害，因此，檢測養(yǎng)殖動物不同組織中AFB1、AFM1的殘留量很有必要。

Munoz等［13］研究顯示，測定肝胰腺中超氧化物歧化酶 (SOD)的活性可以反映出AFB1對動物機體抗氧化能力的影響，SOD的催化作用可消除超氧陰離子自由基，阻礙自由基對正常細胞的氧化傷害，因此，SOD的活力間接反應了機體清除氧自由基的能力。測定SOD的活性，在一定程度上反映出飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺的影響程度，以期探討AFB1對水生甲殼動物的毒性作用機制，可以為凡納濱對蝦的生態(tài)養(yǎng)殖及水產品安全提供參考。

本試驗以王靜等［9］的研究為基礎，選擇一組死亡率不高且濃度較高的AFB1(1600 μg/kg)飼料作為試驗飼料，進一步觀察了高濃度黃曲霉毒素在對蝦免疫代謝過程中對其代謝生化指標的影響，進而為生產實踐中預防并減緩黃曲霉毒素對對蝦的毒害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對蝦蝦苗購于河北滄州黃驊鑫海生物技術公司，體質量為 (0．30±0．02)g。選取長勢良好、體質健壯的凡納濱對蝦蝦苗放入實驗室水族箱內，投喂配合飼料，暫養(yǎng)10 d后進行試驗。

AFB1標準品購買于Sigma公司。

1.2 方法

1．2．1 試驗飼料的制備 為排除原料中其他霉菌毒素對試驗結果的影響，本試驗中采用純化飼料，即將純化的粉末狀黃曲霉毒素B1標準品與原料充分混合?；A飼料配方 (均為質量分數)為:酪蛋37．0%、明膠9．2%、維生素20．7%、玉米淀粉20%、魚油 3．5%、玉米油 3．5%、大豆磷脂0．5%、復合礦物鹽0．5%、復合維生素2．0%、氯化膽堿 (50%)0．5%、VC磷酸酯0．5%、甜菜堿0．1%、CMC 2．0%，基礎飼料營養(yǎng)成分見表1。將所有原料經過粉碎機 (山東精誠機械制造有限公司，WKF-60型)粉碎，再依次過80目網篩，按基礎飼料配方將原料按比例混合均勻，加入魚油后手工將形成的小顆粒搓散并置于攪拌機 (北京環(huán)亞天元機械有限公司，HYJ-30型)中攪拌，邊攪拌邊加入30%左右的蒸餾水，成團后于雙螺桿壓條機［華中理工大學監(jiān)制，F-26(Ⅱ)］中擠壓呈直徑1．5 mm的條狀飼料，在60℃烘箱中熟化4 h后晾干，裝入密封袋中于冰柜 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 飼養(yǎng)管理 將幼蝦在實驗室內40 cm×50 cm×60 cm的玻璃水箱中飼養(yǎng)8周，每箱放蝦100尾，試驗組投喂含有AFB1(1600 μg/kg)的飼料，對照組投喂不含黃曲霉毒素的基礎飼料，每組設3個平行，共計6箱。投喂量為蝦質量的6%～7%，每天7:00、12:00、17:00投喂，用虹吸法清除糞便后更換1/3海水，及時巡查各箱，揀出死蝦，并測定其體長和體質量。養(yǎng)殖用水為經過濾、消毒的天然海水，鹽度為30，連續(xù)充氣，用電加熱棒維持適宜水溫。每天記錄水溫，每兩周測定一次養(yǎng)殖海水中的溶氧、pH、總氨氮含量。試驗期間，水溫保持在 (28．06±0．09)℃，溶氧為 (7．26±0．6)mg/L，pH 為 7．3 ～ 7．7，總氨氮為 (1．4 ±0．3)mg/L。

表1 基礎飼料的營養(yǎng)成分Tab.1 Approximate composition of the basic diet w/%

1．2．3 樣品的采集 試驗結束時，禁食24 h后，從每箱隨機取5尾幼蝦，分別取血淋巴及肌肉、肝胰腺、腸道組織樣品。使用1 mL一次性無菌注射器自蝦頭胸甲后緣圍心腔內3 mm左右抽取血淋巴。抽取前，注射器中預先吸入0．2 mL改進后的預冷凡納濱對蝦血淋巴抗凝劑［4，14］(0．01 mol/L EDTA-Na2，0．34 mol/L NaCl，0．01 mol/L KCl，0．01mol/L HEPES， pH 7．45， 滲 透 壓 780 mOsm/kg)，最終按血淋巴與抗凝劑3∶2的比例置于離心管中，4℃下在1000 g冷凍離心機中離心，取其淡藍色上清待測。在研磨器中加入緩沖溶液置于冰水浴環(huán)境中，將肝胰腺組織研磨充分后置于離心管中，于冷凍離心機中離心得上清液。將所得樣品均保存于超低溫冰箱 (-80℃)中待測。

另外，從每箱再隨機取1尾幼蝦的完整肝胰腺(外有包膜)，放入事先準備好的體積分數為4%的中性甲醛固定液中固定，以備制作H．E［15］染色切片。

1．2．4 指標的測定 使用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定幼蝦組織中AFB1、AFM1的殘留量，試劑盒購于上海佑隆生物科技公司。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛 (MDA)含量，采用化學熒光法測定活性氧 (ROS)含量，以每毫克蛋白的熒光強度表示。上述指標的測定均使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒。

酚氧化酶 (PO)作為體液免疫的第一道防線，本研究中對PO活力的瞬時值進行了測定。飼喂AFB1后，3～5 h之內完成取樣，測定幼蝦血淋巴細胞在受到外源物刺激后PO酶釋放到血清中隨時間的瞬時變化，觀測細胞的免疫啟動和應答狀況。

PO活力的測定參考Ashida的方法，以LDOPA為底物，取 10 μL 血淋巴，加入 200 μL 0．1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液 (pH 6)，再加入10 μL 0．01 mol/L的L-DOPA，于室溫下混勻，每4 min讀取一次490 nm處的吸光度 (OD)，另取10 μL蒸餾水以代替血淋巴樣品，于490 nm波長下測得吸光度為OD1，以10 μL蒸餾水代替底物L-DOPA，在490 nm處測得吸光度為 OD2。每分鐘OD490nm值增加0．001為一個酶活力單位 (U)，PO活力的計算公式為

1.3 數據處理

試驗數據用平均值 ±標準誤 (mean±S．E．)表示，使用SPSS 17．0軟件進行單因子方差分析(One-way ANOVA)，若差異顯著，再采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0．05。

2 結果與分析

2.1 AFB1和AFM1在蝦體內的殘留量

從表2可見，凡納濱對蝦幼蝦攝食含高濃度AFB1飼料8周后，肝胰腺中AFB1殘留量為2．18 μg/kg，肌肉中未檢測到殘留量，腸道中有少量殘留量被檢測出，為0．11 μg/kg。由此可見，當幼蝦持續(xù)攝入高濃度AFB1時，肝胰腺中殘留量高于腸道殘留量，肌肉中未檢測出殘留量。肝胰腺中AFM1的殘留量 (0．32 μg/kg)高于腸道殘留量(0．05 μg/kg)，肌肉中同樣無AFM1殘留量檢出。

多重比較結果表明，肝胰腺中AFB1、AFM1的殘留量均顯著高于腸道殘留量 (P＜0．05)。

表2 AFB1、AFM1在凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺、肌肉、腸道中的殘留量Tab.2 Residues of AFB1and AFM1in hepatopancreas，muscle and gut of juvenile Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei μg/kg(樣品)

2.2 凡納濱對蝦免疫指標的變化

從表3可見:試驗結束時，試驗組幼蝦肝胰腺中的SOD活性顯著低于對照組 (P＜0．05)，MDA含量顯著高于對照組 (P＜0．05);試驗組幼蝦血淋巴中的SOD活性低于對照組，MDA含量則高于對照組，但均無顯著性差異 (P＞0．05);試驗組肝胰腺中ROS含量顯著高于對照組 (P＜0．05)。

2.3 凡納濱對蝦PO活力的變化

凡納濱對蝦幼蝦血淋巴中PO活力隨時間的變化見圖1。從圖1可見，隨著時間的延長PO活力不斷升高，在4～28 min時，試驗組PO活力的增PO活力顯著高于對照組 (P＜0．05)。

圖1 酚氧化酶活力隨時間的變化Fig.1 Changes in PO activity with the time

2.4 凡納濱對蝦肝小管結構的變化

試驗結束時，試驗組和對照組凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺的顯微結構如圖2所示。

攝食含高濃度AFB1飼料的幼蝦肝胰腺顏色呈灰白色，結構和形狀正常;隨著時間的推移，肝胰腺嚴重腫大，觸之即碎;第8周時靠近消化道處的肝胰腺細胞受損嚴重，肝胰腺細胞緊縮，出現大面積的空泡區(qū) (圖2-F)，逐漸向肝胰腺邊緣擴散，很難找到完整的柱狀細胞，食道周圍肝細胞消失，嚴重的僅殘留肝小管，甚至肝小管消失。

表3 AFB1對凡納濱對蝦幼蝦免疫指標和酚氧化酶活力的影響 (n=3)Tab.3 Effects of dietary aflatoxin B1on immune index and PO activity in juvenile Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

圖2 飼料中AFB1對凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺顯微結構的影響Fig.2 Microstructure of hepatopancreas in juvenile Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei fed the diet containing AFB1

3 討論

3.1 凡納濱對蝦組織中AFB1、AFM1的殘留量

El-Sayed 等［16］研究發(fā)現，用含 18 μg/kg AFB1的飼料飼喂海鱸Perca fluviatilis 6周后，海鱸肌肉中的殘留量可達 4．25 μg/kg。Huang 等［17］研究發(fā)現，攝食含低濃度的AFB1飼料后，銀鯽Carassius auratus gibelio肌肉中有少量AFB1殘留，而肝臟中AFB1殘留量則超過5 μg/kg。本試驗中，飼喂含高濃度的AFB1(1600 μg/kg)飼料8周后，幼蝦肝胰腺中殘留量為2．18 μg/kg，腸道中的殘留量為0．11 μg/kg，而肌肉中幾乎沒有 AFB1殘留，與對魚類的研究結果不同。許萬祥［18］用污染量為25～2500 μg/kg的AFB1日糧飼喂成年的斑節(jié)對蝦Penaeus monodon，對其肝胰腺和觸角腺切片觀察發(fā)現，有病理組織學改變，但并沒有在對蝦其他組織中檢測到毒素的存在。

當對蝦攝入AFB1后，在肝胰腺中代謝產生AFM1，但是關于AFM1在對蝦組織中殘留量的檢測卻鮮有報道。高領等［12］指出，荷斯坦乳牛Holstein dairy cow攝食含有AFB1的飼料7 d后，可在其乳汁中檢測出 AFM1，但是停喂4 d后乳汁中AFM1消失。本試驗中，也檢測了對蝦肝胰腺、腸道和肌肉中的AFM1殘留量，檢測出肝胰腺中AFM1的殘留量為0．32 μg/kg，腸道中為 0．05 μg/kg，而肌肉中幾乎沒有AFM1殘留，說明AFB1的代謝主要在肝胰腺中，排泄時有極小的一部分在腸道中吸收，肌肉中則不存在AFM1殘留。

3.2 AFB1對凡納濱對蝦代謝生化指標的影響

血液成分作為病理、生理和毒理學的重要指標，其變化往往可作為蝦類營養(yǎng)和健康狀況分析的依據，蝦體的病理或生理變化，在血液指標上必定會反映出來［19］。張健等［20］研究指出，PO 通過氧化酚生成醌，最終產生黑色素，是對蝦免疫過程中產生的重要高活性物質，其中間產物具有抑制異己物胞外蛋白酶和幾丁質酶活性的作用，能有效抑制甚至殺死異源物，能促進對蝦包裹、結節(jié)和修復等免疫活動，提高對蝦機體的免疫力。PO還可以作為調理素，具有促進血細胞的吞噬作用［21］。本試驗中，試驗組PO酶活性顯著高于對照組，增長趨勢也大于對照組。飼料中AFB1進入蝦體后屬于異源物質，必定會激活機體的非特異性免疫系統來阻止異源物質對機體的入侵。

AFB1的毒性與其代謝方式和途徑密切相關。當AFB1進入體內，往往是有氧代謝，不可避免地會產生有氧自由基 (ROS)［22］，攻擊周圍的生物分子，使酶蛋白失活、DNA斷裂等，若不能及時清除，最終可導致組織細胞凋亡、免疫功能下降，甚至死亡［23］。解毒代謝主要發(fā)生在肝細胞微粒體內，SOD作為機體內抗氧化、清除自由基最為主要的酶類，在終止自由基連鎖反應，使其維持在一個較低水平的平衡狀態(tài)方面有極其重要的作用。SOD活力的高低可以間接地評價機體細胞氧化受損程度和活力氧水平，在判斷機體健康狀況和免疫機能等方面有重要的參考價值［24］。水產動物組織中高度不飽和脂肪酸含量高于其他動物，受到氧自由基攻擊后更容易發(fā)生脂質過氧化反應，將活性氧轉化成活性化學物質 (如醇類、醛類、烴類)，使機體處于氧化脅迫狀態(tài)，并通過鏈式或鏈式支鏈反應而放大［25］。MDA為脂質過氧化作用的主要產物，如果超出正常范圍便會毒害細胞，使代謝功能出現障礙甚至使細胞凋亡，因此，MDA含量的高低，可以間接了解機體細胞脂質氧化程度以及組織細胞受氧化損傷的程度［26］。本研究中，試驗組肝胰腺中ROS和MDA含量顯著高于對照組 (P＜0．05)，而試驗組SOD活性顯著低于對照組 (P＜0．05)，肝胰腺中MDA含量與SOD活性呈負相關，說明當機體脂質過氧化水平升高時，肝胰腺細胞抗氧化與清除自由基的能力隨飼料中AFB1的出現而減弱;試驗組對蝦血淋巴中MDA含量較對照組高，而SOD活性則低于對照組，但均不存在顯著性差異 (P＞0．05)，表明AFB1使脂質過氧化程度增加，機體氧化損傷增大。雖然血淋巴中不存在顯著性差異，但從肝胰腺指標中可以判定出試驗蝦的肝胰腺受到嚴重損傷，肝胰腺中超氧自由基含量高，肝胰腺受損嚴重且自主修復能力顯著下降。Bintvihok等［27］僅進行了10 d試驗后就發(fā)現，AFB1的質量濃度低于20 μg/kg的飼料就足以損害對蝦肝胰腺的機能，改變血淋巴正常的生化指標。

3.3 AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺顯微結構的影響

Santacroce等［28］研究指出，AFB1能誘發(fā)肝臟機能紊亂，組織病變，表現為肝臟器官水腫，炎癥細胞增多，肝細胞空泡化嚴重。Radhika等［29］研究表明，這種改變主要表現為肝臟細胞和肝小管形成結節(jié)、細胞伸長、間質纖維化、壞死或血淋巴細胞浸潤。Ostrowski-Meissner等［30］研究發(fā)現，受AFB1污染，對蝦的肝胰腺邊緣肝小管細胞壞死及病灶細胞變性。本試驗中，通過切片觀察發(fā)現，當飼喂含有高濃度AFB1的飼料后，凡納濱對蝦肝胰腺細胞受損，近消化道嚴重，逐漸向肝胰腺邊緣擴散。損傷表現為:肝胰腺細胞緊縮，出現大面積空泡區(qū)，很難找到完整的柱狀細胞，食道周圍肝細胞消失，嚴重的僅殘留肝小管，甚至肝小管消失。Boonyaratpalin等［31］曾報道，飼喂斑節(jié)對蝦Penaeus monodon含100～2500 μg/kg AFB1的飼料后，先是肝胰腺中的肝細胞萎縮，隨后肝小管上皮細胞壞死，基本與本試驗結果吻合。

綜上所述，黃曲霉毒素在蝦飼料中的毒性及其對對蝦的危害主要是通過降低細胞抗氧化能力和細胞修復能力，導致肝胰腺細胞不可逆損傷和組織病變。長時間飼喂含AFB1的飼料可增加其在蝦體內的富集，對水產品安全以及消費者的身體健康是一個極大的隱患，因此，明確AFB1在對蝦養(yǎng)殖業(yè)中產生的危害，防控霉菌毒素將成為能否解決飼料和水產品安全的重要問題，對整個對蝦產業(yè)具有重要的意義。

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