徐志進，章霞，柳敏海，傅榮兵，李偉業(yè)，油九菊

(舟山市水產(chǎn)研究所，浙江舟山316000)

多鱗四指馬鲅Eleutheronema rhadinum和四指馬鲅E．tetradactylum是廣泛分布于印度洋和太平洋西部的經(jīng)濟魚類品種，兩者同屬于鯔形目Mugiliformes、馬鲅科Polynemidae、四指馬鲅屬Eleutheronema［1］，中國沿海均產(chǎn)之，以南方為多［2-4］，俗稱章跳、馬友、午魚、牛筍、祭魚、鯉后。四指馬鲅生長快、肉質(zhì)鮮、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者喜愛。近年來，隨著四指馬鲅人工育苗技術(shù)的推廣［5］，四指馬鲅的人工養(yǎng)殖已逐步形成規(guī)模。

目前，國內(nèi)對四指馬鲅屬魚類的認識存在概念混亂的現(xiàn)象，常將多鱗四指馬鲅誤鑒為同屬的四指馬鲅。關(guān)于這兩種魚類的鑒定以及遺傳多樣性差異方面的研究報道不多，僅見 Motomura［6］在對其形態(tài)學研究時指出，兩種魚類在有無犁骨齒板、胸鰭顏色、側(cè)線鱗數(shù)目等有明顯的區(qū)別，可作為其分類依據(jù)，而在其他相關(guān)的研究中只見對單一物種的遺傳差異或者系統(tǒng)發(fā)育的研究。林少珍等［7］基于COI序列分析了東海四指馬鲅的種群遺傳結(jié)構(gòu)，楊陽等［8］研究了多鱗四指馬鲅4個地理群體的形態(tài)差異，常有民等［9］觀察了多鱗四指馬鲅耳石形態(tài)特征，但關(guān)于兩者之間的遺傳差異和種群結(jié)構(gòu)的研究目前仍屬空白，亟待科學研究后填補。

細胞色素b基因 (Cytb)和16S rRNA基因作為常用的線粒DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)分子標記，適用于種群以及種間遺傳多樣性的分析［10-14］，能夠有效應(yīng)用于魚類分類和系統(tǒng)進化研究，幫助監(jiān)管漁業(yè)資源和維護海洋生物的生物多樣性。本研究中，克隆并分析了來自江蘇海域多鱗四指馬鲅和臺灣四指馬鲅兩個群體的Cytb和16S rRNA基因片段，并探討了兩者的種群遺傳結(jié)構(gòu)及種間是否存在較大的遺傳差異，以期為中國四指馬鲅的遺傳多樣性研究提供參考數(shù)據(jù)，同時還探討了能否在分子水平上鑒別四指馬鲅和多鱗四指馬鲅，旨在合理保護和開發(fā)中國的魚類資源，以及為四指馬鲅屬魚類的鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

多鱗四指馬鲅取自江蘇 (JS)，四指馬鲅取自臺灣 (TW)，各取30尾樣品的尾鰭固定于體積分數(shù)為95%的酒精中。

1.2 方法

1．2．1 魚類總DNA的提取 取兩種樣品魚鰭條30 mg左右，用酚氯仿法提取魚類總DNA［15］，于超低溫冰箱 (-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 PCR擴增及序列測定 16S rRNA和Cytb基因片段的擴增引物由上海生工公司合成，引物序列［16］為

反應(yīng)體系 (共 50 μL):10 × Buffer 5．0 μL，200 mmol/μL dNTPs 1 μL，10 μmol/L雙向引物各2 μL，50 U/μL Taq 酶 0．1 μL，100 ng/μL DNA 模板約2 μL，用滅菌超純水補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，55℃下退火1 min，72℃下延伸40 s，共進行40個循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存。PCR擴增產(chǎn)物采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，由生工生物工程 (上海)股份有限公司完成PCR產(chǎn)物的測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測得的序列先在NCBI網(wǎng)站上進行比對，確定為目的序列，再采用 ClustalX 1．81軟件進行比對［17］。用 MEGA 5．0 軟件［18］分析與計算序列特征、變異位點、遺傳差異和遺傳距離等，并采用NJ法 (Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過DNASP 4．0軟件進行單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均堿基差異的計算［19］。選擇 Arlequin 3．01中的AMOVA進行分析，用Tajima'SD和Fu'S Fs中性檢驗評估其種群結(jié)構(gòu)與種群動態(tài)［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個四指馬鲅群體的Cytb和16S rRNA序列分析

通過克隆并測序獲得多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的各60條Cytb同源核苷酸序列 (長度約為394 bp)和16S rRNA同源序列 (長度約為561 bp)。在兩種序列的堿基組成中，A+T含量分別為51．6% ～55．8%(Cytb)和 51．6% ～52．4%(16S rRNA)，均高于G+C含量 (表1)，并且兩個四指馬鲅群體16S rRNA和Cytb序列的堿基組成相似，無明顯差異。

60條16S rRNA堿基序列中存在2個單倍型，其中不包含簡約信息位點和單一位點，江蘇多鱗四指馬鲅 (JS群體)與臺灣四指馬鲅 (TW群體)的16S rRNA序列相比較有5個堿基缺失，兩個群體各自共享有1個16S rRNA單倍型 (圖1)。60條Cytb核苷酸序列中存在4種單倍型，其中包含1個簡約信息位點和2個單一位點，在JS群體中存在3個單倍型，TW群體存在1個單倍型 (圖2)，基于Cytb和16S rRNA序列的兩個四指馬鲅群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析如表2所示。

表1 兩個四指馬鲅群體Cytb和16S rRNA核苷酸序列的堿基組成Tab.1 Base pair composition of Cytb and 16S rRNA sequences in two Eleutheronema species

2.2 兩個四指馬鲅群體的種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性

根據(jù)16S rRNA核苷酸序列，分析得到兩個四指馬鲅群體的遺傳距離為0．114。而基于Cytb核苷酸序列各單倍型的遺傳距離如表3所示，江蘇多鱗四指馬鲅群內(nèi)遺傳距離為0．003～0．008，平均遺傳距離為 0．005。

采用鄰接法構(gòu)建兩個四指馬鲅群體Cytb核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹如圖3所示。結(jié)果表明，兩個群體的單倍型各自聚為一支，針對江蘇多鱗四指馬鲅Cytb單倍型的 Tajima'SD檢驗結(jié)果為-0．529 39，P ＞ 0．1，F(xiàn)u'S Fs中性檢驗結(jié)果為-1．030 1，P＞0．1，差異均不顯著，表明江蘇多鱗四指馬鲅群體未經(jīng)歷過種群的擴張。

圖1 江蘇多鱗四指馬鲅 (JS)和臺灣四指馬鲅 (TW)的16S rRNA核苷酸序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of partial 16S rRNA sequence between Jiangsu E.rhadinum and Taiwan E.tetradactylum

圖2 江蘇多鱗四指馬鲅 (JS)和臺灣四指馬鲅 (TW)的Cytb核苷酸序列比對Fig.2 Pairwise alignment of partial Cytb nucleotide sequence between Jiangsu E.rhadinum and Taiwan E.tetradactylum

表2 基于Cytb和16S rRNA(括號中)序列的兩個四指馬鲅群體遺傳多樣性數(shù)據(jù)分析Tab.2 Data analysis of genetic diversity between two Eleutheronema species based on Cytb and 16S rRNA sequences in parentheses

表3 基于Cytb核苷酸序列的兩個四指馬鲅群體遺傳距離Tab.3 Genetic distances of Cytb nucleotide sequences between two Eleutheronema species

圖3 基于Cytb核苷酸序列的兩個四指馬鲅群體的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of two Eleutheronema species based on Cytb nucleotide sequence

3 討論

3.1 江蘇多磷四指馬鲅和臺灣四指馬鲅Cytb與16S rRNA的序列特征

兩個四指馬鲅群體的Cytb與16S rRNA序列中G+C含量均低于A+T含量，Cytb核苷酸序列的G含量低于其他3種堿基，平均為16．16%。說明這個基因密碼子的堿基使用存在偏向性，這與白鮭Coregonusclupeaformis［21］、 赤 眼 鱒 Spualiobarbus Curriculus［22］、石斑魚 Epinephelussp［23］、灰鯧 Pampus nozawae［23］、羅非魚 Oreochromis［24］、鱈 Macrobrachium［25］和其他脊椎動物的結(jié)構(gòu)相似。同時，通過比較發(fā)現(xiàn)，這兩個四指馬鲅群體的Cytb序列所體現(xiàn)的遺傳差異均大于16S rRNA序列，表明在這2種四指馬鲅屬中Cytb序列較16S rRNA序列的堿基變異大、進化快，更適用于種及以上等級之間的遺傳學研究［26］，這也符合其他魚類種群遺傳多樣性和種間分析的研究結(jié)果［27-30］。

3.2 江蘇多鱗四指馬鲅和臺灣四指馬鲅的遺傳多樣性分析

核苷酸多樣性反映了位點在群體中的多樣性狀況，是反映種群遺傳多樣性的重要指標?；贑ytb序列的核苷酸多樣性，多鱗四指馬鲅為0．001 98，四指馬鲅為0;基于16S rRNA序列的核苷酸多樣性兩者均為0，均遠低于其他魚類。基于2個基因片段的單倍型多樣性研究表明，只有多鱗四指馬鲅 Cytb的單倍型多樣性為 0．582(H＞0．5)，而核苷酸多樣性水平較低，表明其種群數(shù)量可能曾經(jīng)下降［31］。Fu'S Fs中性檢驗、歧點分布分析能有效體現(xiàn)種群動態(tài)發(fā)展形式［23］。江蘇多鱗四指馬鲅魚類的中性檢驗結(jié)果為負值 (-1．030 1)，無顯著性差異(P＞0．1)，表明這種魚類未經(jīng)歷種群的擴張。

3.3 江蘇多鱗四指馬鲅和臺灣四指馬鲅的分子學鑒定

不同種魚類的區(qū)分通?？可镄螒B(tài)學和遺傳學分析方法進行鑒別，其中形態(tài)學就是根據(jù)肉眼可見的魚類外部形態(tài)特征來進行鑒定，適用于區(qū)分完整個體的種類［25］，這就要求水產(chǎn)相關(guān)人員具有較好的分類學基礎(chǔ)。但針對多鱗四指馬鲅和四指馬鲅形態(tài)相似度極高的情況，大多數(shù)從業(yè)人員易于混淆或者忽略，這就需要運用遺傳學分析來作為區(qū)別這兩類魚的重要手段。本試驗結(jié)果表明，可通過Cytb、16S rRNA核苷酸序列分析鑒別這兩種四指馬鲅屬魚類，這為兩種魚類的增殖、產(chǎn)品加工等生產(chǎn)應(yīng)用，以及魚種種群的遺傳多樣性保護提供了重要依據(jù)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，四指馬鲅屬的這兩種魚類群體遺傳多樣性水平偏低，這符合Horne等［32］、林少珍等［7］的研究結(jié)論。Horne等［32］指出，澳大利亞北部四指馬鲅魚類的種群遺傳結(jié)構(gòu)存在區(qū)域性，四指馬鲅之間的基因交流主要靠自我補充和偶然變異，這可能與四指馬鲅幼魚的游泳能力弱和方向感不強有關(guān);而林少珍等［7］推測，東海四指馬鲅魚類的遺傳多樣性偏低可能是由水環(huán)境惡化以及過度捕撈、補充群體不足等原因造成的。鑒于目前的研究內(nèi)容和研究方法比較薄弱，有必要進行多海域的四指馬鲅取樣研究，并豐富研究手段，以期獲得更加全面、謹慎、科學的研究結(jié)果。同時，也有必要及時采取適當?shù)墓芾聿呗?，減少海域捕撈的次數(shù)，控制漁獲量，恢復(fù)四指馬鲅魚類的野生資源，保護魚類資源的生態(tài)平衡。

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