高寧，蔡巖，周永燦，李根浪，袁衛(wèi)，劉海天，謝珍玉，王世鋒

(海南大學熱帶生物資源可持續(xù)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南 ?？?70228)

豹紋鰓棘鱸Plectropomus leopardus俗稱東星斑，隸屬于鱸形目、鮨科、石斑魚亞科、鰓棘鱸屬，為暖水性島礁魚類，主要分布于西太平洋至印度洋海區(qū)，日本、澳洲、斐濟等地也有少量分布。豹紋鰓棘鱸因體色艷麗、肉質(zhì)鮮美、市場價值高，導致野生資源遭到過度捕撈，已被國際自然保護聯(lián)盟(International Union for the Conservation of Nature，IUCN)列為瀕危物種［1］。近年來，國內(nèi)外學者對豹紋鰓棘鱸的生態(tài)學、分類學、胚胎發(fā)育、人工育苗及養(yǎng)殖技術(shù)等研究較多［2-5］。僅見 Pinthong等［6］對臺灣海域采集的豹紋鰓棘鱸進行了核型及銀染分析，但與從海南采集的樣品在銀染研究結(jié)果上存在差異。本研究中，對海南野生豹紋鰓棘鱸的染色體核型特征進行研究，旨在為石斑魚類染色體進化分析等提供資料，同時也為其種群種質(zhì)資源的開發(fā)與利用、遺傳育種與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的探討奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚為捕獲于海南東岸海域的野生魚(圖1，全長為14．5 cm)，共5尾，體質(zhì)量為30～50 g，活體運至實驗室充氣暫養(yǎng)。

1.2 方法

1．2．1 染色體標本的制備 按照吉華松等［7］的方法并稍作修改。從樣品魚尾柄處以10 μL/g(魚體質(zhì)量)抽血，在胸鰭基部以10 μg/g(魚體質(zhì)量)注射植物血球凝集素 (PHA);3．5 h后于胸鰭基部以1 μg/g(魚體質(zhì)量)注射秋水仙素;30 min后在水中剪鰓放血，然后在解剖盤中取其頭腎，于0．85%生理鹽水中制備細胞懸液，靜置片刻后吸取上層細胞懸液放入5 mL離心管中，以1000 r/min離心5 min，棄上清后輕輕彈散沉淀，緩慢加入低滲液，于37℃下水浴25～35 min;離心后緩慢加入適量新配制的卡諾氏固定液，室溫固定20 min，之后重復(fù)固定2次;加入適量新配制的卡諾氏固定液，置于冰箱 (-20℃)中過夜;第二天用吸管小心將上清吸出后，打散沉淀，加適量新配制的固定液制成細胞懸液，用吸管吸取細胞懸液滴于干凈的載玻片上，過酒精燈3次后自然晾干。用Giemsa染液染色15～20 min后，將玻片沖洗干凈并自然晾干，在顯微鏡下觀察并拍照。

1．2．2 核型分析 在顯微鏡下選取分散良好的中期分裂相進行染色體觀察和計數(shù)，確定豹紋鰓棘鱸二倍體染色體數(shù)目。選取染色體細長、分散良好和形態(tài)清晰的中期分裂相進行拍照和測量，根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果確定染色體的相對長度和臂比，根據(jù)Levan等［8］的標準確定染色體類型。

圖1 豹紋鰓棘鱸Fig.1 Leopard coraltrout Plectropomus leopardus

1．2．3 Ag-NORs顯帶 參照 Howell等［9］的方法并略加修改。在培養(yǎng)皿底部放置一層濾紙，然后用蒸餾水潤濕，在濾紙上平行放置2根牙簽，置60℃水浴鍋中待用;玻片標本細胞面朝上，將50%AgNO3溶液與2% 明膠溶液 (內(nèi)含1%甲酸)以2∶1的比例滴加到染色體標本上，混勻后蓋上蓋玻片，然后平放在培養(yǎng)皿中的牙簽上。染色體標本在水浴鍋中溫浴至標本呈棕黃色時取出，用自來水沖去蓋玻片，干燥后在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 豹紋鰓棘鱸體細胞染色體數(shù)目

本試驗對182個染色體分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相進行觀察和計數(shù)，二倍體染色體數(shù)目為48的中期分裂相最多，有138個，占75．82%(表1)，由此可確定豹紋鰓棘鱸二倍體染色體眾數(shù)為48，即 2n=48。

表1 豹紋鰓棘鱸染色體中期分裂相的統(tǒng)計結(jié)果Tab.1 Diploid chromosome number of leopard coraltrout Plectropomus leopardus during metaphase

2.2 染色體核型

選擇6個分散良好、形態(tài)清晰和數(shù)目完整的中期分裂相進行拍照，經(jīng)測量和統(tǒng)計分析確定染色體組中各條染色體相對長度和臂比，進而判定染色體類型，結(jié)果如圖2和表2所示。由圖2和表2可見，在豹紋鰓棘鱸染色體標本中，可觀察到兩種核型:A型染色體較短，由24對端部著絲點染色體(t)構(gòu)成 (圖2-A、B);B型染色體較為細長，由1對亞端部著絲粒染色體和23對端部著絲粒染色體構(gòu)成 (圖2-C、D)，這可能是不同中期分裂相受秋水仙素作用時間不同所致，因此，豹紋鰓棘鱸的核型公式為2n=2st(t)+46t，NF=48。豹紋鰓棘鱸染色體組中，第1對染色體相對長度明顯長于其他23對染色體，第24對明顯短于其他染色體，而其他22對染色體相對長度呈逐漸遞減的趨勢，相鄰染色體之間無明顯的大小差別。

2.3 Ag-NORs帶型

對豹紋鰓棘鱸61個二倍體染色體數(shù)目為48、銀染位點清晰的中期分裂相進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，在第1對染色體上具有1對NORs，位于染色體長臂靠近著絲粒的位置 (圖3)。對112個間期細胞核中的核仁組織區(qū)數(shù)量進行統(tǒng)計，具有1個核仁組織區(qū)的間期細胞核有78個，占總數(shù)的70%;具有2個核仁組織區(qū)的有34個，占總數(shù)的30%。

圖2 豹紋鰓棘鱸染色體中期分裂相 (A、C)和核型(B、D)Fig.2 Chromosome metaphase(A，C)and karyotypes(B，D)in leopard coraltrout Plectropomus leopardus

圖3 豹紋鰓棘鱸間期細胞核 (A)和中期分裂相的Ag-NORs(B)Fig.3 Nuclei at interphase and Ag-NORs in metaphase chromosomes in leopard coraltrout Plectropomus leopardus

3 討論

海南豹紋鰓棘鱸二倍體染色體數(shù)目為48，核型公式為2n=2st(t)+46t，NF=48，與 Pinthong等［6］對臺灣采集樣品的研究結(jié)果基本一致。鰓棘鱸屬作為石斑魚亞科中較為原始的類群［10］，其染色體組組成與石斑魚屬原始核型特征一致［11］，可見在進化過程中，石斑魚類染色體核型具有較高的保守性。這種核型的保守性，不僅僅存在于科這一分類階元，2n=48t也被認為是鱸形目基本的原始核型特征［12］。

表2 豹紋鰓棘鱸染色體相對長度和臂比Tab.2 Relative length and arm ratio of chromosomes in leopard coraltrout Plectropomus leopardus

海南豹紋鰓棘鱸染色體組中，除第1對和第24對染色體與其他染色體在長度上稍有差異外，其他22對染色體相對長度呈逐漸遞減的趨勢，相鄰染色體形態(tài)、大小差異不明顯，容易造成同源染色體的錯配。染色體顯帶技術(shù)可顯著提高核型分析的準確率［13］。本研究中對海南豹紋鰓棘鱸的Ag-NORs研究發(fā)現(xiàn)，NORs位于第1對染色體長臂靠近著絲粒的位置，而Pinthong等［6］研究結(jié)果顯示，臺灣地區(qū)豹紋鰓棘鱸的NORs位于第20對染色體靠近著絲粒的位置，這可能是豹紋鰓棘鱸不同地理群體間NORs分布位置具有多態(tài)性［14］。

不同作者對同一魚類進行核型分析，可能會由于采用的染色體制備方法不同、利用體細胞或胚胎細胞等材料不同、采集樣品的地理區(qū)域不同等原因造成試驗結(jié)果存在差異［15］。卓孝磊等［13］對中國研究過核型的海水魚類進行了總結(jié)，在77種海水魚類中，有8種海水魚類的核型公式在不同的研究報道中存在差異，包括星康吉鰻、大黃魚、斜帶髭鯛、紋縞鰕虎魚、許氏平鮋、斑頭魚、歐氏六線魚、紅鰭東方鲀等。在石斑魚亞科中，鮭點石斑魚［16-17］、云紋石斑魚［18-19］、赤點石斑魚［20-21］、三斑石斑魚等［15，22］也存在上述情況。對上述報道進行比較分析，發(fā)現(xiàn)同一物種在不同報道中所顯示的核型公式上的差異，多為染色體組中不同染色體類型在數(shù)量上的差異。如赤點石斑魚，在王云新等［20］的研究報道中染色體組由10條亞端部著絲粒染色體 (st)和38條端部著絲粒染色體構(gòu)成，而在王世鋒［21］的研究中則由2條亞中部著絲粒染色體 (sm)、8條亞端部著絲粒體 (st)和38條端部著絲粒染色體構(gòu)成。本研究中發(fā)現(xiàn)，豹紋鰓棘鱸同一染色體標本的不同中期分裂相之間也存在上述現(xiàn)象，在染色體相對細長的中期分裂相中，第1對染色體具有短臂，為亞端部著絲染色體 (st)，而在凝縮較為嚴重的中期分裂相中，第1對染色體為端部著絲粒染色體 (t)。這可能是由于豹紋鰓棘鱸的頭腎細胞分裂不同步，秋水仙素對不同中期分裂相中的染色體作用時間不同，從而導致染色體凝縮程度不同，造成染色體形態(tài)上的差異［23］。因此，在不同報道中同一種海水魚類在核型上的差異，是否同樣是由于秋水仙素作用時間不同，以及測量時所選取的中期分裂相染色體凝縮程度不同造成的，還有待進一步研究。

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