胡盼，宮雪，韓雨哲，姜志強，潘金露

(大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

太平洋鱈Gadus macrocephalus又名大頭鱈，隸屬于鱈形目 Gadiformes、鱈科 Gadidae、鱈屬 Gadus，系冷水性底層魚類，主要分布于北太平洋以及中國的黃海和東海北部［1］。太平洋鱈是具有重要開發(fā)前景的優(yōu)質魚種，研究其仔魚發(fā)育過程中消化系統(tǒng)結構和功能的變化，對于了解仔魚期的營養(yǎng)水平和營養(yǎng)需求非常重要。目前，國內外已對金頭鯛Sparus aurata、北美牙鲆Paralichthys californicus、細點牙鯛Dentex dentex、黃尾螄Seriola lalandi、波紋短須石首魚Umbrina cirrasa、盤麗魚Symphysodon discus、星斑川鰈Platichthys stellatus、大菱鲆Scophthalmus maximus［2-9］等魚類的仔魚、稚魚和幼魚消化系統(tǒng)進行了研究，但關于太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)組織學研究尚未見報道。本研究中，對太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)的發(fā)育進行形態(tài)學和組織學研究，以期為太平洋鱈苗種的科學管理和營養(yǎng)飼料的合理選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用太平洋鱈仔魚取自大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室。

1.2 方法

1．2．1 樣品的采集 成熟太平洋鱈親魚捕自大連市黑石礁海區(qū)，通過腹部擠壓獲得成熟卵和精子，干法人工授精獲得受精卵，經人工孵化獲得仔魚。仔魚培育期間，培育池水溫為7．8～10．0℃，微充氣，每日吸底換水一次，每次換水量為培育池容積的1/3。自6日齡開始投喂褶皺臂尾輪蟲，密度為5～10 ind．/mL;17日齡開始投喂鹵蟲，密度為0．5～2 ind．/mL。褶皺臂尾輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體投喂前均用加有強化劑AlgaMac-3080的小球藻液培養(yǎng)12 h，強化劑濃度為0．2 g/L。培育期間，每日投喂前取樣，以減少食物對樣本的影響。1～10日齡 (孵化當天為0日齡，第2天為1日齡，以此類推)每天連續(xù)取樣，11～50日齡隔天取樣。

1．2．2 樣品的處理 樣品用波恩氏 (Bouin)液固定24 h，用體積分數為70%的乙醇洗滌直到溶液不呈黃色為止，然后經瓊脂包埋和常規(guī)石蠟包埋，再進行橫向、縱向和水平的連續(xù)切片 (厚度為4～6 μm)，H．E染色，用中性樹膠封片，在 Nikon Eslipse 50i顯微鏡下觀察，并用Nikon Coolpix 5400數碼相機照相。

2 結果與分析

2.1 太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)發(fā)育形態(tài)學觀察

1日齡仔魚，魚體前部靠近腹部有一橢球形卵黃囊，在卵黃囊斜上方可見一圓團狀肝臟原基。魚體體表覆有少量點狀色素。脊索位于魚體中央，粗且直，肌節(jié)呈“V”型。鰭膜覆蓋于魚體背部、腹部和尾部，并出現胸鰭原基。消化道為一未分化的直形盲管，緊貼于脊索的下方和卵黃囊的背面，僅見后端膨大，口腔未開啟。消化道末端可見一橢圓形膀胱 (圖1-A)。

2日齡仔魚，卵黃囊逐漸縮小，魚體體表色素變深，斑狀面積變大。消化道整體略變粗，其后部與腹壁相交處有大量黑色素沉淀，且后端縊縮，將消化道分為兩段，前段為長條形，后段為橢球形?？诤透亻T未見分化 (圖1-B)。

3日齡仔魚，頭骨有所分化，呈隆起狀。口裂形成，下頜能夠緩慢活動，但不能攝食。消化道整體變粗，內壁增厚，但肛門仍未通。肝臟體積變大，進一步分葉，結構復雜化。消化道前部1/4處出現縊縮，末端翹起與魚體約呈45°角 (圖1-C)。

6日齡仔魚，卵黃囊顯著縮小，口裂繼續(xù)增大，下頜骨長度長于上頜骨，可張合。消化道內壁繼續(xù)增厚，褶皺增多，前腸部分明顯膨大，肛門開口于體外，消化道中后部出現少量橘紅色內含物，推測仔魚開始攝食外源性食物 (圖1-D)。

12日齡仔魚，卵黃囊?guī)捉В瑺I外源性營養(yǎng)，主動攝食能力增強。仔魚鰾圓球狀，但未充氣。消化道黑色素加深，面積增大，腸后部出現一個彎折，消化器官分化明顯，大量攝食(圖1-E)。

16日齡仔魚，身體各組織器官迅速發(fā)育，腸前部出現第二個彎折，胃腸蠕動能力增強，個別個體開始攝食鹵蟲無節(jié)幼體。消化道上方和頭部上方覆蓋有較深的色素細胞群，身體開始聚集黃色色素，尤以頭部黃色色素聚集較多，魚體開始變得不透明。背、腹鰭膜逐漸變窄，胸鰭明顯分化，呈扇形。鰾內開始充氣，體積逐漸增大?？梢婗w耙，但無鰓絲 (圖1-F)。

30日齡仔魚，肝臟體積增加，消化道明顯可見彎折，且消化道幾乎不透明，被食物填充。鰾被拉長，體積繼續(xù)增大。鰓耙和鰓蓋骨明顯和魚體分開，鰓絲粗且明顯 (圖1-G)。

47日齡仔魚，腸道呈螺旋狀，內臟器官基本發(fā)育完全，與成魚近似 (圖1-H)。

2.2 太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)組織學觀察

2日齡仔魚，消化器官處于尚未分化的狀態(tài)。食道細短，與其他部分分界不明顯。腸道位于魚體腹部卵黃囊上方，為一簡單的直形盲管，細胞為單層柱狀細胞，排列緊密，管腔狹窄。胃未分化，與腸和食道沒有明顯的分界?？谘是簧形创蜷_，肛門尚未與外界相通。肝臟和胰臟位于卵黃囊與消化道之間，為分化不明顯的致密細胞團 (圖2-A)。

4日齡仔魚，卵黃囊逐漸消耗變小，口裂增大，口咽腔與外界相通，但不具備攝食功能。食管腔已經擴大，管壁增厚，表面較光滑，腸壁黏膜上皮細胞為緊密排列的單層矮柱狀細胞，黏膜層較發(fā)達，后端與胃的分界明顯。腸道分為前后兩段，前段為長條形，后段為球形，但肛門仍未通。肝臟和胰臟分化明顯，肝細胞為多邊形或圓形，細胞質均勻，核大而居中，核仁清晰。胰細胞團染色較深(圖2-B～D)。

9日齡仔魚，食道管壁黏膜上皮由復層扁平細胞構成，肌肉層較薄。腸道缺乏固有膜和黏膜下層，黏膜層中可見少量黏液細胞間插其中。肝細胞索出現，界限分明，單層肝細胞索相互連接成網狀。胰腺已多處分布，開口于前腸 (圖2-E～H)。

16日齡仔魚，食道出現明顯褶皺，食道前部杯狀細胞增多。腸道褶皺明顯，腸壁腸絨毛增多，黏膜上皮中的杯狀細胞也增多。肝細胞為均勻的胞質，因儲存營養(yǎng)物質的增加，肝細胞出現明顯的空泡，將肝細胞的細胞質和細胞核擠到了細胞的周圍，靠近細胞壁。胰腺體積更大，結構更加完善(圖2-I～L)。

23～30日齡仔魚，食道上皮褶皺及杯狀細胞進一步增加，并散布于食道前中部。中腸及后腸部分黏膜褶皺數量明顯增加，腸黏膜上皮中杯狀細胞也明顯增多，黏膜下層的結締組織進一步發(fā)育。肝臟體積進一步增大，竇狀隙逐漸增多，空泡化程度加深，肝臟結構基本與成魚相似 (圖2-M～T)。

3 討論

圖1 太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)發(fā)育形態(tài)學Fig.1 Morphological development of digestive system in larvae of Pacific cod Gadus macrocephalus

圖2 太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)組織學Fig.2 Histological development of digestive system in larvae of Pacific cod Gadus macrocephalus

太平洋鱈消化系統(tǒng)的發(fā)育與北美牙鲆［3］、半滑舌 鰨 Cynoglossus semilaevis Gunther［10］、星 斑 川鰈［8］等魚類消化系統(tǒng)的發(fā)育相似，主要分為3個時期:卵黃期、混合營養(yǎng)期和外源性營養(yǎng)期。關于魚類消化系統(tǒng)發(fā)育與卵黃吸收的關系研究報道較少。關海紅等［11］認為，哲羅魚Hucho taimen與大麻哈魚Oncorhynchus keta都是通過血液循環(huán)及早期消化管進行吸收，懷頭鯰Silurus soldatoui、鯰S．asotus是通過血液循環(huán)進行吸收，只是位置上稍有不同。陳細香［12］對大鰭鳠 Mystus macropterus Bleeker肝臟、胰臟胚后發(fā)育的組織學進行了研究，根據大鰭鳠肝臟發(fā)育的形態(tài)結構、肝臟與卵黃囊的位置關系和血管聯(lián)系等特征，得出肝臟參與卵黃物質吸收與轉運的結論。本研究中發(fā)現，太平洋鱈仔魚的肝臟附著于卵黃囊上，推測太平洋鱈仔魚卵黃的吸收和轉運與肝臟有關。對太平洋鱈仔魚的形態(tài)學和組織學觀察發(fā)現，太平洋鱈在6日齡時，上下頜可張合，腸道內出現內含物。隨著日齡的增加，卵黃囊被逐漸吸收，日漸萎縮，到12日齡時卵黃囊全部消失。李艷秋等［13］對太平洋鱈仔魚卵黃囊體積進行測定，所得結果與本研究結果類似。因此，卵黃期是從初孵到5日齡，該階段主要靠卵黃囊提供營養(yǎng)，消化系統(tǒng)雖能較快分化，但不能開口攝食?；旌蠣I養(yǎng)期為6～11日齡，是仔魚由內源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)的過渡期。該期消化系統(tǒng)的結構已基本發(fā)育完全，包括口咽腔、食道、胃、腸道 (前中腸和后腸)和肛門，消化腺分化明顯。仔魚在混合營養(yǎng)期由于食性轉變，對養(yǎng)殖環(huán)境要求非?？量蹋x擇適口的餌料是提高其成活率的重要措施。12日齡后，仔魚完全進入外源性營養(yǎng)期。該過程與大西洋鱈Gadus morhua早期消化系統(tǒng)的發(fā)育過程［14］極為相似。

魚類早期發(fā)育過程中，口與肛門的形成及其與外界環(huán)境相通是仔魚即將開口攝食的重要標志。在不同魚類中，這一過程出現的時間與順序也不一致。仔魚開口時間與魚類的遺傳特性和水溫之間存在密切的關系。大西洋鱈在7℃培育水溫下，5日齡仔魚即開口攝食［15］，略早于太平洋鱈。太平洋鱈口咽腔和食道都是接收和輸送食物的腔隙管道，其上皮的結構和功能相似，均是復層扁平上皮，耐摩擦阻異物。加之上皮有較多褶皺和杯狀細胞(黏液細胞)，可起到緩沖作用并分泌黏液潤滑食物，Murray等［16］還推測杯狀細胞可能有胃前消化功能。

根據Govoni等［17］對幾種硬骨魚類脂類吸收觀察和食性轉換的分析，大多數海水硬骨魚類在仔魚階段并不存在真正意義上胃的結構。太平洋鱈也是如此，盡管在消化道分化之后，形成了兩段的結構，但是前段 (前腸和中腸)膨大的長條形管腔主要用來容納和初步消化食物，沒有觀察到類似于胃腺或杯狀細胞樣的結構。從消化道壁的組織結構來看，也不具備完整的胃結構，但腸道前段收縮和蠕動能力比后段 (后腸)球形部分要強很多。太平洋鱈早期仔魚 (9日齡)腸道由單層柱狀上皮細胞組成，缺乏固有膜和黏膜下層，肌層也僅在食道附近可以觀察到，只是完成了消化系統(tǒng)的基本構造，消化器官并未發(fā)育完全。12日齡后，腸壁黏膜層加厚，絨毛、褶皺和杯狀細胞增多，這些都具有輔助運輸、消化和吸收功能。

外分泌腺肝臟和胰腺在太平洋鱈仔魚攝食外源性食物之前就已經形成，在消化系統(tǒng)中扮演著重要角色。肝臟分泌膽汁，在膽囊濃縮后通過膽管進入前腸，將脂肪乳化為食糜顆粒。胰腺中合成未激活的酶原顆粒，可經胰管分泌進入前腸起作用。肝細胞中細胞質較均一，隨著仔魚的生長及食物的攝入，肝細胞逐漸空泡化，這是肝細胞中儲存了大量肝糖原的緣故［9，18］，并且從11日齡到25日齡，肝臟體積增大了4倍。太平洋鱈在1日齡時，在中腸前部即可觀察到胰腺，并且沿著中腸兩側向后延伸，隨著腸道旋轉，胰腺被拉長;25日齡時胰臟體積是11日齡的4倍;53日齡時胰臟體積是39日齡的6倍。1～39日齡時，胰腺為一個整體，53日齡時，胰臟呈彌散狀分布，共分8部分。隨著外分泌腺的快速發(fā)育，太平洋鱈的消化系統(tǒng)趨于完善，增強了對食物的消化和吸收，提高了太平洋鱈仔魚的適應能力。真骨魚類的肝臟一般發(fā)育較早，在太平洋鱈的初孵仔魚中就能觀察到。魚類胰腺的分布較復雜，尾崎久雄［19］將硬骨魚類胰腺分為三種類型，即緊湊型、彌散型和散布型。太平洋鱈的胰腺為緊湊型，與其兇猛的肉食性攝食習性相符。

太平洋鱈從開口到仔魚進行食性轉換，不僅消化系統(tǒng)結構發(fā)生了改變，還伴隨著相應的細胞結構、激素水平和消化酶的變化，甚至分泌消化酶所需要的細胞內生化反應也發(fā)生了一系列變化［20-21］。隨著科技的進步，對魚類消化道組織結構的研究，已從形態(tài)學解剖向顯微結構、亞顯微結構深入，從描述性研究向數量化發(fā)展。目前，可以通過RTPCR技術在大西洋鱈和黑線鱈Melanogrammus aeglefinus食性轉化時，及時檢測出細胞內相應的RNA的變化［22］，可進一步判斷仔魚消化系統(tǒng)的發(fā)育水平，從而更準確地判斷仔魚食性轉換的時機。

根據太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)的發(fā)育特征，在人工育苗過程中，可根據不同發(fā)育階段選擇適口餌料，把握好投喂時機，確保仔魚有足夠的營養(yǎng)。這樣既可以提高仔魚成活率，又可以節(jié)約育苗成本。本研究中，從形態(tài)學和組織學角度對太平洋鱈仔魚消化系統(tǒng)進行了研究，其結果對太平洋鱈的苗種培育和其營養(yǎng)飼料的選擇，都具有重要的指導意義。

［1］蘇錦祥．魚類學與海水魚類養(yǎng)殖［M］．北京:中國農業(yè)出版社，1993:194-195．

［2］Elbal M T，Garci'a Herna'ndez M P，Lozano M T，et al．Develop-ment of the digestive tract of gilthead seabream(Sparus aurata L．):light and electron microscopic studies［J］．Aquaculture，2004，234(1):215-238．

［3］Gisbert E，Piedrahita R H．Ontogenetic development of the digestive system in California halibut(Paralichthys californicus)with notes on feeding practices［J］．Aquaculture，2004，232(1/4):455-470．

［4］Santamaria C A，Marin de Mateo M，Traveset R，et al．Larval organogenesis in common dentex Dentex dentex L．(Sparidae):histological and histochemical aspects［J］．Aquaculture，2004，237(1/4):207-228．

［5］Chen B N，Qin J G，Kumar M S，et al．Ontogenetic development of the digestive system in yellowtail kingfish Seriola lalandi larvae［J］．Aquaculture，2006，256(1):489-501．

［6］Zaiss M M，Papadakis I E，Maingot E，et al．Ontogeny of the digestive tract in shi drum(Umbrina cirrosa L．)reared using the mesocosm larval rearing system［J］．Aquaculture，2006，260(1):357-368．

［7］童永．盤麗魚胚胎發(fā)育、仔魚消化道組織學及消化酶活性的研究［D］．武漢:華中農業(yè)大學，2007:1-7．

［8］方華華，王波．星斑川鰈仔稚魚消化系統(tǒng)發(fā)育的組織學研究［J］．中國農學通報，2011，27(14):50-54．

［9］陳慕雁，張秀梅．大菱鲆仔稚幼魚消化系統(tǒng)發(fā)育的組織學研究［J］．水生生物學報，2006，30(2):236-240．

［10］常青，陳四清，張秀梅，等．半滑舌鰨消化系統(tǒng)器官發(fā)生的組織學［J］．水產學報，2005，29(4):447-452．

［11］關海紅，尹家勝．魚類卵黃吸收方式及器官形成的比較［J］．華中農業(yè)大學學報，2012，31(5):641-644．

［12］陳細香．大鰭鳠肝臟、胰臟胚后發(fā)育的組織學研究［J］．泉州師范學院學報，2002，20(2):84-94．

［13］李艷秋，姜志強，孫陽，等．太平洋鱈仔魚饑餓實驗及不可逆生長點的確定［J］．生態(tài)學報，2014，34(14):3873-3878．

［14］Meeren T．Algae as first food for cod larvae，Gadus morhua L．:filter feeding or ingestion by accident［J］．Journal of Fish Biology，1991，39(2):225-237．

［15］Kj?rsvik E，Meeren T V D，Kryvi H，et al．Early development of the digestive tract of cod larvae，Gadus morhua L．，during startfeeding and starvation［J］．Journal of Fish Biology，1991，38(1):1-15．

［16］Murray H M，Wright G M，Goff G P．A study of the posterior esophagus in the winter flounder，Pleuronects americanus，and the yellowtail flounder，Pleuronects ferruginea:morphological evidence for pregastric digestion［J］．Canadian Journal of Zoology，1994，72(7):1191-1198．

［17］Govoni J J，Boehlert G W，Watanabe Y．The physiology of digestion in fish larvae［J］．Environmental Biology of Fishes，1986，16(1/3):59-77．

［18］Bisbal G A，Bengtson D A．Development of the digestive tract in larval summer flounder［J］．Journal of Fish Biology，1995，47(2):277-291．

［19］尾琦久雄．魚類消化生理:上冊［M］．上海:上海科學技術出版社，1983:304-306．

［20］Iwai T．The comparative study of the digestive tract of teleost larvae:I．fine structure of the gut epithelium in larvae of ayu［J］．Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1967，33(6):489-496．

［21］Iwai T，Tanaka M．The comparative study of the digestive tract of teleost larvae:IV．absorption of fat by the gut of halfbeak larvae［J］．Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1968，34:871-875．

［22］Perez-Casanova J C，Murray H M，Gallant J W，et al．Development of the digestive capacity in larvae of haddock(Melanogrammus aeglefinus)and Atlantic cod(Gadus morhua)［J］．Aquaculture，2006，251(2):377-401．